PHÂN LẬP GEN ĐIỀU KHIỂN OsRAP2.4B
LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở LÚA
Trần Tuấn Tú
1
, Cao Lệ Quyên
1
, Lê Huy Hàm
1
, Phạm Xuân
Hội
1
Summary
Identification OsRap2.4B involved in drought stress tolerance from rice
DRE (dehydration responsive element)/CRT (C - repeat) is a cis - acting element that involves in gene
expression responsive to abiotic stress in higher plants. To date, all well known DREBP transcription
factors in Arabidopsis, rice, maize and other plants regulate gene expression in response to drought,
high - salt and cold stresses by binding specifically to DRE/CRT. Using a target sequence of 50
nucleotides on Glutamate dehydrogenase - like protein (JRC2606) promoter containing the core
sequence of DRE cis - acting element (A/GCCGAC) for yeast one - hybrid screening, we identified two
transcription factors. A completely homology of OsRAP2.4A gene and another is a new sequence. The
new sequence contained an ORF (Open Reading Frame) of 1017 - bp and 5’ non - coding area of 35 -
bp and 3’ non - coding area of 341 - bp. Analysis of its deduced amino acid sequence showed that it
contains an AP2 domain and furthermore, it belongs to the subgroup A6 of DREB subfamily,
temporarily named OsRAP2.4B. Sequence alignment of OsRap2.4B homologized with DREB subfamily
transcription factors from different species showed that OsRap2.4B had homology with ZmDBF, a
maize transcription factor that increases drought tolerance in plant, suggesting that OsRap2.4B may
function as a transcription factor involved in drought stress tolerance.
Keywords: Transcription factor, DRE/CTR, OsRap2.4B, drought stress tolerance.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Dưới điều kiện bất lợi, thực vật sẽ có sự
thay đổi về mặt sinh lý sinh hoá trong quá

56 gen trong hệ gen của cây cải dại và tất
cả đều có chứa một vùng ERFBP/AP2
được coi là có vai trò cốt yếu trong quá
trình đáp ứng với bất lợi của môi trường.
Phân họ DREB lại được chia nhỏ thành 6
nhóm nhỏ dựa trên mức độ tương đồng của
vùng bám ADN.
1
Viện Di truyền Nông nghiệp.
Phân họ DREB nhận biết và bám đặc
hiệu với các yếu tố DRE hay các trình tự
tác động gần giống DRE, trình tự lõi của
yếu tố DRE là A/GCCGAC tồn tại trong
hầu hết vùng promoter của các gen cảm ứng
với các điều kiện bất lợi của thời tiết như
hạn, mặn, nóng hay lạnh (Yamaguchi -
Shinozaki and Shinozaki, 1994). Cả hai yếu
tố trình tự tác động gần giống DRE là CRT
(trình tự C lặp lại) và yếu tố đáp ứng nhiệt
độ thấp (LTRE) đều chứa mô tuýp CCGAC
đều được chứng minh có vai trò điều khiển
các promoter cảm ứng nhiệt độ thấp (Baker
et al., 1994; Jiang et al., 1996).
Phân họ DREB còn bao gồm DREB1A - C
(CBF1-3), DREB2A-b, ba nhân tố DREB1
và sáu gen liên quan đến DREB2 ở hệ gen
cây cải dại đã được phân lập và các protein
của chúng có mức độ tương đồng đáng kể
với các vùng bám ADN bảo thủ trong các
protein ERFBP/AP2 khác (Jaglo - Ottosen et

minh tăng cưng biu hin ca nhiu gen
cm ng vi iu kin bt li dn n tăng
kh năng chng chu vi iu kin hn
(Sakuma et al., 2006a, b). Do vai trò quan
trng ca tính chng chu mn và hn, rt
nhiu n lc ca các nhà khoa hc ã ưc
u tư  phân lp và nghiên cu c tính ca
các nhân t áp ng hn hay mn  các thc
vt khác như lúa, ngô, lúa mỳ (Dubouzet et
al., 2003; Shen et al., 2003, Xue and
Loveridge, 2004, Qin et al., 2007). Tuy
nhiên, chc năng ca các gen này trong iu
kin hn vn còn chưa rõ ràng, ngoi tr gen
ZmDREB2A. Không ging như DREB2A,
gen ZmDREB2A to ra hai dng phiên mã
khác nhau nhưng ch dng phiên mã có chc
năng ưc to ra trong iu kin bt li cho
thy quá trình ch bin sau phiên mã không
cn thit vi gen ZmDREB2A. Thc vt
chuyn gen biu hin quá ngưng gen
ZmDREB2A cho thy tăng mc  biu hin
ca mt s gen cm ng vi bt li hn bao
gm các gen mã hoá protein LEA, các protein
chng c chng sc nhit. Vic biu hin liên
tc hay cm ng vi iu kin bt li ca gen
ZmDREB2A dn n tăng cưng sc chng
chu iu kin hn  thc vt (Qin et al.,
2007).
II. VT LIU VÀ PHƯƠN G PHÁP
N GHIÊN CU

dng 5 g mARN ã làm giàu gn vào
vectơ Hybrid Zap 2.1 theo quy trình ca
hãng Stratagen vi kít sinh tng hp thư
vin cDN A HybriZAP® - 2.1 XR
( />2.pdf). Thư vin cDN A ưc kim tra nng
 t 10
10
pfu/ml và ưc chia vào các ng
eppendorf gi  - 80
0
C. Sau ó thư vin
cDN A trong vectơ Hybrid Zap 2.1 ưc
chuyn sang thư vin cDN A pAD - GAL4
2.1 s dng quy trình ct khi lưng ln
trong iu kin in vivo ca hãng.

