Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

1
PHẦN 1
GIỚI THIỆU

Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) là một trong những vùng kinh tế trọng
điểm nằm ở cực Nam của đất nước. Bên cạnh lúa gạo, ĐBSCL còn là vùng
nuôi trồng thủy sản lớn nhất nước. Với hệ thống sông ngòi chằn chịt, ĐBSCL
là nơi rất thuận lợi cho ngành nuôi trồng thủy sản phát triển, sản lượng thủy
sản của vùng đã đóng góp 1 phần đáng kể vào sản lượng thủy sản xuất khẩu
của cả nước, góp phần tăng thu nhập cho người dân. Sản lượng thủy sản của
ĐBSCL chiếm khoảng 50%, diện tích nuôi trồng khoảng 60% và giá trị xuất
khẩu thủy sản chiếm đến 51% của cả nước (Dương Nhựt Long, 2003).
Chính vì thế phong trào nuôi trồng thủy sản đã và đang rất thu hút người dân,
cùng với chính sách của nhà nước chuyển đổi cơ cấu ngành nghề loại bỏ đất
nông nghiệp lạc hậu để chuyển sang nuôi thủy sản thì các mô hình nuôi: nuôi
thâm canh, bán thâm canh, nuôi ao mươn vườn, nuôi kết hợp cá-lúa…đang
phát triển rầm rộ. Bên cạnh con tôm Sú thì cá Tra cũng là mặt hàng xuất khẩu
rất quan trọng của vùng, được nuôi phổ biến ở Cần Thơ, An Giang, Đồng
Tháp…và được xuất khẩu sang các nước như: EU, Nga, ASEAN, Ucraina,
Mỹ, Trung Quốc…Tổng sản lượng cá tra, basa xuất khẩu của Việt Nam năm
2007 đạt 383.2 nghìn tấn với kim ngạch đạt 974.12 triệu USD, tăng 31% về
lượng và 26.07% so với năm 2006
( />08).
Tuy nhiên trong nuôi cá tra thâm canh thường nuôi với mật độ dày và sử dụng
thức ăn nhiều nên lâu ngày dẫn đến nguồn nước bị ô nhiễm, mầm bệnh dễ có
cơ hội tấn công và tình trạng dịch bệnh xuất hiện ngày càng nhiều và khó điều
trị. Để điều trị có hiệu quả cao thì phải chuẩn đoán đúng được bệnh, phương
pháp mô học có vai trò quan trọng trong khâu này. Nếu chỉ dựa vào những
hình thái tổn thương bên ngoài mà không có các dữ kiện khác có liên quan đến

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

3
PHẦN 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Đặc điểm sinh học của cá tra
Cá tra có tên khoa học là Pangasianodon hypophthalmus trước đây còn có tên
gọi là Pangasius micronemus, cá tra phân bố ở lưu vực sông Mêkông, có mặt
ở cả 4 nước Lào, Việt Nam, Campuchia và Thái Lan. Trước đây khi chưa có
sinh sản nhân tạo, cá bột và cá tra giống được vớt trên sông Tiền, sông Hậu và
cá trưởng thành chỉ thấy trong ao nuôi, rất ít gặp trong điều kiện tự nhiên địa

