1


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
[\
BÀI BÁO CÁO
ĐÊ TÀI 09
: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ELISA CHẨN ĐOÁN BỆNH DỊCH TẢ
HEO

Giáo viên hướng dẫn : Sinh viên thực hiện:
TS.NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN XUÂN KHÁNH
Lớp: DH06SH
MSSV: 06126055

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 10/2009

2

Phụ lục:
I.Đặt vấn đề 3
I.1. Đặt vấn đề 3

Nghành chăn nuôi hiện nay đóng vai trò rất quan trọng trong việc
cung cấp thực phẩm cho nhu cầu trong nước và xuất khẩu.
Bên cạnh những thành công trong chăn nuôi, sự hiện diện của một
số dịch bệnh vẫn thường xuyên gây tổn thất đáng kể trong nghành
chăn nuôi. Một trong những yếu tố nguy cơ phải kể đến là bệnh d
ịch tả
heo. Bệnh xuất hiện trong cả nước, xảy ra tương đối nghiêm trọng ở
nhiều tỉnh thành phía nam. Bệnh có tốc độ lây lan nhanh, xảy ra ở mọi
lứa tuổi ở heo, trên gia súc non, tỷ lệ chết có thể lên tới 100%. Heo nái
mang trứng tạo cảm nhiễm qua nhau thai, gây chết phôi, sẩy thai… Vì
vậy, tổ chức dịch tể thế giới xếp bệnh này thuộc bảng A, là bảng danh
mục các bệ
nh nguy hiểm nhất.
Xuất phát từ tình hình trên, nên việc nghiên cứu các phương pháp
phát hiện bệnh là yêu cầu cấp thiết để phòng chống bệnh, giảm tổn
thất trong chăn nuôi, giữ cho đàn heo mắc bệnh ở tỷ lệ thấp nhất. Có
nhiều phương pháp phát hiện bệnh đã được nghiên cứu, trong bài này
tôi sẽ trình bày về phương pháp ELISA gián tiếp để phát hiện virus
dịch tả heo.
I.2. Mục tiêu:
Sử d
ụng bộ kit Elisa để phát hiện bệnh dich tả heo sớm.
4


Ổn định ở PH 5-10, ngoài khoảng PH này thì virus bị phá hủy
nhanh.
Những chất tan lipid như ether, chloroform và deoxycholate làm
bất hoạt virus nhanh.
5
II.1.2.Tính chất kháng nguyên
Kháng thể kháng virus dịch tả heo có thể phát hiện bằng kỹ thuật
huyết thanh học khác nhau như phản ứng trung hòa, kết tủa khuếch
tán trên thạch, kết hợp bổ thể, miễn dịch huỳnh quang, ngưng kết
hồng cầu thụ động.
Chỉ có một typ kháng nguyên dịch tả heo, tuy nhiên, những nghiên
cứu định lượng bằng phản ứng trung hòa huyết thanhcho phép phân
biệt hai nhóm phụ
vì huyết thanh:
Nhóm phụ A: bao gồm những chủng cường độ chủng độc lực thấp,
chủng biến đổi.
Nhóm phụ B: chủng độc lực thấp gây xáo trộn sinh sản.
II.1.3. Tính sinh miễn dịch
Miễn dịch xuất hiện trên heo khỏi bệnh dịch tả heo thì dài và chắc
chắn. Tuy nhiên, những chủng virus dịch tả heo mãn tính hay cận lâm
sàng có tính sinh miễn dịch yếu.
Tính sinh miễn dịch cũng truyền cho heo con (qua s
ữa đầu) của
những heo nái khỏi bệnh, tính miễn dịch này duy trì khoảng 6 tuần lễ.
II.2.Nguyên lý sử dụng bộ Kit Elisa:
Dưa trên nguyên tắc kết hơp đặc hiệu giữa kháng nguyên và
kháng thể.

• Dụng cụ
Các dụng cụ để tiến hành thí nghiệm bao gồm:
ống nghiệm,
eppendorf các loại, pipet, đầu tip, lọ thủy tinh đựng hóa chất,
đầu lọc hóa chất, thùng đựng nước đá, bình tam giác, bộ kit
SERELISA® HCV Ag
• Các thiết bị, máy móc
9 Bồn ổn nhiệt
9 Máy li tâm
9 Tủ lạnh
9 Máy đo OD
9 Tủ sấy dụng cụ
• Thành phần của kit:
9 Conjugate: là phức hợp kháng huyết thanh dê kháng
kháng thể thỏ có gắn enzyme peroxidase, (nồng độ 10X).

