1
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Đề tài: “So sánh hai phương pháp định lượng
Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển
Trung Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ
UV-VIS theo dược điển Việt Nam III.” 2 ĐẶT VẤN ĐỀ
Berberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có trong
nhiều loại cây thuốc ở Việt Nam, khoảng 150 loài thuộc nhiều họ thực vật
khác nhau. Berberin chủ yếu ở trong thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5-
3%[1].
Berberin được biết đến với tác dụng nổi bật là kìm khuẩn tả và E.coli,
điều trị bệnh lỵ. Thuốc được sử dụng phổ biến do giá thành thấp và khá an
toàn, không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của vi khuẩn có ích ở
Công thức cấu tạo:
Công thức phân tử: C
20
H
18
NO
4
+ PTL: 336.36
Tên khoa học : 5,6 dihydro – 8,9 – dimethoxy – 1,3 – dioxa – 6a –
azoniaindeno (5,6-a) anthracen [6]
1.1.2. Nguồn gốc:
This image ca nnot currently be display ed.
This image ca nnot currently be display ed.
4
Berberin thường có trong rễ, thân rễ, thân, vỏ cây những cây thuộc chi
Berberis, Hydrastis candensis, Coptis chinensis [18]. Berberin có nhiều trong
thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5-3%, berberin chiếm ít nhất là 82% so với
alcaloid toàn phần [9].
Berberin thường có lẫn các tạp chất alcaloid khác như: palmatin,
jatrorrhizin. Giới hạn tạp chất palmatin không quá 2%, jatrorrhizin không quá 5
% [6],[13].
1.1.3. Tính chất
- Bột kết tinh màu vàng, không mùi, có vị rất đắng. Tan trong nước
nóng, khó tan trong ethanol và nước lạnh, rất khó tan trong cloroform, không
tan trong ether.[6]
1.5. Tác dụng dược lý:
- Berberin có tác dụng kháng vi trùng như: vi khuẩn ( shigella, tụ cầu
và liên cầu khuẩn), thể protozoal, vi nấm, candida, virus, nấm men, kí sinh
trùng gây bệnh (kí sinh trùng sốt rét, kí sinh trùng đường ruột) [12], [17].
50ml dung dịch kali dicromat 0,1N rồi thêm nước tới vạch. Lắc đều trong 5
phút, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác 100ml dịch
lọc cho vào bình nón nút mài 250 ml, thêm 2g kali iodid, lắc cho tan, sau đó
thêm 10 ml dung dịch acid hydrochloric 16%, đậy kín, lắc đều, để vào bóng
tối trong 10 phút. Chuẩn độ bằng dung dịch natri thiosulfat 0,1N, gần điểm
tương đương thêm 2ml dung dịch hồ tinh bột và tiếp tục chuẩn độ cho đến khi
màu xanh biến mất thì dừng.
Song song tiến hành làm mẫu trắng trong cùng điều kiện.
1ml dung dịch kali dicromat 0,1N tương ứng với 12,39 mg C
20
H
18
NO
4
Cl.
1.2.2. Phương pháp đo UV-VIS
Phương pháp 1:[6].
6
* Dung dịch thử: Cân 0.200 g chế phẩm và hòa tan trong 200ml nước
bằng cách đun nóng. Sau đó làm lạnh và thêm nước đến 1000ml. Lấy 10ml
dung dịch này pha loãng với nước đến 100ml.
* Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,200 g Kali dicromat thuốc
thử chuẩn đã sấy khô ở 110
0
C trong 4 giờ, hòa tan trong nước. Thêm 10ml
dung dịch acid sulfuric 1N và thêm nước vừa đủ 1000ml.
* Đo độ hấp thụ: Đo At và As của dunh dịch thử và dung dịch chuẩn ở
bước sóng 421 nm.
* Cách tính: Lượng ( mg) của C
20
Áp dụng để định lượng viên nén berberin clorid, dựa trên khả năng tạo
tủa của berberin với acid picric.
Cân 20 viên và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên
tương ứng với khoảng 0.50g berberin clorid, cho vào bình định mức 250ml,
thêm khoảng 200 ml methanol (TT), lắc kỹ để hòa tan berberin, rồi thêm
methanol đến ngấn. Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20ml dịch lọc ban đầu.