4
bằng kính hiển vi. Phương pháp này cho phép người phân tích kết luận tính
chất của các vùng bị tổn thương.
Theo Roberts (1995) phân tích mô bệnh học là nghiên cứu những thay đổi
hiển vi diễn ra trong mô của cơ thể trong suốt quá trình bệnh. Những thay đổi
này thường là những đặc điểm đặc trưng của bệnh và nó cho phép chẩn đoán
chính xác bệnh.
Việc nghiên cứu tế bào học và mô học được tiến hành từ rất sớm từ cuối thế
kỷ XII nhưng mãi đến thế kỷ XIX thì tế bào học và mô học mới được xem là
một môn khoa học. Sau khi học thuyết tế bào ra đời năm 1839, đặc biệt là lĩnh
vực mô học mô tả ra đời thì những thành phần cấu tạo khác nhau của cơ quan
và các mô được nghiên cứu cẩn thận, tỉ mỉ hơn. Thành tựu lớn nhất của giai
đoạn này là chế tạo ra máy cắt lát mỏng (microtome) cho phép nghiên cứu sâu
hơn về cấu trúc vi thể của tế bào và mô (Nguyễn Quốc Thịnh, 2002).
Ngoài ra theo Phạm Trần Nguyên Thảo (2003) lịch sử mô học bắt đầu từ khi
chiếc kính hiển vi đầu tiên được chế tạo bởi Antoni Van Leuwenhoek (1632-
1723) người Hà Lan và đến cuối thế kỷ XVIII nhà khoa học người Anh Robert
Hooke (1635-1703) đã xác định tế bào là đơn vị cấu tạo cơ thể sinh vật. Vào
cuối thế kỷ XIX, Rudolf Virchow (1821-1902) nhà giải phẩu học người Đức
đã khẳng định: “ Bệnh tật là do tổn thương rối loạn tế bào”. Trên cơ sở đó mà
người ta đã hiểu được rằng bệnh tật không chỉ là do tổn thương, rối loạn ở các
cơ quan, nội tạng mà còn ở mức độ mô và tế bào.
Mô học có thể định nghĩa như một hệ thống các tế bào và chất gian bào có
cùng nguồn gốc, cấu tạo và chức năng, chúng được hình thành trong quá trình
tiến hoá sinh học và xuất hiện ở một cơ thể đa bào do quá trình biệt hoá (Phạm
Trần Nguyên Thảo, 2003).
Ở nước ta hiện nay mô học đã trở thành một môn khoa học quan trọng và từ
lâu đã được đưa vào giảng dạy trong các trường Đại học trên cả nước. Và mô
học cũng đã được nghiên cứu nhiều trên người, gia súc, gia cầm, thủy sản …
2.3 Ứng dụng mô bệnh học trong chẩn đoán bệnh thủy sản

Angka (1990) đã nghiên cứu bệnh trên cá trê trắng (Clarias batrachus) bị
nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophyla. Tác giả đã nghiên cứu mô tả về đặc
điểm bệnh lý, LD
50
và mô bệnh học. Kết quả cho thấy khi cá bị nhiễm vi
khuẩn Aeromonas hydrophyla thấy xuất hiện những vùng xuất huyết, hoại tử
trên gan, thận, tỳ tạng và cơ quan sinh dục. Tác giả còn cho rằng nguyên nhân
có thể là do chất Cytoxin do vi khuẩn tiết ra.
Sisi Hla Bu và Leong Tak Seng (1997) nghiên cứu mô bệnh học trên cá bống
mú bị bệnh “Sleepy Gouper Desease” mỗi điểm cá bệnh lấy 3 mẫu cá khoẻ và
6 mẫu cá bệnh và khảo sát trên 9 cơ quan: mang, tim, thận, tỳ tạng, não, da, dạ
dày và ruột. các cơ quan này được cố định, xữ lý nhuộm và quan sát dưới kính
hiển vi quang học kết quả có 5 cơ quan có sự thay đổi cấu trúc hiển vi khi so
sánh giữa cá khoẻ và cá bệnh là gan, mang, tim, thận và tỳ tạng (trích dẫn bởi
Nguyễn Quốc Thịnh, 2002).
Nguyễn Quốc Thịnh (2002) đã nghiên cứu mô bệnh học bệnh đốm trắng trong
nội tạng cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Tác giả đã khảo sát mô bệnh
học trên các cơ quan: gan, thận, tim, tỳ tạng, da và cơ của cá khỏe lẫn cá bệnh
và kết quả cho thấy khi cá bị bệnh trắng gan thì các cơ quan bị huỷ hoại nhiều
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

6
nhất là gan, thận và tỳ tạng và kế đến là mang và cuối cùng bị ảnh hưởng nhẹ
nhất là tim và cơ. Nguyên nhân làm cho cá chết có thể là do gan, thận, tỳ tạng,
mang bị hư hại dẫn đến mất chức năng của các cơ quan này.
Bùi Châu Trúc Đan (2003) đã nghiên cứu đặc điểm mô học bệnh phù mắt trên
cá tra. Tác giả đã nghiên cứu trên 10 cơ quan gồm: gan, thận, tỳ tạng, tim,
mang, ruột, dạ dày, bóng hơi, mắt, da và cơ. Kết quả về đại thể đặc điểm đặc
trưng của bệnh là: một hoặc hai mắt phù to, ổ mắt chứa đầy chất dịch màu
trắng đục, xuất huyết trong và ngoài cơ thể, về vi thể tổn thương chủ yếu là


