BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
Tiểu luận:
NUÔI CẤY
MÔ - TẾ BÀO THỰC VẬT
BỘ MÔN: SINH LÝ HỌC THỰC VẬT
GVHD : TS. PHẠM THỊ LƯƠNG HẰNG
Tp. Hà Nội, năm 2009
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1. Hoa mười giờ Portulaca granflora nở hoa trong ống nghiệm 06
Hình 2. Một số kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 07
Hình 3. Nuôi cấy phôi 08
Hình 4. Nuôi cấy mô 09
Hình 5. Mô phân sinh dinh dưỡng đang hoạt động của cây Tím Phi 09
Hình 6. Nuôi cấy bao phấn ở cây lúa 10
Hình 7. Sự nuôi cấy chuối bom (Musa acuminata) từ protoplast 11
Hình 8. Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô 13
2
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1. Thời gian tối thiểu để hấp khử trùng môi trường nuôi cấy mô ở 121
0
C (Burgerr,
1988) 19
Bảng 2. Nồng độ và thời gian sử dụng 1 số chất diệt khuẩn xử lí mô cấy thực vật 20
3
ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ rất lâu, con người đã biết nhân giống cây trồng bằng rất nhiều biện pháp.
Từ cách gieo hạt đến cách mà người ta lấy trực tiếp một nhánh cây để trồng, gọi là

gồm nhiều cơ quan có chức năng khác nhau được hình thành từ nhiều loại tế bào.
Tất cả các tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào ban đầu (tế bào hợp tử). Ở giai
đoạn đầu tế bào hợp tử phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức
năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó, các tế bào phôi sinh này tiếp tục được biến
đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô cơ quan khác nhau. Đó là sự
phân hóa. Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên
biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong điều kiện thích
hợp chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó
gọi là quá trình phản phân hóa tế bào.
6
1.2 Sơ lược các kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào
Hình 2. Một số kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
(A) Mô sẹo từ Catharanthus roseus. (B) Nuôi cấy dịch tế bào từ Coryphanta spp. (C)
Nốt sần C. roseus. (D) Đầu rễ từ C. roseus. (E)Tái sinh cây từ C. roseus callus. (F)
Protoplasts từ Coffea arabica (G) Vi nhân giống của Agave tequilana. (H) Phôi vô tính của
cây Coffea canephora. (I) Nuôi cấy rễ cây Psacalium decompositum.
1.2.1 Nuôi cấy phôi
Sự ghi nhận đầu tiên về nuôi cấy phôi là công trình của Charles Bonnet ở thế kỷ
XVIII. Ông tách phôi Phascolus và Fagopyrum trong trong đất và nhận được cây
nhưng là cây lùn. Từ đầu thế kỷ XX các công trình nuôi cấy phôi dần được hoàn
thiện hơn. Từ các công trình nghiên cứu trước đó, Knudson (1922) đã nuôi cấy
7
thành công phôi cây lan trong môi trường chứa đường và khám phá ra một điều là
nếu thiếu đường thì phôi không thể phát triển thành protocom.
Raghavan (1976, 1980) đã công bố rằng phôi phát triển qua hai giai đoạn dị
dưỡng và tự dưỡng. Ở giai đoạn dị dưỡng (tiền phôi) cần có các chất điều hoà sinh
trưởng để phát triển. Trong giai đoạn tự dưỡng sự phát triển của phôi không cần
chất điều hoà sinh trưởng.
Hình 3. Nuôi cấy phôi
Đối với nuôi cấy phôi, như đã biết đường đóng vai trò rất quan trọng. Trong