Hình 1. Thiết kế trình tự đích và kết quả kiểm tra số lượng trình tự đích lặp lại trong vectơ nhân
dòng pSKII ở E. coli bằng cách điện di sản phm PCR với cặp mồi T3/T7 trên gel agarose 1%
Thiết kế plasmid mang trình tự đích
cho sàng lọc phép lai đơn ở nấm men
Chúng tôi s dng trình t ích có cha
trình t DRE t trình t promoter ca gen
JRC2606 (glutamate dehydrogenase - like
protein) cm ng vi iu kin lnh vi mô
tuýp lõi ca trt t DRE là GCCGAC như sau:
AGCCAAACGCAGCCGGCCGACCTC
CTCCCGTGCCTTCC TCCTCGATCCCC.
Hai vectơ pHISi - 1 và pLacZi ưc s
dng  mang các trình t ích lp li trong
vùng MCS ca hai vectơ này.

đính gồm 10 nucleotide ở mỗi đầu 3’ cho
phép phân mảnh thứ hai này lại tiếp tục tự
gắn với nhau. Cặp mồi thứ 3 thì có trình tự
bổ sung với nhau khi gắn lại tạo thành phân
mảnh thứ ba với vị trí của enzyme SmaI
(hình 1a). Về nguyên tắc, các phân mảnh 1,
2 và 3 có 10 nucleotide gối nhau nên khi cho
chúng gắn lại với nhau sẽ tạo ra một trình tự
có chứa ít nhất 3 trình tự lặp lại (hình 1). Sản
phNm gn sau ó ưc nhân dòng trong
vectơ pSKII gia hai v trí enzyme EcoRI và
SmaI. Trình t nm trong vectơ pSKII 
ưc kim tra bng cách in di sn phNm
PCR vi cp mi c hiu ca vectơ (T3/T7)
trên gel agarose 1% và tái kim tra bng máy
gii trình t ABI3100. Sau ó, trình t ưc
tách ra và nhân dòng vào vectơ pHISi - 1 và
pLacZi bng hai v trí EcoRI và SmaI
(hình 1). S lưng trình t ích lp li trong
vectơ pHISi - 1 và pLacZi li ưc khng
nh bng gii trình t sau ó ưc bin np
vào h gen ca nm men YM4271. Bng
cách này chúng tôi ã thu ưc các cá th
nm m có cha hai vectơ thông báo vi 4
trình t ích lp li.

Hình 2. Kiểm tra mức độ biểu hiện của gen HIS3 trên môi trường có 3AT thiếu histidine,
uracine và khả năng chuyển hoá X - gal của cá thể nấm mẹ
Tip ó, chúng tôi kim tra mc 
biu hin cơ bn ca các gen HIS3 và LacZ

trưng. cDN A ca 12 khuNn lc này ưc
tách và gii trình t.
2. Giải trình tự và phân tích cấu trúc của
OsRap2.4B
 xác nh các khuNn lc dương tính
này, cDN A ca chúng u ưc gii trình
t trên h thng máy ABI 3100. Kt qu
gii trình t cho thy có 5 khuNn lc có
cDN A có trình t ging vi nhau, 4 khuNn
lc khác có cDN A có trình t tương ng
và phn còn li cDN A có trình t khác bit
nhau. Chúng tôi ã ưa hai trình t tương
ng vào ngân hàng gen và phát hin trình
t cDN A ca 5 khuNn lc tương ng là
OsRap2.4. Trình t cDN A còn li là mt
trình t mi ưc tm gi là OsRap2.4B
(hình 3). Trình t mi này có khung c m
dài 1017 - bp nm sau vùng không mã hoá
5’ dài 35 - bp và tip theo là vùng không
mã hoá 3’ dài 341 - bp. Trình t amino axít
d oán ca trình t này có 339 axít amin,
vi khi lưng phân t d oán ca protein
do trình t này mã hoá khong 39 kDa có
cha mt min AP2 vi 59 axít amin và mô
tuýp WLG nm trong trung tâm ca min
AP2 (hình 3). Hình 3. Trình tự nuceotide và trình tự axít amin dự đoán của trình tự mới phân lập
OsRap2.4B