7
(MMV) ở Đài Loan. Dấu hiệu bệnh lý tôm có màu trắng đục ở phần bụng, ăn
yếu, bơi lờ đờ. Mô bệnh học tương tự bệnh hoại tử cơ (IMP) và tác giả đã tìm
thấy thể vùi trong cơ bị hoại tử ; Bhavan and Geraldine (2002) nghiên cứu mô
bệnh học trên gan tuỵ và mang tôm Macrobrachium malcolmsonii khi tiếp xúc
với endosulfan. Kết quả có nhiều biến đổi về mô học trên gan tụy và mang
tôm. Những biến đổi bao gồm: sự tích tụ của các tế bào hồng cầu trong khe
của các xoang, ống gan tụy bị hoại tử, tấm mang không bình thường và phát
triển quá mức, bị hoại tử; Andersen et al. (2000) nghiên cứu bệnh mới trên vỏ
cua (Sylla serrata) ở Queensland (Australia). Dấu hiệu mô bệnh học của
những ống bị hư bên trong thấy có sự lây nhiễm ký sinh trùng và cho rằng đây
là nguyên nhân gây ra đốm nâu trên vỏ cua (trích dẫn bởi Nguyễn Kim Cương,
2006).
Theo Trần Thị Ngọc Hân (2006), Hibiya (1982) đã mô tả quá trình biến đổi
mô bệnh học trên tất cả các cơ quan trên cơ thể cá bệnh như cá chình, cá chép,
cá hồi.
Nghiên cứu về mô bệnh học trên cá thơm (Plecoglossus altivelis) bị bệnh xuất
huyết do vi khuẩn. Nghiên cứu mô học đã phát hiện những tổn thương ở tỳ
tạng, thận, gan, ruột , tim và mang. Những tổn thương ở tỳ tạng và mô tạo máu
thì dễ nhận biết do bị tấn công bởi vi khuẩn trên. Những vết hoại tử đi kèm với
xuất huyết, đông máu và trương phòng xuất hiện ở phần tủy của tỳ tạng, biểu
bì mô và trong thận. Trên gan cũng có hiện tượng hoại tử và sự hình thành
vùng áp-xe. Tuy nhiên ruột, tim và mang chỉ bị vi khuẩn P. altivelis tấn công
ở mức không đáng kể. Tuy nhiên không có sự tổn thương và vi khuẩn không
xuất hiện ở não
(
Ngoài ra còn có các nghiên cứu mô học chỉ nghiên cứu trên cá khỏe như:
Chinabut và ctv (1991) đã nghiên cứu về mô học trên cá trê trắng. Tác giả chỉ
khảo sát ở mô khỏe trên các cơ quan thuộc hệ tiêu hoá, hệ tuần hoàn, hệ sinh

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

9
PHẦN 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Đối tượng nghiên cứu
Cá tra khoẻ ở giai đoạn cá thịt, thu khoảng 30 con, mỗi con khoảng 500 gram.
3.2 Địa điểm và thời gian thực hiện
Địa điểm thu mẫu: Cần Thơ
Địa điểm phân tích mẫu: phòng mô học, khoa Thủy Sản, trường Đại Học
Cần Thơ
Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 2/2008 đến tháng 6/2008
3.3 Vật liệu nghiên cứu
3.3.1 Dụng cụ: gồm có bộ đồ tiểu phẩu, khay nhựa, kính hiển vi, lame, lamell,
keo nhựa, cốc thủy tinh (lớn, nhỏ), máy cắt lát mỏng (Microtome), khuôn đúc
mẫu, cassette, máy nhuộm mẫu tự động, máy Slide warmer, máy đúc khối, tủ
lạnh, tủ hút, viết chì, máy ảnh và một số vật dụng khác.
3.3.2 Hóa chất: gồm có nước cất, cồn tuyệt đối, formol thương mại, Bouin.

ra làm 2 phần và bỏ vào dung dịch cố định.
 Da, cơ: dùng lưỡi dao bén cắt dứt khoát, lưỡi dao thẳng góc với bề mặt
cơ quan. Mẫu cắt dày khoảng 2cm, bề dày khoảng 1cm.
 Tỳ tạng, tim: dùng kéo cắt nguyên cơ quan.
 Mang: dùng kéo cắt đứt 2 gốc xương cung mang và lấy toàn bộ cung
mang.
 Dạ dày, ruột: dùng kéo cắt lấy nguyên cơ quan, sau đó cắt ra làm 2
đoạn.
Đối với các cơ quan có kích thướt lớn khi lấy mẫu mô nên cắt ra làm nhiều
phần nhỏ để dung dịch cố định có thể ngấm tốt vào mẫu.
3.4.2 Phương pháp làm tiêu bản mẫu mô
 Cố định mẫu
Mẫu được cố định bằng Formol 10% hoặc Bouin. Mẫu sau khi được lấy cho
vào keo nhựa có chứa dung dịch Bouin để cố định (tỉ lệ 1:10). Riêng mẫu da,
cơ và bóng hơi cố định trong Formol 10% cho mẫu mềm hơn. Thời gian cố
định 24-48 giờ. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
11
 Rửa nước
Sau khi mẫu được cố định 24 giờ ta tiến hành rửa Bouin bằng nước và cồn
50
0
. Để mẫu dưới vòi nước chảy liên tục 1-2 giờ, rửa mẫu cho đến khi hết
dung dịch màu vàng sau đó chuyển mẫu ngâm trong 24 giờ trong cồn 60
0
.
 Cắt tỉa định hướng
Sau khi mẫu được ngâm trong cồn 60
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
12
Quy trình xữ lý mẫu (máy xử lý: Sproceeding tissue (MICROM, STP 120-
2))