cơ quan tách rời, cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ dưới dạng acide
amine, đường và inositol. Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hoà sinh
trưởng có vai trò quan trọng hơn vì các mô tách rời không có khử năng tổng hợp
các chất này.
1.2.3 Nuôi cấy mô phân sinh
Mô phân sinh thường là các mô đỉnh chồi và cành có kích thước 0,1mm ÷ 1cm.
Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non, các chồi mới hình
thành hoặc các cành non.
Hình 5. Mô phân sinh dinh dưỡng đang hoạt động của cây Tím Phi 3 tháng tuổi
và Nụ hoa Tím Phi được nuôi cấy từ gốc cánh hoa (nách lá đài) sau 45
ngày trên môi trường MS với BA 1mg/l, IAA 0,1mg/l.
Đối với nuôi cấy mô phân sinh sự cân bằng giữa các chất điều hoà sinh trưởng
rất quan trọng. Muốn kích thích tạo chồi cần bổ sung cytokinine hoặc tổ hợp
cytokinine với auxin. Muốn tạo rễ thì bổ sung các auxin như NAA, IAA,
Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng để loại virus tạo cây sạch virus và nhân
giống in vitro. Nuôi cấy mô phân sinh còn được sử dụng để nghiên cứu quá trình
hình thành cơ quan, tạo cây đa bội qua xử lý colchicin.
9
1.2.4 Nuôi cấy bao phấn
Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn đã phát triển và hoàn thiện nhờ công trình nghiên
cứu của Bourgin và Nitsch (1967) trên cây thuốc lá, Niizeki và Oono (1968) trên
lúa. Từ cuối những năm 1970 đã nhận được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn trên
30 loại cây. Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy hạt phấn nuôi cấy có thể
phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng con
đường tạo phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tạo mô sẹo và tạo cơ quan.
Hình 6. Nuôi cấy bao phấn ở cây lúa
1.2.5Nuôi cấy tế bào đơn
Ngoài khả năng nuôi cấy các cơ quan và mô thực vật, tế bào thực vật có thể
được tách và nuôi riêng rẽ trong môi trường phù hợp. Những công trình về nuôi cấy
tế bào đơn được tiến hành từ những năm 50 của thế kỷ XX.

cây cho mẫu (cây mẹ) phải mang một hoặc nhiều đặc điểm ưu việt mà chúng ta
quan tâm: sinh trưởng tốt, cho sản lượng, chất lượng cao của quả, hạt hay cơ quan
sinh dưỡng, ít bị nhiễm bệnh, có khả năng chống chịu các điều kiện sống không
thuận lợi của môi trường (hạn, lạnh). Các mẫu thường được thu nhận vào đầu mùa
sinh trưởng, lúc sáng sớm khi toàn cây vẫn còn ở trạng thái trương nước.
Sự tái sinh của mẫu phụ thuộc vào thành phần của môi trường nuôi cấy, đặc
điểm di truyền của loài cây, trạng thái sinh lý của cây cho mẫu và đôi khi chịu ảnh
hưởng của các mùa trong năm.
2.2 Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô – tế bào
2.2.1 Các thiết bị, dụng cụ cần thiết của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô
Một phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thường bao gồm:
- Phòng rửa dụng cụ
- Phòng chuẩn bị môi trường, hấp tiệt trùng và chứa dụng cụ
- Phòng cấy vô trùng
- Phòng nuôi mẫu
- Phòng quan sát và thu nhận số liệu
Hình 8. Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô
13
Sơ đồ tổng quan như sau:
1. Phòng rửa và sản xuất nước cất.
2. Phòng sấy hấp, kho thủy tinh sạch.
3. Phòng chuẩn bị môi trường.
4. Phòng chuẩn bị mẫu.
5. Phòng cấy vô trùng.
6. Phòng ảnh.
7. Phòng kính hiển vi.
8. Phòng nuôi.
9. Phòng nuôi.
10. Phòng sinh hóa.
Bên cạnh phòng thí nghiệm cần có hệ thống nhà lưới và vườn ươm để trồng cây

