TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
TRẦN DUY PHƯƠNG

ĐÁNH GIÁ SỰ KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH
CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus)
NUÔI Ở VÙNG NƯỚC LỢ TỈNH TRÀ VINH - BẾN TRE

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

MỤC LỤC
Trang
Mục lục i
Danh sách bảng iii
Danh sách hình iv
PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ 1
PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1. Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản 3
2.2. Các bệnh thường xuất hiện trên cá tra 3
2.3. Đặc điểm của vi khuẩn Edwardsiella và Aeromonas 4
2.4. Các nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn 5
2.5. Thuốc kháng sinh dùng trong nuôi trồng thủy sản. 7
2.6. Các nhóm kháng sinh thường sử dụng trong nuôi trồng thủy sản 9
PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11
3.1. Vật liệu nghiên cứu 11
3.1.1 Đối tượng 11
3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 11
3.2. Hóa chất và môi trường 11
3.2.1 Hóa chất 11
3.2.2 Môi trường 11
3.3. Phương pháp nghiên cứu 11
3.3.1 Phương pháp điều tra 11
3.3.2 Phương pháp thu mẫu 12
3.3.3 Phương pháp định danh vi khuẩn 12
3.3.4 Phương pháp lập kháng sinh đồ 12
3.3.5 Phương pháp xác định MIC 13
PHẦN IV: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 15
4.1 Kết quả điều tra 15
4.1.1 Thông tin chung 15
4.1.2 Thông tin về kỹ thuật nuôi: 16

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Các con đường trao đổi sự kháng thuốc của vi khuẩn giữa động vật
và con người (Prescott ., 2000). 8
Bảng 4.1 Bản đồ địa chính tỉnh Bến Tre và Trà Vinh 15
Hình 4.2 Các loại kháng sinh thường được sử dụng ở Trà Vinh và Bến Tre 18
Hình 4.3 Cá tra bị bệnh mủ gan. 20
Hình 4.4 Cá tra bị bệnh xuất huyết. 20
Hình 4.5 Khuẩn lạc Aeromonas spp phát triển trên môi trường TSA. 20
Hình 4.6 Khuẩn lạc E. ictaluri phát triển trên môi trường TSA 20
Hình 4.7 Vi khuẩn E. ictaluri gram âm, que ngắn 21
Hình 4.8 Vi khuẩn Aeromonas sp gram âm, que ngắn 21
Hình 4.9 Kết quả định danh Aeromonas spp bằng bộ kit API 20E 22
Hình 4.10 Kết quả kháng sinh đồ chủng Aeromonas sp 22
Hình 4.11 Tỷ lệ phần trăm kháng thuốc kháng sinh của các chủng vi khuẩn
Aeromonas sp 23
Hình 4.12 Tỷ lệ phần trăm kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri 25
Hình 4.13 Kết quả MIC của Aeromonas sp ở nồng độ 2 µg/ml 28

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
TÓM TẮT
Mục tiêu của nghiên cứu là đánh giá sự kháng thuốc của hai loại vi khuẩn
Aeromonas spp và Edwardsiella ictaluri bệnh trên cá tra (pangasianodon
hypophthamus) nuôi ở vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh và Bến Tre. Kết quả khảo
sát ban đầu cho thấy 100% số hộ nuôi được phỏng vấn đều sử dụng thuốc
kháng sinh để phòng và trị bệnh. Kết quả phân lập, kiểm tra các chỉ tiêu cơ
bản và định danh bằng bộ kit API 20E xác định được 20 chủng vi khuẩn gây
bệnh trên cá tra trong đó có 12 chủng E. ictaluri và 8 chủng Aeromonas spp.
Để đạt được mục tiêu đề ra, phương pháp lập kháng sinh đồ với 7 loại thuốc
kháng sinh được thực hiện trên 20 chủng vi khuẩn đã tìm được. Kết quả cho