 Đúc khối: (máy đúc khối: MICROM EC 350-1)
Chuyển cassette chứa mẫu đã được xử lý vào khoang chứa paraffin nóng chảy
trên máy đúc khối, để cassette trong paraffin khoảng 30 phút, tiến hành đúc
khối. Mẫu mô sẽ được đặt trong một khung cố định bằng inox và tiến hành
đúc khối bằng paraffin nóng chảy ở 65
0
C.
Đổ một ít paraffin vào khuôn inox, gắp mẫu bỏ vào khuôn sau đó đặt mẫu
ngay ngắn và ấn sát mẫu vào đáy khuôn và đặt khuôn inox lên chổ làm lạnh
trên máy đúc khối để cố định sơ bộ mẫu trên khuôn
Đặt cassette có ký hiệu mẫu lên trên, tiếp tục đỗ paraffin vào đầy khuôn inox.
Tiếp theo đặt khuôn inox qua ngăn làm lạnh nhanh để paraffin rắn lại, sau đó
tách khối paraffin ra khỏi khuôn và chuẩn bị cắt mẫu.
STT Hóa chất sử dụng Thời gian
1 Cồn 80% 1h
2 Cồn 90% 1h
3 Cồn 95% 1h

Tiến hành cắt mẫu:
Gắn mẫu vào máy cắt mỏng (Microtome) theo chiều ngang của cassette sao
cho khối mẫu ngang và thẳng đứng sau đó điều chỉnh độ dày của lát cắt. Bắt
đầu bằng những lát cắt 12-16

m. Sau khi đã cắt bằng mặt khối mẫu và đạt
đến vị trí mẫu mong muốn, điều chỉnh độ dày của lát cắt về vạch 1-2

m và
tiến hành cắt mẫu.
 Dán mẫu
Mẫu được cắt ra thành những băng dài, sau đó dùng dao thái hoặc kim mũi
giáo trải mẫu lên một cốc thủy tinh lớn đựng nước ấm để cho mẫu được căng
ra.
Sau khi đã chọn được đoạn mẫu đạt yêu cầu, dùng lame để vớt mẫu lên. Cầm
1 đầu của lame, đầu kia cho vào cốc nước thuỷ tinh phía dưới mẫu, sau đó từ
từ nâng lên và điều chỉnh cho mẫu ngay ngắn trên lame.
Để lame khô tự nhiên khoảng 15 phút sau đó chuyển lame lên máy Slide
warmer ủ ở nhiệt độ 45
0
sau 4 giờ để cố định mẫu lên lame. Sau khi dán mẫu
và cố định mẫu trên lame xong ta tiến hành nhuộm mẫu.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
14
 Nhuộm mẫu
Mẫu được nhuộm bằng tay, nhuộm mẫu bằng tay có thể tự điều chỉnh thời
gian lại ở bất cứ giai đoạn nào trong khi nhuộm nếu nhuộm không được tốt.
Nhuộm mẫu bằng dung dịch Haematoxylin và Eosin (H&E) theo qui trình của
Harris (1900) (có điều chỉnh) như sau:

Cồn 95
1 phút
1% acid acohol
Nhúng 3 lần
Xylen
10 phút

Xylen
10 phút
Xylen
10 phút

Cồn 100
0

1 phút

Cồn 100
0

1 phút

Cồn 100
0

1 phút

Haematoxylin
10 phút
Cồn 65

chọn ra các tiêu bản mô đẹp, đạt yêu cầu và chụp ảnh lại các tiêu bản đó. Bằng
phương pháp nhuộm H&E có thể quan sát rõ được cấu trúc mô của các cơ
quan trên cá tra. Tiêu bản đẹp phải có nhân bắt màu tím xanh của
Haematoxylin, phần còn lại bắt màu hồng của Eosin. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
16
PHẦN 4

sự xâm nhập của vi khuẩn, làm giảm tính độc của các vết thương, giảm bớt ma
sát của cá khi chúng di chuyển… (Harder, 1975 trích dẫn bởi Groman, 1982).
Ngoài ra theo Nguyễn Bạch Loan (2004) các tuyến dịch nhờn có tác dụng tiết
dịch nhờn làm trơn bề mặt cơ thể, lắp đầy các chỗ lõm trên cơ thể để giảm ma
sát khi di chuyển. Ngoài ra tuyến dịch nhờn còn có tác dụng điều hòa áp suất
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
17
thẩm thấu và bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của mầm bệnh bên ngoài
môi trường. Hình 4.1: Mặt cắt dọc da cá tra (H&E, 10X). A: lớp cơ; B: lớp hạ bì; C: lớp
biểu bì; D: các tế bào sắc tố (melanin)

Hình 4.2: Mặt cắt dọc lớp biểu bì da cá tra (H&E, 100X). A: tế bào biểu mô;
B: tế bào chùy; C: các tế bào sắc tố (melanin)
A

B
C

A

B

C
D

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
18

19
cơ cá cử động hay co rút là kết của của sự đan xen giữa 2 sợi này vào nhau
(Chinabut và ctv, 1991).
Cơ cá tra được quan sát ở đây là cơ vân dọc 2 bên thân cá, cơ nằm dưới lớp hạ
bì của da. Khi quan sát mặt cắt dọc của lớp da cơ từ ngoài vào trong ta thấy
đầu tiên là lớp biểu bì của da kế đến là lớp hạ bì và trong cùng là lớp cơ (hình
4.1). Ở mặt cắt dọc ta thấy các sợi cơ chạy dọc và bên trong có 1 nhân (hình
4.4) Hình 4.4: Mặt cắt dọc cơ vân cá tra (H&E, 100X). A: tế bào cơ; B: nhân

Ở mặt cắt ngang ra thấy các bó cơ có hình đa giác hoặc hình tròn nhưng không
nhìn thấy nhân, giữa các bó cơ này là các mô liên kết (hình 4.5). A
B

A
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
20
Hình 4.5: Mặt cắt ngang cơ vân cá tra (H&E, 40X). A: các bó cơ

4.2. Dạ dày và ruột
 Dạ dày
Dạ dày nằm nối tiếp sau thực quản và kết thúc ở cơ co thắt môn vị ở phần ruột
trước. Chức năng chính của dạ dày là chứa thức ăn và tiết ra các men tiêu hóa
thức ăn. Dạ dày có cấu trúc giống như thực quản nhưng lớp cơ bên ngoài của
thực quản là lớp cơ vân còn ở dạ dày là cơ trơn.
Hình 4.7: Mặt cắt ngang của dạ dày (H&E, 10X). A: lớp dưới niêm mạc; B:
tuyến thuộc dạ dày; C: lớp màng nhày niêm mạc; D: lớp niêm mạc Hình 4.8: Mặt cắt ngang lớp dưới niêm mạc dạ dày (H&E, 40X). A: mô liên
kết; B: Mạch máu
B

A
C
DA

B

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
22

Hình 4.9: Các tế bào tuyến dạ dày (H&E, 40X).A: tế bào tuyến
 Ruột
Ruột bắt đầu từ cơ co thắt môn vị và kết thúc ở hậu môn. Ruột hình ống dài,
gấp khúc hay cuộn tròn tùy thuộc vào tính ăn của loài. Cá tra là loài ăn tạp nên
ruột của nó có hình gấp khúc. Ruột là phần rất quan trọng trong sự tiêu hóa
thức ăn vì ở đây các quá trình tiêu hóa thức ăn được hoàn tất và những sản
phẩm cuối cùng của tiêu hóa sẽ được hấp thụ. Ruột tiết ra men tiêu hóa thức
ăn và tiếp nhận men tiêu hóa từ các tuyến tiêu hóa khác chuyển đến.

D

C

E

A

B

C

D

E

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
24

Hình 4.12: Mặt cắt ngang lớp cơ thành ruột cá tra (H&E, 40X). A: các sợi cơ
dọc; B: các sợi cơ vòng
Hình 4.13: Mặt cắt ngang lớp dưới niêm mạc ruột cá tra (H&E, 40X). A: mô
liên kết; B: hồng cầu trong xoang mao mạch A
B