Phòng cấy vô trùng nên là một phòng nhỏ, kín, sàn và tường cần được lát gạch
men hoặc sơn để lau chùi và khử trùng thường xuyên. Cửa phòng cấy nên là cửa
kính vì trong khi thao tác cấy rất dễ bị phụt đèn cồn do đó cần phải dễ liên lạc với
bên ngoài trong lúc cần thiết. Trên tường gắn đèn UV để khử trùng phòng.
1 2 3 4 5
6
78910
14
Có hai loại tủ cấy thường được sử dụng: tủ cấy tĩnh và tủ cấy thổi khí vô trùng.
Trong tủ cấy phải có đèn trắng để dễ làm việc và có đèn UV để khử trùng trước khi
làm việc
- Laminar
- Quạt thông gió
- Đèn tử ngoại treo trần hoặc treo tường
- Thiết bị lọc không khí
- Giá và bàn để môi trường
- Bộ dụng cụ cấy, đèn cồn…
Phòng nuôi mẫu cấy:
Tất cả các mẫu cấy đều được nuôi trong điều kiện nhiệt độ ánh sáng, độ ẩm, độ
dài chiếu sáng, độ thông khí thích hợp.
Phòng nuôi có nhiệt độ 15-30
0
C tùy theo mẫu cấy và mục đích của thí nghiệm.
Nhiệt độ phải được phân bố đều trong toàn phòng nuôi, phải có đầy đủ ánh sáng
huỳnh quang và có thể điều khiển được cường độ và thời gian chiếu sáng. Phòng
nuôi phải được thổi khí đồng nhất và biên độ độ ẩm được điều chỉnh từ 20-98%.
- Phòng nuôi sáng: tường nên sơn màu trắng. Các giá đèn được lắp đèn ống để chiếu
sáng. Trong phòng cần gắn các máy móc kiểm tra chính xác nhiệt độ, độ ẩm.
- Phòng nuôi tối để nuôi mô sẹo và các xử lí đặc biệt. Phòng cần tất cả các điều kiện
như phòng sáng chỉ khác là không cần lắp đèn chiếu sáng cho cây, cửa sổ cần được

phải được đặt ở vị trí ổn định, không bị rung, không khí không bị dao động nhiều.
Cân và dĩa cân phải được giữ gìn sạch sẽ. Quan trọng nhất là không được cân qúa
trọng lượng cho phép và nên sử dụng các vật đựng hóa chất có trọng lượng nhỏ
hoặc bằng giấy khi cân. Không được để hóa chất tiếp xúc trực tiếp với mặt cân.
2.2.2.2. Đong chất lỏng
Các dụng cụ thủy tinh có chia vạch (ống hút có chia độ, cốc thủy tinh có chia
vạch, ống đong) cần thiết để pha môi trường. Ống đong có thể tích 10, 20, 100 và
1000ml được sử dụng để đong những chất lỏng có thể tích lớn còn ống hút có chia
độ, bình định mức dùng để đong những thể tích cần chính xác. Đong các dung dịch
chỉ chính xác khi đáy của không khí ngang với vạch đánh dấu.
2.2.2.3. Xác định độ pH
Độ pH của môi trường cấy hầu hết được chỉnh ở 5,5 ± 0,1 trước khi hấp khử
trùng. Độ pH ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các ion trong môi trường
khoáng, khả năng đông tụ agar và sự tăng trưởng của tế bào. Vì vậy xác định chính
xác độ pH là cần thiết. Murashige và Shoog nhận thấy rằng pH 5,7 - 5,8 thích hợp
để duy trì sự hòa tan các chất khoáng trong môi trường MS. Nếu môi trường MS
được sử dụng ở dạng lỏng thì có thể chỉnh pH ở 5, môi trường cấy huyền phù có pH
thấp phần nào giảm bớt tính trạng nhiễm.
Độ pH của môi trường thường được điều chỉnh bằng NaOH hoặc HCl sau khi đã
pha xong môi trường và chuẩn bị đưa và hấp khử trùng. Có thể chỉnh pH bằng pH
kế để bàn, pH kế cầm tay hoặc giây đo pH. Thường thì nhiệt độ cao sẽ làm tăng tính
axit của môi trường. Mann và cộng sự nhận thấy rằng nếu trước khi hấp pH = 5,7
thì sau khi hấp pH = 5, Nếu muốn pH = 5,7 - 5,9 thì trước khi hấp khử trùng cần
điều chỉnh pH đến 7.
2.2.2.4. Rửa dụng cụ thủy tinh và bình nuôi cấy bằng plastic
Thông thường bình nuôi cấy sau khi sử dụng cần phải được rửa kỹ bằng xà bông
bột cho hết các chất bám trên thành chai rồi tráng lại nhiều lần bằng nước sạch cuối
cùng tráng lại bằng nước cất. Các dụng cụ thủy tinh bị quá bẩn cần phải được ngâm
trong axit HCl hoặc sulfuric sau đó rửa sạch bằng nước máy và tráng bằng nước cất.
Các bình môi trường bị nhiễm trùng trong quá trính nuôi cấy cần phải được hấp tiệt