nuôi cá tra như Đồng Tháp, An Giang, gần đây những tỉnh như Sóc Trăng, Trà
Vinh và Bến Tre cũng đầu tư phát triển.
Năm 2007, ngành thủy sản Bến Tre tập trung nuôi các đối tương: tôm
sú, tôm càng xanh, nghêu và cá da trơn. Tổng diện tích nuôi thủy sản năm
2007 là 43.000 ha. Trong đó, diện tích nuôi cá da trơn 230 ha, với năng suất
35.000 tấn. (http://www.fistenet.gov.vn, cập nhật ngày 28/11/2008). Nuôi
trồng thủy sản đang phát triển mạnh trên nhiều khía cạnh về diện tích nuôi,
mức độ thâm canh, loại hình nuôi, đầu tư cơ sở hạ tầng và chế biến sau thu
hoạch. Việc sử dụng thuốc, hóa chất đóng góp không nhỏ cho sự phát triển của
ngành trong việc cải tạo, duy trì chất lượng môi trường nuôi và trong các
trường hợp bệnh bộc phát cần đến sự can thiệp của thuốc-hóa chất. Tuy nhiên,
việc sử dụng và quản lý thuốc, hóa chất trong nuôi trồng thủy sản còn rất
nhiều hạn chế do trình độ của người nuôi và người cung cấp. Điều đó dẫn đến
việc sử dụng không đúng các loại thuốc kháng sinh. Theo điều tra của Mai
Văn Tài (2004) có tới 138 loại kháng sinh đã được sử dụng trong các loại hình
nuôi và sản xuất giống thủy sản ở Việt Nam.
Khi việc sử dụng kháng sinh quá mức, không được kiểm soát để trị
bệnh cho cá, tôm thì một điều tất yếu sẽ xảy ra đó là vấn đề kháng thuốc của
các chủng vi khuẩn gây bệnh đồng thời gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con
người. Và như vậy thì việc phòng và xử lý bệnh cho động vật thủy sản củng
như con người sau này sẽ gặp rất nhiều khó khăn.
Vấn đề kháng thuốc kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh trên
động vật thủy sản từ lâu cũng đã được nhiều tác giả nghiên cứu và đã xác
được nhiều nhóm vi khuẩn phân lập được từ các ao nuôi cá da trơn đã kháng
với nhiều loại kháng sinh như Oxytetracycline, Tetracycline, Ampiciline,
…(Depaola et al, 1995; Matyar et al., 2004; Mohamed Nawaz et al., 2006). Ở
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com

2
Việt Nam sự kháng thuốc kháng sinh của các dòng vi khuẩn phân lập từ các ao


3
PHẦN II
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản
Nghề nuôi trồng thủy phát triển rất mạnh ở nước ta nói chung và ở
Đồng Bằng Sông Cửu Long nói riêng trong thời gian gần đây làm cho môi
trường nuôi ngày càng xấu đi nghiêm trọng, sự bùng phát của dịch bệnh xảy ra
ngày càng nhiều. Sự lan truyền dịch bệnh trong thủy sản đã dẫn đến những
hậu quả nghiêm trọng về kinh tế - xã hội, môi trường và thương mại quốc tế
khó mà tính toán được. Tại Việt Nam, mỗi năm có hàng nghìn hộ dân nuôi
luân canh tôm lúa bị thua lỗ do tôm bị chết, tổng thiệt hại trên 4,5 tỉ đồng,
trong các năm 1995-1997 có khoảng 4.000 trong số 5.000 lồng nuôi cá trắm cỏ
bị bệnh đốm đỏ gây thiệt hại 500.000 USD (Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng
Thủy Sản I., 1998, trích dẫn bởi www.fistenest.gov.vn cập nhật ngày
31/10/2008).
Trong số các bệnh của thuỷ sản thì nguyên nhân chủ yếu là do vi khuẩn
gây ra với những vụ dịch bệnh có qui mô lớn. Thông thường, người ta sử dụng
thuốc kháng sinh để kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh. Do việc sử dụng không
đúng cách và quá nhiều các loại thuốc kháng sinh được sử dụng sai nên đã gây
ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc và tích tụ dư lượng thuốc kháng sinh trong
thịt thuỷ sản. Một nguyên nhân khác gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc
là việc sử dụng các loại kháng sinh với hàm lượng nhỏ trong thức ăn của thuỷ
sản như một chất kích thích sinh trưởng (Mai Văn Tài và ctv., 2004).
Đối với tác nhân gây bệnh là vi khuẩn thì các loài vi khuẩn gây bệnh
cho một số đối tượng nuôi quan trọng mà Việt Nam phải đối mặt đó là Vibrio
harveyi, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas flouresent, Streptococcus sp.,
Edwardsiella tarda, Edwardsiella ictaluri…(Bùi Quang Tề, 2006). Riêng đối
với cá tra một số tác giả đã tìm thấy một số bệnh phổ biến như: bệnh gan thận
mủ do vi khuẩn E. ictaluri, bệnh xuất huyết do vi khuẩn A. hydrophila, A.

