1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
F  G
VACCINE PHÒNG BỆNH DO VI KHUẨN
Leptospira
Giáo viên giảng dạy: PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên: Trần Nam Trung
Lớp: DH06SH
MSSV: 06126172
2


3


II. Tổng Quan

1. Leptopira

1.1 Lịch sử phát hiện bệnh
Bệnh do Leptospira interrogans gây ra được phát hiện đầu tiên vào năm 1850
trên chó tại Stuttgart (Đức). Năm 1886, Adolf Weil ở Heidelberg (Đức) đã mô tả dấu
hiệu lâm sàng của bệnh này là sốt phát ban, sưng mật, đặc biệt bệnh xuất hiện đột ngột
kèm theo sốt, lách to, vàng da và viêm thận.
Năm 1916, người ta đã phát hiện ra L. Icterohaemorrhagiae là một serovar của
Leptospira interrogans gây bệnh Weil ở Nhật Bản. Inada và cộng sự (1918) đã phát
hiện serovar L. Hebdomadis gây sốt 7 ngày ở Nhật Bản và ông cũng thấy chủng L.
Autumnalis gây sốt mùa thu ở Nhật Bản vào năm 1925. Theo Blood (1989), bò ở Úc
và Anh nhiễm chủ yếu là L. Hardjo và serovar này cũng là nguyên nhân chính gây sẩy
thai ở bò (Ellis, 1982). Những nghiên cứu tiếp theo đã tìm thấy hàng loạt các serovars

genomospecies 5. Trong số đó, người ta phân ra thành các loài gây bệnh, không gây
bệnh và loài trung gian Các loài gây bệnh
Leptospira interrogans
Leptospira kirschneri
Leptospira noguchii
Leptospira alexanderi
Leptospira weilii
Leptospira genomospecies 1
Leptospira borgpetersenii
Leptospira santarosai
Leptospira kmetyi
Các loài trung gian
Leptospira inadai
Leptospira fainei
Leptospira broomii
Leptospira licerasiae
Leptospira wolffii
Các loài không gây bệnh
Leptospira biflexa
Leptospira meyeri
Leptospira wolbachii
Leptospira genomospecies 3
Leptospira genomospecies 4
Leptospira genomospecies 5

Đặc điểm sinh vật học
5

L. ictero- haemorrhagiae L. ponoma
L. mitis L. saxkoebing

6

L. poi L. sejroe

1.3 Cách sinh bệnh
Cơ chế phát bệnh của Leptospira interrogans không được biết tường tận do sự
phong phú về các serovars gây bệnh.

Thông thường xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh cho động vật sau khi vào cơ
thể, chúng xâm nhập vào máu và nhân lên nhanh chóng tại đây. Sau 1-2 ngày có khi
đến 1 tuần, xoắn khuẩn gây hiện tượng nhiễm trùng huyết. Trong giai đoạn này, có thể
phân lập Leptospira trong máu và hầu hết các phủ tạng cũng như trong dịch não tủy.
Pha nhiễm trùng huy
ết sẽ chấm dứt cùng với sự xuất hiện kháng thể kháng Leptospira
trong máu. Các kháng thể này được phát hiện sau 5-10 ngày và đạt mức tối đa khoảng
3 tuần sau đó. Hiệu giá kháng thể thường đạt từ 1/1.000 đến 1/100.000 (với thử
nghiệm MAT) sau đó giảm dần. Sau giai đoạn nhiễm trùng huyết, Leptospira có thể
định vị ở ống lượn gần của thận. Tại đây, chúng nhân lên và bài tiết vào nước tiểu.
Tùy thuộc vào từng con vật mắc bệnh và từng serovars gây nhiễm và thời gian mà
cường độ bài trùng qua nước tiểu có thể thay đổi.

Ngoài ra, Leptospira còn sinh độc tố phá hủy hồng cầu, phá hủy thành mao
mạch, gây vỡ hoặc tắc nghẽn mao mạch dẫn đến hoại tử và xuất huyết ở niêm mạc.


- Thể này tương ứng với sự phát triển hội chứng sinh urea huyế
t hậu quả của
viêm thận mà một trong những biểu hiện là chứng tiểu nhiều, chứng khát nước rất
nhiều cùng với ói mửa và tiêu chảy. Sau một thời gian hôn mê do urea huyết chó sẽ
chết.
- Thể thở khó có mùi urea ở miệng và xáo trộn hô hấp –viêm màng móng mắt, viêm
cơ….
1.5 Bệnh tích

1.5.1 Thể cấp tính

- Thể thương hàn:
+ Viêm dạ dày ruột xuất huyết.
8

+ Xuất huyết da và các niêm mạc.
+ Có thể gặp gan sưng, hạch bạch huyết xuất huyết
- Thể hoàng đản:
+ Da vàng ở bụng, gang bàn chân, lỡ tai.
+ Niêm mạc vàng.
+ Bàng quang chứa nhiều nước tiểu vàng sậm và có thể xuất huyết.