tương đồng trong phân họ DREB
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
7
IV. KẾT LUẬN
Phân họ DREBP bám với trật tự DRE hay yếu tố tác động gần giống DRE và điều
hoà biểu hiện của các gen cảm ứng với điều kiện bất lợi đã được tập trung nghiên cứu về
mặt phân tử. Tuy nhiên, những nghiên cứu chỉ tập trung vào DREB1, DREB2 và các gen
đồng dạng (Zhang et al., 2004; Umezawa et al., 2006 và Shinozaki và Yamaguchi -
Shinozaki, 2007) ngoài ra còn có các nhân tố ZmDBFs (Kizis and Pages, 2002). Chúng
tôi đã xác định được một nhân tố phiên mã mới, OsRap2.4B thuộc nhóm phụ A6. Trình
tự axít amin dự đoán của OsRap2.4B có chứa miền bám ADN AP2 gồm 59 axít amin và
có mô tuýp WLG nằm trong trung tâm của miền là mô tuýp bảo tồn trong tất cả các nhân
tố phiên mã khác trong phân họ DREB (Sakuma et al., 2002). Tuy vậy, hoạt tính bám
DRE của các nhân tố phiên mã trong nhóm phụ A6 vẫn chưa được xác định ở mức độ
phân tử.
Tuy nhiên, ít nhất 5 nhân tố phiên mã của phân họ DREB là: DREB1,2, OsDREB1,
ZmDREB1 và ZmDBF1 đã được phân lập bằng phương pháp sàng lọc một bước ở nấm
men và tất cả chúng đều có miền bám DRE (Liu et al., 1998; Ping et al., 2005, Qin et al.,
2004 and Kizis et al., 2002). Trong thí nghiệm này, sử dụng một tập hợp 4 trình tự đích
DRE lặp lại trong sàng lọc một bước ở nấm men cho thấy trật tự OsRap2.4B có thể là một
nhân tố phiên mã. Hai protein tương tác với trình tự DRE mới là DBF1 và DBF2 là thành
viên của họ các nhân tố phiên mã AP2/ERFBP bám với yếu tố DRE2 và điều hoà biểu hiện
của các gen cảm ứng với điều kiện bất lợi và kết quả là tăng khả năng chịu hạn ở cây
chuyển gen (Kizis et al., 2002; Saleh A et al., 2006). So sánh trình tự của OsRap2.4B với
các nhân tố phiên mã tương đồng trong phân họ DREB từ các loài khác nhau cho thấy
OsRap2.4B tương đồng chặt với Rap2.4, OsRap2.4A và ZmDBF1, qua đó có thể nói nhân
tố phiên mã OsRap2.4B có thể tương đồng về chức năng với nhân tố ZmDBF1 và tăng
cường khả năng chống chịu điều kiện bất lợi của cây chuyển gen. Các nghiên cứu chi tiết
về đặc tính và chức năng của nhân tố OsRap2.4B vẫn đang được tiếp tục và kết quả sẽ
được công bố trong thời gian tới.

transcription factors involved in cold responsive gene expression in transgenic rice.
Plant Cell Physiol. 47 (1): 141 - 153.
10 Jaglo K. R., Kleff S., Amundsen K. L., Zhang X., Haake V., Zhang J. Z., Deits T. and
Thomashow M. F., 2001. Components of the arabidopsis C - repeat/dehydration
responsive element binding factor cold response pathway are conserved in Brassica
napus and other plant species. Plant physiol. 127: 910 - 917.
11 Liu Q., Kasuga M., Sakuma Y., Abe H., Miura S., Yamaguchi - Shinozaki K and
Shinozaki K., 1998. Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an
EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signaling transduction
pathways in drought - and low - temperature - responsive gene expression,
respectively, in Arabidopsis. Plant Cell, 10: 1391 - 1406.
12 Qin F., Sakuma Y., Li J., Liu Q., Li YQ., Shinozaki K. and Yamaguchi - Shinozaki K.,
2004. Cloning and functional analysis of a novel DREB1/CBF transcription factor
involved in cold - responsive gene expression in Zea mays L. Plant Cell Physiol. 45:
1042 - 1052.
13 Qin F, Kakimoto M, Sakuma Y, Maruyama K, Osakabe Y, Tran LS, Shinozaki K,
Yamaguchi - Shinozaki K., 2007. Regulation and functional analysis of ZmDREB2A
in response to drought and heat stresses in Zea mays L. Plant Journal 50 (1):54 - 69.
14 Sakuma Y, Maruyama K., Okasabe Y., Qin F., Seki M., Shinozaki K. and Yamaguchi -
Shinozaki K., 2006. Function analysis of an Arabidopsis transcription factor DREB2A
involved in drought - responsive gene expression. The Plant Cell 18: 1292 - 1309.
15 Shinozaki K. and Yamaguchi - Shinozaki K., 2007. Gene networks involved in
drought stress response and tolerance. Journal of Experimental Botany58 (2): 221 -
227.
16 Umezawa T, Fujita M, Fujita Y, Yamaguchi - Shinozaki K, Shinozaki K., 2006a.
Engineering drought tolerance in plants: Discovering and tailoring genes unlock the
future. Current Opinion in Biotechnology 17: 113 - 122.
17 Yamaguchi - Shinozaki K. and Shinozaki K., 1994. A novel cis - acting element in an
Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought, low - temperature, or high
- salt stress. Plant Cell 6: 251 - 264.