Theo điều tra của Trần Anh Dũng (2005), tần số xuất hiện bệnh mủ gan
do Edwadsiella ictaluri gây ra chiếm 61%. Nguyễn Tấn Duy Phong (2008),
tần số này lên đến 93,8% số hộ nuôi cá ở Cần Thơ và An Giang, tỉ lệ cá chết
khi bị bệnh này có thể lên đến 90,0%. Ngoài ra, trên cá tra còn có một số bệnh
như bệnh xuất huyết đốm đỏ xảy ra ở mọi lứa tuổi, tần số 75,0% số hộ nuôi.
Bệnh trắng mang, bệnh vàng da, lồi mắt, nổ mắt có tần số xuất hiện thấp hơn.
2.3 Đặc điểm của vi khuẩn Edwadsiella và Aeromonas
2.3.1 Vi khuẩn Edwadsiella
Edwardsiella thuộc họ Enterobacteriaceae có đặc điểm Gram âm, hình
que mãnh, yếm khí tuỳ tiện, catalase dương, Cytocrom oxidase âm oxy hoá âm
và lên men trong môi trường O/F glucose. Thường gặp hai loài: E. tarda và E.
ictaluri (Bùi Quang Tề, 2006)
Vi khuẩn E. ictaluri được báo cáo đầu tiên vào năm 1979, là tác nhân
gây bệnh viêm ruột nhiễm khuẩn huyết (ESC-Enteris Septicaemia of Catfish)
trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) (Hawke, 1979). Năm 2001, ở Việt Nam
E. ictaluri đã được Fugerson và ctv (2001) phân lập và ghi nhận xuất hiện đầu
tiên trên cá tra bị bệnh mủ gan ở ĐBSCL vào năm 1998 (Fugerson et al.,
2001; Crumlish et al., 2002; Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan,
2007). Ngoài ra, theo Từ Thanh Dung và ctv (2005) vi khuẩn này là tác nhân
gây bệnh mủ gan trên cá tra ở cá tỉnh nuôi cá tra thâm canh như An Giang,
Đồng Tháp, Cần Thơ, sau đó bệnh lan dần sang các vùng nuôi lân cận. Đặt
biệt, trong thời gian gần đây bệnh này cũng đã xuất hiện ở một số tỉnh mới
nuôi cá tra như Bến Tre, Trà Vinh Sóc Trăng…gây thiệt hại lớn cho người
nuôi.
2.3.2 Vi khuẩn Aeromonas
Giống Aeromonas thuộc Aeromonadaceae gồm 2 nhóm: không di động
(A. salmonicada) và di động (A. hydrophyla, A. caviae, và A. sobria). Đặc tính
chung của ba loài vi khuẩn thuộc nhóm di động là vi khuẩn Gram âm, dạng
hình que ngắn, yếm khí tùy tiện. Vi khuẩn Aeromonas di động phân lập từ cá
nước ngọt nhiễm bệnh, thường gặp nhất là loài A. hydrophyla.(Bùi Quang Tề,

