đặt vấn đề
Berberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có trong nhiều
loại cây thuốc ở Việt Nam, khoảng 150 loài thuộc nhiều họ thực vật khác nhau.
Berberin chủ yếu ở trong thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5-3%[1].
Berberin đợc biết đến với tác dụng nổi bật là kìm khuẩn tả và E.coli, điều
trị bệnh lỵ. Thuốc đợc sử dụng phổ biến do giá thành thấp và khá an toàn,
không ảnh hởng tới sự phát triển bình thờng của vi khuẩn có ích ở ruột.
Hiện nay trên thị trờng có các dạng bào chế của Berberin nh: thuốc nhỏ
mắt, viên nén, viên bao . Vì vậy vấn đề kiểm tra chất l ợng nguyên liệu làm
thuốc cũng nh thành phẩm là rất quan trọng.
Dợc điển Việt Nam III (DĐVN III) có chuyên luận kiểm nghiệm nguyên
liệu và chế phẩm viên nén Berberin bằng phơng pháp đo quang phổ hấp thụ tử
ngoại UV- VIS, dợc điển Trung Quốc (2005) định lợng Berberin bằng HPLC.
Để có cơ sở lựa chọn phơng pháp định lợng Berberin thích hợp, chúng tôi đã
tiến hành thực hiện đề tài : So sánh hai phơng pháp định lợng Berberin
nguyên liệu bằng HPLC theo dợc điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang
phổ hấp thụ UV-VIS theo dợc điển Việt Nam III với những mục tiêu sau:
Đánh giá phơng pháp định lợng Berberin nguyên liệu bằng HPLC
theo dợc điển Trung Quốc (2005)
Đánh giá phơng pháp định lợng Berberin nguyên liệu bằng đo
quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III
So sánh hai phơng pháp định lợng trên để tìm phơng pháp thích
hợp cho việc định lợng berberin trong các cơ sở kiểm tra chất lợng
thuốc trong nớc.
PHầN I. TổNG QUAn
1
1.1. vài nét Về BERBERIN:
1.1.1. Cấu trúc:
Beberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có khung
protoberberin[1]. Isoquinolin còn đợc gọi là benzo[c] pyridin hay 2- benzamin
là một hợp chất hữu cơ thơm heterocyclic[18]

phối hợp với một số thuốc kháng sinh sẽ hạn chế tác dụng phụ gây ra bởi các
thuốc kháng sinh đối với hệ sinh vật đờng ruột [17].
- Berberin có tác dụng ức chế sự bài tiết ion trong lòng ruột, ức chế co
cơ, giảm cholesterol và trigycerid, chống tiểu đờng, ức chế cơn nhịp nhanh thất,
giảm viêm cho ngời bị viêm khớp, tăng tiểu cầu của bệnh nhân xuất huyết, giảm
tiểu cầu tiên phát và thứ phát, kích thích sự bài tiết mật và thải trừ bilirubin[17].

Chỉ định: [9],[12],[17]
- Bệnh lỵ trực khuẩn, hội chứng lỵ, viêm ruột, tiêu chảy, viêm ống mật và
đặc biệt là bệnh sỏi mật, vàng da, sốt, sốt rét, mụn nhọt.
- Điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài( do nắng, gió,
lạnh, bụi, khói ) và điều trị bệnh đau mắt hột.
- Điều trị bệnh Leishmania, Trichomonas.
1.1.6. Chống chỉ định: [17]
- Phụ nữ có thai vì khả năng gây co bóp tử cung của berberin
- Ngời dị ứng với berberin ( rất hiếm gặp)
1.1.7. Dạng thuốc và hàm lợng: [11]
3
- Dạng viên nén, viên bao, viên nang với hàm lợng 10 mg, hoặc 50-100
mg/ viên
- Dạng thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích
bên ngoài (gió, nắng, lạnh, bụi, khói)
1.2. Một số phơng pháp định lợng Berberin:
1.2.1. Phơng pháp thể tích: [5], [13]
Hòa tan 0,3g chế phẩm (chính xác) vào trong cốc với 150ml nớc đang sôi.
Làm nguội, chuyển dung dịch vào bình định mức 250ml. Lấy chính xác 50ml
dung dịch kali dicromat 0,1N rồi thêm nớc tới vạch. Lắc đều trong 5 phút, lọc
qua giấy lọc khô, bỏ 20ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác 100ml dịch lọc cho vào
bình nón nút mài 250 ml, thêm 2g kali iodid, lắc cho tan, sau đó thêm 10 ml
dung dịch acid hydrochloric 16%, đậy kín, lắc đều, để vào bóng tối trong 10