choàng, mũ vải, khẩu trang, dao kéo Trên bàn cấy thường xuyên có một đèn cồn để
sử dụng khi cấy và một cốc đựng cồn 95% để nhúng dụng cụ làm việc
Trước khi cấy, thí nghiệm viên cần rửa tay bằng xà phòng và lau kỹ đến khuỷu
tay bằng cồn 90
0
. Để đảm bảo mức độ vô trùng cao cần có một đèn tử ngoại treo
trên trần.
Phòng cấy lớn được khử trùng tiện nhất là bằng đèn cực tím.Thời gian khử trùng
tùy theo kích thước của phòng và đèn cực tím chỉ được sử dụng khi không có
người. Phòng cũng có thể được khử trùng bằng cách lau rửa hai lần/tháng với các
dung dịch chống nấm. Phòng nhỏ hơn và tủ cấy cũng được khử trùng bằng tia cực
tím hay các dung dịch khử trùng. Tủ cấy thổi gió được khử trùng bằng cách mở
quạt gió và lau tất cả các bề mặt bằng cồn 95% trong 15 phút trước khi bắt đầu làm
việc.
Phòng nuôi cũng được khử trùng trước hết là bằng xà bông bột. Sau đó lau bằng
dung dịch hypoclorit sodium 2% hoặc bằng cồn 95%. Tất cả sàn, trần đều được lau
như vậy mỗi tuần. Cẩn thận không nên khuấy động những nơi bị nhiễm để tránh
phát tán bào tử.Cần giảm sự chuyển động của không khí trong buồng cấy đến mức
tối thiểu vì vậy tất cả các dụng cụ phục vụ việc cấy đều phải chuẩn bị đầy đủ để
trong khi cấy tránh đi lại ra vào buồng cấy nhiều lần.
2.3.2.2 Khử trùng bình cấy và các dụng cụ khác
Dụng cụ:
Dụng cụ thủy tinh dung cho nuôi cấy mô và tế bào thực vật phải là bình thủy
tinh trong suốt để ánh sáng qua được ở mức tối đa và trung tính để tránh kiềm từ
bình thủy tinh gây ảnh hưởng đến sự phát triển của mô nuôi cấy.
Cần rửa sạch dụng cụ thủy tinh trước khi đưa vào sử dụng. Thông thường chỉ
cần xử lí bằng sulfochromate một lần đầu khi đưa vào sử dụng về sau chỉ cần rửa
sạch bằng xà phòng, tráng nhiều lần bằng nước máy cuối cùng tráng bằng nước cất.
Sau khi để ráo nước dụng cụ thủy tinh cần được vô trùng bằng cách sấy ở
160