Lấy đúng 100ml dịch lọc. Làm bay hơi cho đến khô trên cách thủy, thêm
150ml dung dịch NaOH 0,1N và 90ml nước, đun nóng. Lắc kỹ để hòa tan. Để
nguội rồi lọc qua giấy lọc đã thấm ướt. Rửa phễu và giấy lọc 3 lần, mỗi lần
10ml nước.
Gộp dịch lọc và nước rửa, thêm 10ml dung dịch acid hydroclorid 0,1N
rồi tiếp tục cho ngay và từ từ 30ml dung dịch bão hòa acid picric ( TT). Lắc
đều.
Để yên qua một đêm, lọc qua phễu thủy tinh xốp có đường kính lỗ xốp
10 – 16 µm ( đã cân bì) để lấy tủa. Rửa tủa 3 lần với nước cất ở khoảng 15
0
C,
mỗi lần 15ml nước, hút kiệt nước rồi sấy khô phễu và tủa ở 100
0
C đến khối
lượng không đổi. Khối lượng tủa xác định là P (g).
1 g tủa tương ứng với 0,6586 g C
20
H
18
NO
4
Cl.
1.2.4. Phương pháp HPLC
Phương pháp 1:[14], [15].
W
t
= W
s
x (A
t
/ A
s
)
W
s
= Lượng (mg) của berberin chuẩn, tính theo lượng khan.
Phương pháp 2: [13]
* Điều kiện sắc ký:
- Cột sắc ký: Cột được nhồi bởi các hạt silicagel đã được octadecylsilan hóa.
- Pha động: Hỗn hợp dung dịch đệm phosphate [ 0,05 mol/L kali
dihydrophosphat với 0,05 mol/L natri heptan sulfonat (1:1) chứa 0,2%
triethylamin, điều chỉnh tới pH 3,0 bằng acid phosphoric] và acetonitril
(60:40).
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/ phút.
- Detector UV ở bước sóng 263 nm.
- Thể tích tiêm: 20 µl
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: 32 µg/ml
* Tiến hành:
9
Lần lượt tiêm các dung dịch thử và chuẩn. Dựa vào đáp ứng của pic
berberin trong dung dịch thử, chuẩn và hàm lượng dung dịch chuẩn, tính
lượng berberin có trong chế phẩm.
chúng ta có sắc đồ. [8], [11]
1.3.3. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký:
Kết quả của quá trình sắc kí được detector phát hiện, phóng đại và ghi
thành sắc ký đồ( hình 1): Hình 1: sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng
Trong đó :
t
o
(thời gian chết): Là thời gian cần thiết để pha động chảy qua cột tách
t
R
(thời gian lưu): thời gian kể từ khi chất cần phân tích được bơm vào
cột cho đến khi xuất hiện đỉnh của pic chất cần phân tích.
t
R’
(thời gian lưu thực ) = t
R
- t
o.
W
0,5
: Độ rộng pic ở nửa chiều cao
W
b
: Độ rộng đáy pic.
1.3.2.1. Hệ số dung lượng k
’
0
0R
0
R
−=
−
==
11
Nếu k' nhỏ thì t
R
cũng nhỏ và sự tách kém. Trong thực tế k' nằm trong
khoảng 2 - 5 là tốt nhất. Hai chất chỉ được tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá
trị khác nhau.
1.3.2.2 Độ chọn lọc
α
(selectivity - factor)
α=
t
t
tt
'
k
'k
01R
02R
1
2
−
−
=
α
−α
=
+
−
=
+
−
+
'
k
1
'k
w
w
tt
w
w
tt
B
B
A2/1B2/1
A,RB,R
AB
A,RB,R
1
4
N
18,12
w
t
B
R
2
hay N=5,54
w
t
B2/1
R
2
[4], [8]
Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết H
được tính bằng công thức:
=
H
N
L
1.3.4. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC [4],[8]
Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao
gồm 6 bộ phận chính sau:
Hình 2: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC
1.3.5. Cách đánh giá pic[7]
* Đánh giá diện tích pic: Diện tích của một chất tương ứng với tổng
lượng chất đó. Để tính diện tích pic, hiện nay người ta thường dùng máy tích
phân điện tử gắn với máy vi tính (sai số khoảng 0,5 %) hoặc máy phân tích cơ
học (sai số 1,3 %). Phương pháp này có thể dùng cho các pic không bị trôi
đường nền và cả pic có đường nền bị trôi. Phương pháp này chỉ cần điểm đầu Cột
Bin
h
chứa
pha
động
Bơm
o
×
10
-ồCl
Với ồ là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch. Hệ số này không phụ thuộc
vào nồng độ, chỉ phụ thuộc vào bản chất chất tan, vào bước sóng của ánh sáng
chiếu vào dung dịch.