4

a
As
At
P
ìì=
006,1
1
a: khối lợng ( mg) kali dichromat.
Phơng pháp 2 [6]
Xác định hàm lợng berberin clorid trong viên nén.
* Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lợng trung bình và nghiền thành bột
mịn. Cân chính xác một lợng bột viên tơng đơng với khoảng 80 mg berberin
clorid, thêm 10ml nớc để thấm đều bột viên, sau đó thêm khoảng 200ml nớc sôi,
khuấy kĩ 5 phút, để nguội rồi chuyển vào bình định mức 500ml, thêm nớc tới
vạch, lắc đều. Để lắng tự nhiên hoặc đem ly tâm. Lấy chính xác 5ml dung dịch
trong ở trên đem pha loãng với nớc cất vừa đủ 100ml.
* Dung dịch chuẩn : pha tơng tự dung dịch thử, dùng chất đối chiếu
berberin clorid.
* Mẫu trắng: nớc cất.
* Tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch thử và chuẩn trong cùng điều
kiện tại bớc sóng cực đại 345 nm, cốc đo dầy 1 cm.
1.2.3. Phơng pháp cân [5]
áp dụng để định lợng viên nén berberin clorid, dựa trên khả năng tạo tủa
của berberin với acid picric.
Cân 20 viên và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lợng bột viên t-
ơng ứng với khoảng 0.50g berberin clorid, cho vào bình định mức 250ml, thêm
khoảng 200 ml methanol (TT), lắc kỹ để hòa tan berberin, rồi thêm methanol
đến ngấn. Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20ml dịch lọc ban đầu. Lấy đúng

1000 ml hỗn hợp dung môi nớc và acetonitril (1:1).
- Tốc độ dòng: Điều chỉnh tốc độ dòng sao cho thời gian lu của berberin khoảng
10 phút.
- Detector UV ở bớc sóng 345 nm.
- Thể tích tiêm: 10 àl.
- Nồng độ dung dịch thử và chuẩn: 0,1mg/ml và cách tiến hành pha 2 dung dịch
này giống nhau.
* Tiến hành:
Lần lợt tiêm các dung dịch thử và chuẩn. Dựa vào đáp ứng của pic berberin
trong các dung dịch thử , chuẩn và hàm lợng dung dịch chuẩn, tính lợng
berberin trong chế phẩm.
* Cách tính: Lợng W
t
(mg) của berberin clorid (C
20
H
18
ClNO
4
).
W
t
= W
s
x (A
t
/ A
s
)
W

7
cần phân tích đa vào cột, chúng sẽ đợc hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy
thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi ta bơm dung môi pha
động bằng bơm với áp suất cao thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với hai pha,
chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đợc phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là
detector và đợc chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng đợc hiển thị
trên màn hình hoặc đa ra máy in. [8]
1.3.2. Cơ sở lý thuyết
Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và
phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một
tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lu giữ ra khỏi cột.
Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và dung môi mà quá trình rửa giải tách đợc
các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký, chúng ta có sắc
đồ. [8], [11]
1.3.3. Các thông số đặc trng của quá trình sắc ký:
Kết quả của quá trình sắc kí đợc detector phát hiện, phóng đại và ghi
thành sắc ký đồ( hình 1):t
t
W
b2
0.5-2
W
0.5-1
W
b1
W

1.3.2.1. Hệ số dung lợng k

[8]
Nếu k' nhỏ thì t
R
cũng nhỏ và sự tách kém. Trong thực tế k' nằm trong khoảng 2 - 5 là tốt nhất.
Hai chất chỉ đợc tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị khác nhau.
1.3.2.2 Độ chọn lọc

(selectivity - factor)
=
tt
tt
'k
'k
01R
02R
1
2


=
(k
2
'
> k
1
'
) [4], [8]
khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối u từ 1,5 đến 2.

'k
ww
tt
ww
tt
B
B
A2/1B2/1
A,RB,R
AB
A,RB,R
1
4
N
18,12
[4], [8]
Độ phân giải cơ bản đạt đợc khi R = 1,5
1.3.2.4. Hệ số bất đối AF
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó đợc tính theo công thức:
a2
AF
w
20/1
=
[4], [8]
Trong đó:
W
1/20
: là chiều rộng của pic đợc đo ở 1/20 chiều cao của pic
9




w
t
B
R
2
hay N=5,54






w
t
B2/1
R
2
[4], [8]
Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết H đợc
tính bằng công thức:
=H
N
L
1.3.4. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC [4],[8]
Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm
6 bộ phận chính sau:
a/Hệ thống bơm