nhất là các thí nghiệm nuôi cấy trong thời gian dài.
+Thao tác làm nút bông chậm, không thuận tiện khi nuôi cấy trên qui mô lớn.
+ Chỉ dùng được một vài lần sau phải bỏ.
Hiện nay người ta sử dụng nhiều loại nắp đậy khác nhau để thay thế nút bong.
Các hãng sản xuất dụng cụ nuôi cấy mô cung cấp loại nắp ống nghiệm và bình tam
giác bằng nhựa chịu nhiệt có thể hấp ở 120
0
C mà không bị biến dạng. Một số phòng
thí nghiệm sử dụng nắp inox hoặc cao su rất thuận tiện cho việc vôt trùng.
Các dung dịch mẹ dùng để pha chế môi trường (dung dịch muôi khoáng,
vitamin ) cần được bảo quản trong tủ lạnh. Dung dịch vitamin nên chia thành nhiều
loại nhỏ và bảo quản trong ngăn đá của tủ lạnh. Không nên pha một lượng quá lớn
dung dịch mẹ các chất sinh trưởng, thường chỉ nên dùng các lọ có dung tích 100-
200 ml.
Khử trùng môi trường khoáng:
Để khử trùng môi trường khoáng thường sử dụng hai phương pháp hấp tiệt trùng
và lọc bằng màng lọc vô trùng. Môi trường nuôi cấy, nước cất và các hóa chất ổn
định khác có thể chứa trong bình thủy tinh và đậy bằng nút gòn, giấy nhôm hoặc
nắp nhựa. Tuy nhiên môi trường có các chất không bền nhiệt thì cần sử dụng phin
lọc milipore. Nói chung môi trường khoáng được hấp tiệt trùng ở 121
0
C, 1 atm. Với
những thể tích nhỏ (100 ml hoặc ít hơn) thời gian khử trùng là15-20 phút. Với
lượng môi trường lớn thì phải khử trùng trong 30-40 phút. Áp suất không nên cao
quá 1 atm vài áp suất cao sẽ làm phân hủy carbohydrate và các phức hợp nhạy cảm
với nhiệt độ
18
Bảng 2.1 . Thời gian tối thiểu để hấp khử trùng môi trường
nuôi cấy mô ở 121
0

đặt vào môi trường có chứa một lượng chất sinh trưởng thích hợp đều có khả năng
tạo mô sẹo cao. Để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, trước
tiên người ta chú y đến chồi nách và mô phân sinh ngọn.Các mô thực vật thường
được sử dụng để nuôi cấy là:
- Đỉnh sinh trưởng thân, rễ
- Chồi bên
- Tượng tầng
- Vảy củ
- Chồi ngọn
- Nhu mô lá, nhu mô vỏ thân
- Chồi nảy từ củ
Cần biết là tuy mang một lượng thông tin di truyền như nhau, các mô khác nhau
trên cùng một cây có thể cho các mô sẹo phát triển khác nhau với khả năng tái sinh
chồi, rễ hay cây hoàn chỉnh rất khác nhau. Vì vậy khi khởi đầu chọn giống, nhân
giống một cây cụ thể trước hết cần tìm hiểu phản ứng của các bộ phận khác nhau
của cây trong nuôi cấy ở các nồng độ chất sinh trưởng khác nhau.
Khử trùng mẫu cấy là việc làm khó vì mẫu sống không thể khử bằng nhiệt độ
cao mà phải giữ được bản chất sinh học của nó. Do đó mẫu cấy thực vật phải được
19
khử trùng bằng các dung dịch khử trùng. Các dung dịch khử trùng thường dùng là
hypoclorit calcium, hypoclorit sodium, chlorua thủy ngân, oxi già… Tỉ lệ vô trùng
thành công phụ thuộc thời gian khử trùng và nồng độ các chất khử trùng và khả
năng xâm nhập của chúng vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả
năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy. Các dung dịch dùng để khử
trùng mẫu phải bảo vệ được mô thực vật nhưng thời gian khử trùng phải đủ để tiêu
diệt nguồn gây nhiễm là nấm và vi khuẩn.
Các mẫu cấy khi chọn lựa phải được rửa trước bằng xà phòng dưới dòng nước
chảy rồi mới cho vào ngâm trong dung dịch khử trùng
Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường
người ta xử lí mô nuôi cấy trong cồn 70% trong 30 giây, sau đó mới xử lí trong

cấy các bình cấy đã bị nhiễm vì bào tử có thể phát tán trong tủ cấy.
2.4 Môi trường
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát triển hình
thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường nuôi
cấy. Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài
20
và bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí
nghiệm thì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của
mẫu cấy.
Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một
số thành phần cơ bản sau:
- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng.
- Các vitamin.
- Các amino axít.
- Nguồn cac bon: một số các loại đường.
- Các chất điều hoà sinh trưởng.
- Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây, bột
chuối khô
- Chất làm thay đổi trạng thái môi truờng: các loại thạch (agar).
Tất cả các hợp chất này đều tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong sự
sinh trưởng và phân hoá của thực vật nuôi cấy in vitro.
Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trưng phụ thuộc
vào một số yếu tố:
- Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về thành
phần môi trường.
- Mục đích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo mô sẹo
phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế bào, vi nhân
giống…)
- Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng…).
2.4.1 Các muối khoáng