1.5.2 Thể bán, mãn tính

- Viêm thận kẻ hay viêm thận mãn tính.
- Vết lở ở miệng và lưỡi có thể gặp trên chó có urea trong máu.

1.6 Tính miễn dịch

Tính miễn dịch được hình thành vào giai đoạn 2 của bệnh do Leptospira gây

- Bệnh do Leptospira gây hoàng đản xuất huyết
Biểu hiện hoàng đản xuất huyết thường thấy nhất ở người bị bệnh do
Leptospira gây ra. Bệnh phát triển có tính chu kỳ. Thời kỳ ủ bệnh 7-12 ngày. Bệnh
khởi phát đột ngột, đầu tiên người bệnh sốt cao 39-40
o
C kèm theo biểu hiện ớn lạnh và
suy yếu.

Biểu hiện hoàng đản chia thành 4 pha:
+ Pha tiền hoàng đản: người bệnh thường bị bại huyết kéo dài trong 4-5 ngày.
Nhiệt độ lên cao, đau cơ và xáo trộn vận mạch, đôi khi nổi những vết đỏ sần, hội
chứng màng não như ói mửa, cứng cơ vòng ót, đau đầu.
+ Pha hoàng đản: bệnh nhân bị hoàng đản là do Leptospira tác động lên gan,
thận. Hoàng đản xuất hi
ện vào ngày thứ 5 và kéo dài trong 2-3 ngày. Hoàng đản quan
sát được trên niêm mạc. Đi tiểu nhiều và có albimine trong nước tiểu. Ure trong máu
tăng hơn 3 g/l, sau đó dần trở nên bình thường. Đôi khi có xuất huyết (chảy máu cam,
xuất huyết đường tiêu hóa…).
+ Pha hình thành miễn dịch: ở pha này các kháng thể bắt đầu xuất hiện trong
máu của bệnh nhân thường vào ngày thứ 10 của bệnh và những biểu hiện triệu chứng
giảm dần.
+ Pha sốt hồi quy: thường đến ngày bị bệnh thứ 15, bệnh nhân bắt đầu sốt trở
lại sau vài ngày không sốt. Nhiệt độ cơ thể tăng đến 39-40
o
C, kéo dài 5-8 ngày nhưng
hội chứng màng não, hoàng đản và yếu thận có thể giảm. Mức độ nặng nhẹ của hoàng
đản cho phép xác định bệnh nặng hay nhẹ. Hoàng đản trầm trọng thường đi kèm với
viêm gan, viêm thận cấp tính, vô niệu (không có nước tiểu trong bàng quang), xuất
10



2.1 Vaccine protein tái tổ hợp
Vaccine protein tái tổ hợp là loại vaccine có tiềm năng lớn trong phòng bệnh
do Leptospira. Nó được xây dựng với phương pháp công nghệ sinh học hiện đại.

Những đặc trưng bảo vệ của vaccine omp tái tổ hợp đã được kiểm nghiệm, nó
gồm: protein ngoại màng (ompL1), lipoprotein (lipL41), protein immunoglobin.
Những đoạn DNA bộ gen mã hóa những protein ngoại màng sẽ được cắt bởi enzyme
XhoI và XbaI, sau những DNA này sẽ được để dùng làm khuôn để khuếch đại đoạn
gen mã hóa omp nhờ PCR. Sau khi được khuếch đại những đoạn đó gen đó sẽ được
chèn vào vector (E.coli) để tổng hợp ra omp. Sau đó tách chiết những omp để tạo
vaccine.

2.2 Vaccine LPS
Những kết quả phân tích về LPSs đã mở ra 1 hướng mới phát triển cho
vaccine. Quá trình tổng hợp LPS của Leptospira tương tự như các vi khuẩn Gram âm
(-). Những LPS của Leptospira kích hoạt các đại thực bào thông qua CD14 và Toll-
like receptor 2 (TLR2). Vaccine LPS không đặc hiệu cho từng dòng serovar độc lập, ví
dụ như vaccine từ L bilexa serovar Patoc có thể chống lại L. interrogans serovar
Manilae, hiệu quả bảo vệ của loại vaccine này phụ thuộc vào liều tiêm và thời gian
tiêm bao lâu. Nhưng vaccine cũng được xem như
1 vaccine đặc hiệu cho từng serovar,
ví dụ vaccine từ 1 vài dòng serovar khác nhau không thể tạo đáp ứng miễn dịch đối
với 1 vài dòng serovar khác. Như vậy cần phải nghiên cứu để xác định về tính đặc hiệu
hay không đặc hiệu của vaccine LPS. Nếu vaccine LPS này không đặc hiệu đối với
con người và các động vật khác nhau thì có thể tạo ra 1 loại vaccine có hiệu quả và
đơn giản hơn.
12



Dung dịch được mang đem đi đánh sóng âm 20 kHz trong nước đá khoảng 5 phút. Thu
nhận được lượng protein thuần nhất. Lượng protein này được sử dụng để xác định
chuẩn kháng thể huyết thanh của chuột đã được miễn dịch thông qua phương pháp
ELISA gián tiếp.