Cột
Binh
chứa
pha
động
Bơm
Detector Bộ phận tự ghi
Van tiêm
mẫu
1.3.5. Cách đánh giá pic[7]
* Đánh giá diện tích pic: Diện tích của một chất tơng ứng với tổng lợng
chất đó. Để tính diện tích pic, hiện nay ngời ta thờng dùng máy tích phân điện
tử gắn với máy vi tính (sai số khoảng 0,5 %) hoặc máy phân tích cơ học (sai số
1,3 %). Phơng pháp này có thể dùng cho các pic không bị trôi đờng nền và cả
pic có đờng nền bị trôi. Phơng pháp này chỉ cần điểm đầu điểm cuối của pic đợc
nhận ra chính xác và cho kết quả tốt với nồng độ vừa, trung bình và cao.
* Đánh giá chiều cao pic: Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic
(khoảng cách giữa đờng nền và đỉnh pic) là một đại lợng tỷ lệ với diện tích pic
và nó cũng có thể dùng để đánh giá phổ. Phơng pháp chỉ áp dụng khi các chỉ số
k
'
là hằng định.
* Với pic có đờng nền bị nhiễu hoặc bị hẹp thì việc xác định chiều cao
pic sẽ dễ dàng và chính xác hơn việc xác định diện tích pic.
1.4.Tổng quan PHƯƠNG PHáP QUANG PHổ HấP THụ UV-VIS
1.4.1. Cơ sở lý thuyết[2],[3],[4],[6]
1.4.1.1. Định luật Lambert-Beer
Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có bớc sóng và cờng độ I
o
qua dung

tan bị phân ly, mà độ hấp thụ của dạng phân tử và dạng ion phân ly không nh
nhau.
- Do tạo dimer, trimer: sản phẩm trùng hợp này lại có độ hấp thụ khác dạng
đơn phân tử.
+ Do phản ứng các chất lạ:
- Chất lạ có thể tạo phức với các ion trong dung dịch: để đề phòng hiện t-
ợng này xảy ra, ngời ta dùng mẫu trắng có thành phần nh dung dịch, chỉ thiếu
chất cần định lợng.
- Sự hấp thụ của chất lạ, thuốc thử cũng có thể ảnh hởng tới kết quả định l-
ợng. Vì vậy trong quá trình làm phản ứng tạo màu, phải chú ý tới điều kiện
phản ứng và các thành phần tham gia phản ứng.
1.4.1.4. Một số đại lợng thông dụng[
a/ Độ truyền qua (T-Transmittance):
Độ truyền qua (hay còn gọi là độ thấu quang) đặc trng cho độ trong suốt
(về mặt quang học) của dung dịch, đợc định nghĩa:
T =
0
t
I
I
= 10
-

Cl
Thờng T tính ra phần trăm (%). Một chất có T=1(hay100%), nghĩa là hoàn
toàn không có hấp thụ ánh sáng, ngời ta nói chất đó hoàn toàn trong suốt.
b/ Độ hấp thụ (A-Absorbance):
13
Độ hấp thụ (hay còn gọi là mật độ quang) đợc định nghĩa :
A = lg

là một hằng
số.
d/ Hệ số hấp thụ phân tử (

):
Hệ số hấp thụ phân tử, hay còn gọi là hệ số tắt mol là độ hấp thụ của dung
dịch có nồng độ 1M/l, dùng cốc đo có bề dày1cm.
Cũng nh
1
1%
cm
E
, với một chất xác định, trong những điều kiện đo xác định
(, dung môi, nhiệt độ,...)

là một hằng số.
Giữa
1
1%
cm
E
và

có mối liên hệ

=
1
1%
10
cm

2
(cho một vạch sáng có bớc sóng xác định).
Dùng một mẫu chuẩn, đo và điều chỉnh để tìm sai số.
Dùng một kính lọc Holmium (có các giá trị
max
xác định cho trong tài
liệu )để kiểm tra lại máy.
Dùng dung dịch K
2
CrO
4
, K
2
Cr
2
O
7
tinh khiết quang phổ pha thành dung
dịch có nồng độ chính xác. Đo phổ tìm các giá trị
max
và tìm A
max .
1.4.2.2. Phơng

pháp so sánh
Đo độ hấp thụ A
x
, A
c
của dung dịch thử có nồng độ C

không đợc
chênh lệch nhau quá nhiều. Nồng độ dung dịch này càng gần nhau, kết quả
càng chính xác.
Ngoài ra còn có các kỹ thuật định lợng khác nh: phơng pháp đờng chuẩn,
phơng pháp thêm đờng chuẩn, phơng pháp chuẩn độ đo quang, phơng pháp định
lợng hỗn hợp theo nguyên tắc cộng phổ .
15