1.4.1.2. Điều kiện ứng dụng định luật Lambert – beer
+ Chùm tia sáng phải đơn sắc
+ Dung dịch phải loãng (nằm trong khoảng nồng độ thích hợp)
+ Dung dịch phải trong suốt (trừ chuẩn độ đo quang).
+ Chất thử phải bền trong dung dịch và phải bền duới tác dụng của ánh
sáng (UV-VIS).
1.4.1.3. Sự sai lệch đối với định lật Lambert-beer
15
+ Sự sai lệch do máy:(do bộ phận đơn sắc ,bộ phận khuếch đại kém) như
do tế bào quang điện, nhân quang quá già, độ nhạy kém.
+ Sai lệch do hoá học:
- Do sự phân ly (ion hoá): thường gặp khi pha loãng dung dịch, phân tử
chất tan bị phân ly, mà độ hấp thụ của dạng phân tử và dạng ion phân ly
không như nhau.
- Do tạo dimer, trimer: sản phẩm trùng hợp này lại có độ hấp thụ khác
dạng đơn phân tử.
+ Do phản ứng các chất lạ:
- Chất lạ có thể tạo phức với các ion trong dung dịch: để đề phòng hiện
tượng này xảy ra, người ta dùng mẫu trắng có thành phần như dung dịch, chỉ
thiếu chất cần định lượng.
1%
cm
E
):
Theo công thức A =ồ.C.l, nếu l=1 cm, C=1% thì :
A = ồ =
1
1%
cm
E
Vậy
1
1%
cm
E
chính là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ 1%, dùng cốc đo
có bề dày 1cm. Với một chất tan xác định, tại một ở xác định,
1
1%
cm
E
là một
hằng số.
d/ Hệ số hấp thụ phân tử (ồ
ỡ
):
Hệ số hấp thụ phân tử, hay còn gọi là hệ số tắt mol là độ hấp thụ của
dung dịch có nồng độ 1M/l, dùng cốc đo có bề dày1cm.
Cũng như
Đo độ hấp thụ của dung dịch, tính nồng độ C của dung dịch dựa vào giá
trị
1
1%
cm
E
biết trước (tra cứu).
A =
1
1%
cm
E
.C.l
→ C =
1
1%
cm
A
E
(với l =1 cm)
17
Trong phương pháp này, phải chú ý kiểm tra máy đo về bước sóng (ở) và
mật độ quang A bằng cách:
Dùng đèn thuỷ ngân, đèn D
2
(cho một vạch sáng có bước sóng xác
định).
Dùng một mẫu chuẩn, đo và điều chỉnh để tìm sai số.
Dùng một kính lọc Holmium (có các giá trị ở
x
(chưa biết) và của
dung dịch chuẩn có nồng độ A
c
(đã biết).
Ta có:
x
c
A
A
=
x
C
c
C
→ C
x
=x
c
A
A
x C
c
Chú ý: nồng độ của dung dịch thử C
x
và của dung dịch chuẩn C
c
), acid phosphoric
(H
3
PO
4
)
. Heptane sodium sulfonate, triethylamine
. Acetonitril dùng cho HPLC (Merk)
. Nước cất 2 lần (cất trực tiếp tại Bộ môn Hóa vô cơ trường đại học
Dược Hà Nội) dùng cho máy HPLC
. Một vài hóa chất khác
2.1.1.3. Thiết bị:
+ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: DIONEX- Detector UV Diode
array- PDA 100
+ Cân phân tích AY 220 , Max = 220 g, độ chính xác 0,1 mg
+ Máy đo pH JENWAY của Anh
+ Máy cất nước 2 lần
+ Máy lắc siêu âm EBRO ARMATUREN của Đức
19
+ Máy lọc hút chân không Satorius
+ Bình định mức các loại: 20,0 ml; 25,0 ml; 100,0 ml
+ Cốc có mỏ: các loại 100; 200; 500
+ Pipet chính xác, pipet thường, đũa thủy tinh.