2. Chuẩn bị DNA bộ gen của Leptospira

DNA bộ gen được trích từ toàn bộ những tế bào của L.interrogans, serogroup
Icterohaemorrhagiae, serovar Copenhageni đã được thu nhận ở phase log của quá
trình nuôi cấy. Tế bào vi khuẩn được rửa sạch như các bước ở trên và phần tế bào thu
được từ ly tâm lần cuối (ly tâm 3 lần như ở trên) sẽ chuyển vào buffer TE (10 mM
Tris-HCl, pH = 8 và 1 mM EDTA). Phần chuẩn bị đó được cho thêm vào buffer lysis
13

chứa 10% SDS, 3 ul của 20 ul/ml proteinase-K, 5 ul của 20 mg/ml RNase A và được ủ
ở 30oC trong 1 tiếng. Sau đó thêm vào 5 M sodium chloride và
cetyltrimethylammonium bromide (CTAP) ngay lập tức. Cho 1 thể tích đúng bằng thể
tích trên của phenol-chloroform-isoamyl để tạo hỗn hợp. Phần chuẩn bị được ly tâm ở
12000 v/p , 25
o
C trong 5 phút. Phần dung dịch bên trên được chuyển sang 1 ống mới,
isopropanol được thêm vào để kết tủa DNA. Rửa phần kết tủa thu được sau khi ly tâm
bằng ethanol 70% và sấy khô. DNA đã sấy khô sẽ hòa tan vào buffer TE. Chất lượng
của phần chuẩn bị được đánh giá thông qua khuếch đại PCR đoạn gen 16S RNA (sử
dụng 2 primer oligonucleotide, primer forward: 5’-GGCGGCGCGTCTAAACATG-3’
và primer reverse: 5’-TTCCCCCCATTGAGCAAG-3’ được tạo ra từ chuỗi 16S
rDNA của L.interrogans, serovar Canicola dòng Moulton. PCR amplicon được thu
nhận để điện di trên gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide và được nhận diện dưới
tia UV (Biodoc-ITTM Imaging System, UVP Transilluminator, Cambridge, UK).
DNA chất lượng tốt được thu nhận và phần chuẩn bị sau đó được sử dụng làm khuôn

ampicillin (50 ug/ml). Sau đó đem đi nuôi cấy lắc ở 37
o
C trong 18 tiếng. Thu nhận
những tế bào sau khi đã nuôi cấy bằng cách ly tâm 4000 v/p ở 25
o
c trong 5 phút.
Những plasmids được tách chiết từ những tế bào bằng phương pháp alkaline lysis tiêu
chuẩn và được cắt bằng endonucleases XhoI và XhaI. Những phần plasmid đã được cắt
sẽ điện di trên gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide và được nhận diện dưới tia
UV. Những dòng E.coli có mang ompLI-plasmid tái tổ hợp sẽ được chọn lọc để tiếp
tục sử dụng.

5. Chuẩn bị vaccine ompLI-plasmid
Đoạn ompLI được tạo dòng phụ trong vector pcDNA3.1(+) (Invitrogen,
Carlsbad, California, USA). Nói tóm lại, những plasmid ompLI-pGEM-T được tách
chiết từ những tế bào E.coli JM109 chuyển gen, sau đó được cắt bằng enzyme
endonucleasea và được nhận diện bằng điện di trên gel agarose 1%. Những đoạn DNA
mang ompLI được tin sạch từ mảng gel đã được cắt tại vị trí xác định bằng cách sử
dụng bộ kit GENECLEAN-II (Bio101, LA, USA) và được gắn kết vào pcDNA3.1(+)
tương ứng nhờ enzyme ligase T4 DNA. Những plasmid tái tổ hợp được đưa vào E.coli
Top10 nhờ phương pháp hóa biến nạp. Những tế bào mang plasmid tái tổ hợp này sẽ
được nuôi chọn lọc trên môi trường agar LB-ampicillin.