từ nuôi quảng canh sang thâm canh. Theo một điều tra của Mai Văn Tài và ctv
(2004) có ít nhất 373 loại thuốc và hóa chất sử dụng trong nuôi trồng thủy sản
thì có 138 loại kháng sinh và Huỳnh Thị Tú và ctv (2006) cho thấy có 74 loại
thuốc và hóa chất được sử dụng trong nuôi tôm, trong đó có 19 loại kháng
sinh. Theo kết quả khảo sát về việc sử dụng kháng sinh ở các nước Châu Á
của Mudd (2003), (Trích dẫn bởi Tangtrongpiros., 2005). cho thấy lượng
kháng sinh các nước sử dụng là khá lớn: Trung Quốc 1.500 tấn, Nhật Bản
1.100 tấn, Hàn Quốc 550 tấn, Thái Lan 420 tấn, Ấn Độ 400 tấn, Philippine
350 tấn, Pakistan 200 tấn, Đài Loan 180 tấn, Malaysia 150 tấn, Bangladesh
100 tấn, Việt Nam 50 tấn và Indonesia 20 tấn.
Các kết quả nghiên cứu đó đã cho thấy sự sử dụng sai rộng rãi các loại
thuốc kháng sinh. Từ đó đã tạo ra nhiều chủng vi khuẩn kháng thuốc.
Miranda et.al (2003) đã tìm ra 25 chủng vi khuẩn khác nhau đã kháng
với Oxytetraxyline từ 4 nông trại nuôi cá ở Chile. Ở ĐBSCL đã phân lập được
169 dòng vi khuẩn từ các ao nuôi thủy sản và thử với 6 loại kháng sinh và kết
quả cho thấy 2% kháng với Chloramphenicol, có 59% dòng vi khuẩn kháng
với 4 hay 5 loại kháng sinh trong đó có Chloramphenicol. Có 34% kháng
nhiều loại kháng sinh như Chloramphenicol, Ampicilline, Tetracycline,
Trimethoprim + Sulfamchoxazole, Nitrofurantion (Nguyễn Thanh Phương và
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com

6
ctv., 2005). Trong thời gian gần đây, Pender et al (2008) đã nghiên cứu sự
kháng thuốc của Aeromonas được phân lập từ môi trường nước của các ao
nuôi cá da trơn, cá chình và trại sản xuất giống ở Hà Lan, kết quả cho thấy sự
kháng thuốc của Aeromonas như sau ampicilin và oxytetracyclin là 100%,
sulfamethoxazole 24%, trimethoprim 3% và ciprofloxacin và chloramphenicol
là 0%.
Depaola et al., (1988) khảo sát sự kháng thuốc kháng sinh Tetracycline
và Oxytetracycline của vi khuẩn Aeromonas gây bệnh trên cá nheo nuôi ở Mỹ

vào mùa xuân thì cao hơn các loài khác (Depaola et al., 1995). Theo một điều
tra của Matyar et.al (2004) sự kháng thuốc của vi khuẩn còn khác nhau tùy
theo vị trí phân lập được chúng. Kết quả từ nghiên cứu cho thấy vi khuẩn phân
lập từ mang của cá thì đã kháng với 7 loại kháng sinh trong khi vi khuẩn phân
lập được trong nội tạng thì chỉ kháng với 5 loại kháng sinh.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com