+ Bơm tiêm, lọ đựng mẫu, màng lọc 0,45 µm
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu:
2.1.2.1. Chỉ tiêu nghiên cứu:
. Phân tích mẫu thử bằng phương pháp HPLC và phương pháp đo
quang phổ hấp thụ UV- VIS
. Đánh giá độ chính xác, tính đúng, tính tuyến tính, tính đặc hiệu của
hai phương pháp trên
1i
2
i
x
−
−
=
∑
=
20
- Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): RSD% =
S
x
×
100
- Sai số chuẩn :
n
S
s
x
=
- Sai số tương đối:
( )
100
x
%
s
> S
2
F
tn
>F
lt
: độ chính xác hay độ lặp lại của hai phương pháp khác nhau có ý
nghĩa thống kê
F
tn
>F
lt
: độ chính xác hay độ lặp lại của hai phương pháp khác
nhau có ý nghĩa thống kê
F
tn
<F
lt
: độ chính xác hay độ lặp lại của hai phương pháp khác
nhau không có ý nghĩa thống kê
F
lt
tra bảng ở mức tin cậy 95% khi bậc tự do K = n – 1
+ Test T để so sánh giá trị trung bình kết quả định lượng của hai
phương pháp khác nhau :
T =
1 2
1 2
1 1
n n
t
α
+ −
: giá trị trung bình kết quả định lượng của hai
phương pháp khác nhau không có ý nghĩa thống kê
T >
1 2
2
/2
n n
t
α
+ −
: giá trị trung bình kết quả định lượng của hai
phương pháp khác nhau có ý nghĩa thống kê
1 2
2
/2
n n
t
α
+ −
tra bảng ở mức tin cậy 95% khi bậc tự do K = n
1
+n
2
-2
2.2. Kết quả thực nghiệm :
A
×
×
×
C
Trong đó :
C% : Hàm lượng % Berberin clorid có trong mẫu thử.
C : Hàm lượng % Berberin clorid có trong mẫu chuẩn
A
t
: Độ hấp thụ của dung dịch thử.
A
c
: Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn.
m
t
: Khối lượng tính bằng gam của Berberin clorid trong bột
nguyên liệu đã cân để pha dung dịch thử.
m
c
: Khối lượng tính bằng gam của Berberin clorid chuẩn đã
cân để pha dung dịch chuẩn.
Tiến hành định lượng 5 mẫu. Kết quả ghi trong bảng 1 .
Bảng1 : Kết quả định lượng Beberin clorid trong nguyên liệu
STT Khối lượng cân(g) Độ hấp thụ(A) C%
1 0,1971 0,269 86,50
2 0,2010 0,272 85,76
0,2400g ( tại các điểm 80%,90%,100%,110%,120% nồng độ dùng khi định
lượng)
Cách tiến hành tương tự 2.2.1
Bảng 2: Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dung dịch
24
STT 1 2 3 4 5
C
(mg/ml)
0,0161 0,0180 0,0202 0,0220 0,0240
A 0,215 0,239 0,262 0,286 0,315 Hình 6 .Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào
nồng độ dung dịch
- Phương trình hồi quy biểu thị mối tương quan giữa mật độ quang và
nồng độ dung dịch là: y = 12,5 x + 0,013;
- Hệ số tương quan: 0,998
- Độ lệch chuẩn của y_ intercept: S
b
= 0,009
- Với độ tin cậy 95% ta có khoảng tin cậy của y_intercept:
b ±3,182S
b
= 0,013 ± 0,029 hay - 0,016 ≤ y_intercept ≤ 0,042
Từ kết quả trên cho thấy hệ số tương quan của đường hồi quy vượt
quá 0,99…Tất cả các giá trị nằm trên đường hồi quy hoặc phân bố đồng đều
cả hai phía của đường hồi quy.
Khoảng tin cậy của y_intercept chứa 0.
Vậy phương pháp là tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 80% đến
STT
Khối
lượng cân
(g)
Lượng hoạt
chất có thực
a (g)
Độ hấp
thụ trung
bình (A)
Lượng tìm
lại trung
bình b (g)
Phần trăm
tìm lại
(b/a.100%)
1 0,1605 0,1337 0,208 0,1322 98,88
2 0,2020 0,1683 0,267 0,1696 100,77
3 0,2362 0,1967 0,313 0,1984 100,86
Từ kết quả bảng 3 ta có:
- Trung bình % tìm lại: 100,17%
- Phương trình hồi quy về mối tương quan giữa lượng hoạt chất ban
đầu và lượng hoạt chất tìm lại là: y = 1,052x – 0,008
- Hệ số tương quan: r = 0,999
Copyright: Tài liệu đại học ©