9 Kháng huyế
t thanh thỏ kháng HCV [p125] nồng độ 10X
( anti-HCV [p125] rabbit antiserum- AS )
9 Dung dịch cơ chất peroxidase (Buffered peroxidase
substrate (PS) ).
9 Đối chứng âm ( Negative control (N)).
7

9 Đối chứng dương ( Positive control (P)).
9 Mẫu máu pha loãng (Blood sample diluent (SD)).
9 Dung dịch rửa (W) (10X nồng độ).
9 Conjugate và kháng huyết thanh pha loãng (CD)
9 Dung dịch dừng phản ứng (S)
9 Các màng dính

Sử dụng 2 đối chứng âm và đối chứng dương cho mỗi lần kiểm
tra, cho mỗi đĩa.
8

III.2.1.Chuẩn bị
Cẩn thận cho việc phân phối và xác định đối chứng và mẫu. Tất
cả các thuốc thử phải đạt tới nhiệt độ phòng (18-25
o
C) trước khi
sử dụng.
III.2.2.Phương pháp:
III.2.2.1.Phân phối đối chứng và mẫu
a, Phân phối đối chứng:
Đối chứng được sẵn sàng sử dụng.
Lắc ống đựng đối chứng, cho 100µ đối chứng âm vào giếng
A1, A2, cho 100µl đối chứng dương vào giếng B1, B2.
b,Phân phối mẫu:
 Mẫu huyết thanh, huyết tương, và cả mẫu máu được kiểm
tra sau khi pha loãng vớ
i tỷ lệ 1:2 trực tiếp trong giếng, dùng
100µl/giếng.
 Phân phối 50µl mẫu pha loãng(SD) và thêm 50µl mẫu được
kiểm tra.
 Mẫu bạch cầu và dịch chiết mô: phân phối 100µl
supernatant từ dịch chiết mô không pha loãng hơn nữa.
 Mẫu có thể được kiểm tra một lần hoặc hai lần.
 Giếng phải được phủ phim dính, nó được cắt theo chiều dài
phù hợp với số giếng sử dụng.
 Tr
ộn bằng cách lắc nhẹ đĩa(plate) hoặc máy trộn.

tránh ánh sáng.
c. Thêm dung d
ịch dừng phản ứng: thêm 50µl dung dịch dừng
phản ứng trong một giếng.
Trộn bằng cách lắc nhẹ hoặc sử dụng máy trộn. Đảm bảo rằng
không có bọt khí trên giếng.
d. Đo OD: ở 2 bước sóng hấp thu 450 và 630nm hoặc 1bước sóng
hấp thu 450nm bằng máy đọc Elisa
Thu kết quả nếu có giá trị :OD đạt được đối với đối chứng dương
là ≥ 0.300, và OD đạt được
đối với đối chứng âm là < 70% ODP
III.2.2.5. Xử lý số liệu: Hai phương pháp để tính toán và giải thích:
a. Dựa vào chỉ số OD
mẫu
:
Cho mỗi mẫu:

Trong đó:
—
OD
Mẫu
= trung bình các OD mẫu, nếu kiểm tra được thực hiện với
hai mẫu
— OD
P
= trung bình OD của đối chứng dương.
• Bất kỳ mẫu máu có chỉ số ≥0 xem như dương tính, < -0.15x

IV. Tài liệu tham khảo:
• Công nghệ sinh học trong thú y. Nguyễn Ngọc Hải.
• Phylogenetic of hog cholera virus in Tien Giang province
Trân Thị Dân, Lương Quý Phương, Nguyen Ngọc Tuân,
Thái Quôc Hiêu, Hô Huỳnh Mai
Đại học Nông Lâm TPHCM, CCTY Tiền Giang
• Mignon B., Waxweiler S., Thiry E., Boulanger D., Dubuisson J. and
Pastoret P.P. 1992 J. Virol. Methods, 40 ; 85-94.