7
2.5 Thuốc kháng sinh dùng trong nuôi trồng thủy sản.
2.5.1 Tổng quan về kháng sinh
Thuốc kháng sinh là những chất hữu cơ có cấu tạo hóa học phức tạp mà
hiện nay chúng ta mới biết được một số chất, phần lớn chúng do vi trùng, nấm
và xạ khuẩn sinh ra. Có tác dụng diệt hay ngăn cản sự phát triển của các vi
sinh vật gây bệnh và không gây bệnh cho vật chủ (Bùi Quang Tề và ctv.,
2005). Hiện tượng kháng sinh được Alexender Fleming phát hiện từ năm 1928
thông qua phát hiện qua chất penicillin do một loại nấm có tên là penicillium
notatum sản sinh ra. Đến năm 1940 người ta đã sản xuất thành công penicillin,
thử nghiệm trên động vật đã cho kết quả tốt, đến năm 1946 đã sản xuất được
penicillin kết tinh, từ đó đã bắt đầu thời kỳ mới của kháng sinh (Prescott,
2000; Bùi Quang Tề và ctv., 2005).
Việc phát minh ra kháng sinh đã làm thay đổi mang tính cách mạng
trong điều trị các bệnh lý nhiễm trùng. Lúc mới phát hiện chúng được xem
như một loại thần dược để trị bệnh nhiễm khuẩn trên cơ thể người và trên
động vật. Trong nuôi trồng thủy sản, việc sử dụng kháng sinh trong điều trị
bệnh do vi khuẩn, nấm…đã góp phần không nhỏ trong việc tăng năng suất và
sản lượng của ngành. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh như là sử dụng một
con dao hai lưỡi: nếu biết rõ tính chất, tác dụng, dùng đúng bệnh, đúng liều
đúng cách, nó giúp ta trị được nhiều bệnh nguy hiểm mang lại hiệu quả kinh tế
cao. Ngược lại, sử dụng bừa bãi không đúng nguyên tắc sẽ gây ra những hậu

sinh nhất định. Sự kháng thuốc kháng sinh có thể coi như là đặc tính vốn có
hoặc có thể được hình thành của các vi sinh vật này. Có nhiều cách khác nhau
gây ra sự kháng thuốc của vi sinh vật. Có ba cơ chế thường gặp của hiện tượng
đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn: Thay đổi vị trí đích tác động; Thay đổi sự thu
nhận kháng sinh, và bất hoạt kháng sinh (Bùi Kim Tùng, 2001). Ngoài ra, hiện
tượng kháng thuốc có thể xảy ra theo một trong những cơ chế sau đây.
Ø Làm thay đổi mục tiêu tác động của thuốc trên vi khuẩn ví dụ làm thay
đổi protein trên vi khuẩn mà thuốc kháng sinh sẽ bám vào để tác động.
CON NGƯỜI
Bệnh viện, thành
phố, nông thôn

ĐỘNG VẬT
TRÊN CẠN
Cừu, Ngựa, Heo,
Gia Cầm, Bò
Sông, su
ối

Thịt
Chế
biến
Nư
ớc uống

U
ỐNG

HỆ THỰC VẬT
Rau

ồn n
ư
ớc ,
chất thải của
nông trại
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com

9
Ø Vô hiệu hóa thuốc bằng enzyme bêta lactamase.
Ø Làm giảm độ thẩm thấu của màng tế bào vi khuẩn nên thuốc không tác
động được.
2.6 Các nhóm kháng sinh thường sử dụng trong nuôi trồng thủy sản
2.6.1 Nhóm beta-lactamin.
Là nhóm kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn có phổ kháng khuẩn hẹp,
chủ yếu có tác dụng trên vi khuẩn Gram (+) và một ít vi khuẩn Gram (-). Do
màng tế bào của vi khuẩn Gram (-) có tỉ lệ lipit cao nên nó kỵ nước, còn nhóm
β-lactamin phải khuếch tán qua các ống dẫn protein nằm trên bề mặt màng
(Prescott, 2000; Bùi Kim Tùng, 2001). β-lactamin không có ảnh hưởng độc
đối với cơ thể, trừ một số cơ thể có cơ địa dị ứng. Đối với kháng sinh thuộc
nhóm này có thể sử dụng liều cao. Liều độc gấp 7.600 lần so với liều điều trị
(Bùi Thị Tho, 2003). Đại diện của nhóm này thường được dùng trong thủy sản
là Amoxilline, ampicillin (Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Quốc Thịnh, 2005)
Ampicillin
Là thuốc kháng sinh có phổ tác dụng rộng, có tác dụng với mốt số
lượng lớn vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Có thể so sánh ampicillin với các
thuốc có phổ tác dụng rộng như chloramphenicol, tetracyclin…Thuốc có tính
acid, khi ở dạng muối rất dể tan trong nước (Bùi Thị Tho, 2003). Khi được
dùng để điều trị, thuốc phân tán điều trong cơ thể nhưng tập trung nhiều ở gan,
thận, một phần nhỏ ngấm vào dịch não tủy. Thuốc được thải trừ qua thận ở
dạng nguyên thủy (Võ Văn Ninh, 2001) ra môi trường ngoài nên rất dễ gây ra