vì thế cần thiết phải bổ sung nguồn carbon bên ngoài để cung cấp năng lượng.
Thậm chí các mô bắt đầu lục hóa hoặc hình thành diệp lục tố dưới các điều kiện đặc
biệt trong suốt quá trình nuôi cấy đã không tự dưỡng carbon. Việc bổ sung nguồn
carbon bên ngoài vào môi trường làm tăng phân chia tế bào và tái sinh các chồi
xanh.
Sự thủy phân từng phần sucrose xuất hiện khi môi trường được khử trùng. Các
tế bào và mô nuôi cấy đã sinh trưởng trên môi trường có sucrose được khử trùng
bằng autoclave tốt hơn trên môi trường có sucrose được khử trùng bằng màng lọc
(filter). Điều này cho thấy các tế bào thích hợp với nguồn dự trữ có sẵn của glucose
và fructose do thủy phân sucrose khi khử trùng bằng autoclave. Sử dụng fructose
được khử trùng bằng autoclave không được đề cập đến vì nó có thể gây bất lợi cho
sinh trưởng của mô.
Nitơ (N)
Thành phần chính của hầu hết các môi trường là nitơ vô cơ dưới dạng nitrat
(NO
3
-
) hoặc amonium (NH
4
+
). Các muối được dùng phổ biến là kali nitrat (KNO
3
),
nitrat amon (NH
4
NO
3
) và canxi nitrat (Ca(NO
3
)

4
NO
3
. Trong một
số ít trường hợp có thể cung cấp dưới dạng urea. Tổng nồng độ của NO
3
+
và NH
4
+
trong môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy và mục đích nghiên
cứu.
Phospho (P):
Photpho là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật. Nó tham gia vào việc
vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nuclêic và tham gia cấu trúc của
màng.
Trong môi trường nuôi cấy, Photpho được cung cấp dưới dạng mono hay
dihydrogenphosphate potasium hay sodium. Ion photphate hóa trị 1 và 2 có thể
chuyển đổi lẫn nhau tùy theo pH. Ion H
2
PO
4
-
chiếm ưu thế ở pH nhỏ hơn 7, đây là
22
đặc tính của hầu hết môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật cũng là ion dễ được
thực vật hấp thụ nhất. Photpho thường được cung cấp dưới dạng photphate hòa tan
hạn chế.
Nồng độ photphate hòa tan cao trong môi trường sẽ làm giảm sự tăng trưởng
của mô, có thể do calcium và một số nguyên tố vi lượng bị kết tủa trong môi

K
+
được cung cấp dưới dạng muối KNO
3
,
KCl. 6H
2
O, KH
2
PO
4
Canxi (Ca)
Calcium cũng là một cation chủ yếu giúp cân bằng các anion trong cây nhưng
cách thức không giống như K
+
và Mg
+
vì Ca
2+
không phải là ion linh động. Calciun
có thể liên kết các phân tử sinh học lại với nhau do đó nó góp phần vào trong cấu
trúc và hoạt động sinh lí của màng tế bào và ở phiến giữa của thành tế bào . Sự hoạt
động của nhiều enzim khác của thực vật cũng phụ thuộc vào Ca
2+
vì calcium là
đồng yếu tố với những enzim phân giải ATP.
Trong nuôi cấy tế bào, Ca
2+
có vai trò trong sự phát sinh hình thái đồng thời với
sự cảm ứng của các chất điều hòa sinh trưởng đặc biệt là auxin và cytokinin.