Về việc chuẩn bị DNA plasmid-ompLI, dòng đơn của E.coli Top10 mang
plasmid tái tổ hợp được cho tăng trưởn qua đêm trên môi trường agar LB-ampicillin sẽ
được cho vào 500 ml môi trường nước thịt có LB-ampicillin đựng trong bình 2 lít và
được ủ ở 37
o
C, lắc ở 200 rpm trong 18 tiếng. Những tế bào thu sẽ được thu nhận thông
qua ly tâm 4000 v/p ở 25

enzyme DNase. DNA được tổng hợp từ RNA tổng số thông qua bộ kit tổng hợp cDNA
(Invitrogen). Những cDNA này sẽ được sử dụng làm khuôn trong PCR cho việc
khuếch đại ompLI thông qua 2 primer forward và reverse như trên.

Nhưng vì đây chỉ là loại vaccine đang được nghiên cứu, chưa thật sự đem vào
thực tế sự dụng. Kết quả thử nghiệm trên chuột lông vàng Syrian:

Hai mươi bốn con chuột cái lông vàng Syrian, 4 tuần tuổi, được đem ra thử
nghiệm. Lấy mẫu máu để thu mẫu huyết thanh trước khi tiêm ngừa vaccine (ngày 0).
Những con chuột được chia thành 4 nhóm, mỗi nhóm 6 con. Mỗi con chuột của nhóm
1 được chủng ngừa vaccine vào cơ với liều lượng 100 ug ompLI-pcDNA3.1(+) trong
100 ul PBS trong khi mỗi con chuột trong nhóm 2 thì được tiêm pcDNA(+) với liều
lượng giống nhóm 1, tức là miễn dịch giả. Nhóm 3 và 4 thì được tiêm với 100 ul PBS.
Quá trình tiêm được nhắc lại lần 2 vào 2 tuần sau đó với cách tiêm và liều lượng như
lần 1. Lấy mẫu máu để thu mẫu huyết thanh ở từng con chuột vào ngày 7, 14, 28, 42
sau lần tiêm đầu tiên. Những con chuột từ nhóm 1-3 được tiêm vào màng bụng với 10
LD50 (1000 tế bào) của L.interrogans, serogroup Pomona, serovar Pomona vào ngày
thứ 49. Vì vậy, những con chuột nhóm 3 chắc chắn nhiễm leptospirosis trong khi
những con chuột nhóm 4 hoàn toàn không nhiễm. Tất cả những con chuột được cho
nuôi lại trong chuồng với thức ăn viên và nước ad libitum. Chúng được theo dõi tình
trạng bệnh mỗi ngày (nhiệt độ trực tràng, trọng lượng cơ thể, lượng nước và thức ăn đã
tiêu thụ), và sự tử vong kéo dài đến khi thử nghiệm kết thúc vào ngày thứ 21 sau khi
tiêm Leptospira (ngày 70 từ lần tiêm thứ 1).
Tim, phổi, gan, lá lách và thận được thu nhận từ những con chuột đã chết trong
ngày thứ 21 sau khi tiêm Leptospira và từ những con chuột sống sót sau cuộc thí
nghiệm. Tất cả các mô được nuôi cấy trong môi trường dung dịch EMJH có bổ sung 5-
fluorouracil và ủ ở 30
o
C cho việc phục hồi sự sống cho Leptospira.
Kết quả đạt được từ thử nghiệm:

3. Hiệu quả bảo vệ của vaccine trong chuột
17


Những con chuột trong tất cả các nhóm
không biểu hiện dấu hiệu giảm sức sống nào sau
khi được miễn dịch. Vaccine [100 ug của
plasmid ompLI-pcDNA3.1(+)] và giả vaccine
[pcDNA3.1(+)] được tiêm cho những con chuột
của nhóm 1 và 2. Sau khi tiêm Leptospira cho
các con chuột từ nhóm 1-3, tất cả con chuột đều
có biểu hiện giảm sức sống, tức là lượng tiêu thụ
thức ăn và nước uống giảm và trọng lượng giảm.
Tuy nhiên, những con chuột nhóm 1 không phát
sốt trong khi những con chuột nhóm 2 và 3 thì
nhiệt độ trực tràng tăng, 37,74 +_ 0,35
o
C (nhóm
1) và 37,81 +_ 0,41
o
C (nhóm 2) [biên độ nhiệt
trực tràng thông thường của chuột là 36,2 đến
37,5
o
C]. Những con chuột nhóm 4 sức khỏe bình
thường trong suốt quá trình thử nghiệm.

Tất cả những con chuột nhóm 4 (không
tiêm Leptospira) sống sót đến cuối đợt thử
nghiệm (ngày thứ 70). Tỷ lệ sống của chuột

European Pharmacopoeia, Inactivated, 10.
19

Asian Pacific Journal of Allergy and Immunology, DNA Vaccine for Leptospirosis,
2007, 11 – 18.