µmol/L, Mn là 20-90 µmol/L và B là 2-5100 µmol/L được bổ sung vào môi trường
nuôi cấy tùy thuộc vào yêu cầu của từng thí nghiệm.
Việc chia thành các nguyên tố vi lượng và đa lượng chủ yếu dựa trên nhu
cầu của thực vật đối với các chất này. Nhu cầu của thực vật đối với các nguyên tố
đa lượng là lớn hơn, với nồng độ > 0.5 mM. Các nguyên tố vi lượng được sử dụng
trong môi trường ở nồng độ < 0.5 mM.
Nhu cầu của cây đối với nguyên tố vi lượng là rất thấp. Do vậy những nguyên tố
này cũng có mặt trong môi trường ở các nồng độ tương ứng. Hầu hết các nguyên tố
vi lượng sử dụng ở lượng nmol. Một số nguyên tố vi lượng có nhu cầu nhỏ hơn có
thể thay thế dễ dàng bằng sự lẫn tạp ngẫu nhiên của chúng trong các thành phần của
môi trường như agar, các chất bổ sung như nước dừa, dịch chiết nấm men (yeast
extract), các muối và nước. Tầm quan trọng của một số nguyên tố vi lượng trong
thành phần môi trường còn chưa được hiểu một cách rõ ràng. Co, Al, Ni có thể có
lợi đối với thực vật nhưng cũng có thể là không cần thiết. Trong thực tế, hầu hết các
nguyên tố vi lượng chỉ có phần khoáng của muối (cation) là quan trọng, còn vai trò
các anion có thể là không cần thiết. Ion SO
4
2-
dư thừa trong môi trường và chủ yếu
phát sinh từ các muối MgSO
4
, K
2
SO
4
Nhu cầu của thực vật đối với các nguyên tố đa lượng lớn hơn. Nguyên tố đa
lượng có nồng độ cao nhất trong các môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật.
Nhìn chung cả phần anion và cation của các nguyên tố đa lượng đều quan trọng đối
với tế bào thực vật. Ví dụ như KNO
3

thực vật ở nồng độ 50-5000 mg/l.
Các vitamin khác như biotin, acid folic, acid ascorbic, panthothenic acid,
vitamin E (tocopherol), riboflavin và p-aminobenzoic acid cũng được sử dụng
trong một số môi trường nuôi cấy. Nhu cầu vitamin trong môi trường nuôi cấy nói
chung không quan trọng và chúng cũng không cản trở sự tăng trưởng của tế bào.
Nói chung các vitamin này được thêm vào môi trường chỉ khi nồng độ thiamin thấp
hơn nhu cầu cần thiết hoặc để cho huyền phù tế bào có thể tăng trưởng khi mật độ
tế bào khởi đầu thấp.
2.4.3 Các chất bổ sung vào môi trường cấy mô
Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác
Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các amino acid cần thiết nhưng sự bổ
sung các amino acid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của tế
bào. Việc sử dụng amino acid đặc biệt quan trọng trong môi trường nuôi cấy tế bào
và nuôi cấy tế bào trần. Amino acid cung cấp cho tế bào thực vật nguồn amino acid
sẵn sang cho nhu cầu của tế bào và nguồn nitrogen này được tế bào hấp thu nhanh
hơn nitrogen vô cơ.
Các nguồn nitrogen hữu cơ thường sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế bào
thực vật là hỗn hợp amino acid như casein hydrolysate, L-glutamine, L-asparagine
và adenine. Casein hydrolysate nói chung được sử dụng với nồng độ 0,05-0,1%.
Khi amino acid được cung cấp riêng rẽ thì cần phải cẩn thận vì nó có thể cản trở sự
tăng trưởng của tế bào.
Các mô được nuôi cấy vẫn có khả năng tổng hợp các amino acid cần thiết cho các
quá trình trao đổi chất khác nhau. Mặc dù thế, việc bổ sung các amino acid vào môi
trường vẫn cần thiết để kích thích sinh trưởng tế bào trong nuôi cấy protoplast và để
hình thành các dòng tế bào. Không giống như các N vô cơ, các amino acid được các tế
bào thực vật hấp thụ nhanh hơn. Casein hydrolysate (0,05-0,1%), L-glutamine (8
mmol/L)… Các amino acid được bổ sung riêng lẻ thường hạn chế sự sinh trưởng của
tế bào trong khi hỗn hợp của chúng lại có hiệu quả hơn. Bổ sung vào môi trường
adenine sulphate có thể kích thích sinh trưởng của tế bào hoặc làm tăng khả năng tạo
chồi.