2.6.3 Nhóm Quinolone
Là nhóm kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn, chúng có tác dụng ức chế
tổng hợp AND. Các thuốc thuộc nhóm này được phát triển qua 2 thế hệ với
phổ kháng sinh và cơ chế kháng khuẩn khác nhau. Thế hệ thứ nhất có phổ
kháng khuẩn hẹp, tác dụng chủ yếu trên vi khuẩn Gram (-). Thế hệ thứ hai có
phổ kháng khuẩn vừa nhanh vừa mạnh, phổ kháng khuẩn được mở rộng trên
vi khuẩn Gram (-) và Gram (+). Các loại kháng sinh thuộc nhóm này là
enrofloxacin, norfloxacin, ofloxacin,ciprofloxacin, oxonilic acid… (Bùi Thị
Tho, 2003).
Trong nuôi trồng thủy sản các kháng sinh thuộc nhóm Quinolone được
sử dụng khá phổ biến trong điều trị bệnh mủ gan do vi khuẩn E. ictaluri như
enrofloxacin, norfloxacin rất có hiệu quả (Từ Thanh Dung và ctv., 2005).
Trong điều trị bệnh phát sáng trên tôm do vi khuẩn Virio sp thì các loại kháng
sinh norfloxacin và oxonilic acid thường được sử dụng (Đỗ Thị Hòa và ctv.,
2005).
2.6.4 Nhóm phenicol
Đây là nhóm kháng sinh có tác dụng kìm khuẩn nhưng cũng có tác
dụng diệt khuẩn trong một số trường hợp bệnh truyền nhiễm với những điều
kiện nhất định và nồng độ cao hơn. Thuốc có tác dụng ức chế vi khuẩn với
nồng độ thấp. hoạt phổ của nó rất rộng, tác dụng trên nhiều loài vi khuân
Gram (+) và Gram (-), vi rút có kích thướt lớn ( Bùi Thị Tho, 2003).
2.6.5 Nhóm Sulphamid (sulfonamide)
Đây là nhóm kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng trên vi khuẩn Gram
(-) và một số vi khuẩn Gram (+). Sulphamid với liều kiềm khuẩn sẽ ức chế sự
sinh sản phát triển của vi khuẩn do thuốc cạnh tranh với acid para
amonozenzoic một yếu tố sinh trưởng cần cho sự phát triển của mọi loại tế bào
trong đó có cả tế bào vi khuẩn (Bùi Thị Tho, 2003).
Các loại thuốc thuộc nhóm này thường được dùng trong thủy sản là
trimethoprim, sulfamethizole và dạng kết hợp để trị bệnh đỏ mỏ, viêm ruột,
xuất huyết, đốm đỏ, trắng đuôi do vi khuẩn gây ra trên cá và phát sáng do vi

2
, giấy test
oxidase, Bộ kit API 20E (BIOMÉRIEUX)
Các loại kháng sinh dùng trong nghiên cứu kháng sinh đồ ): Cefazoline
(CEZ), Chloramphenicol (CHL), Tetracycline (TE), Flofenicol (FFC),
Doxyciline (DO), Streptomycine (SM), Ampiciline (AM). (các đĩa khnág sinh
mua từ Biorad)
Kháng sinh tinh dùng trong xác định MIC: Chloramphenicol,
Oxytetracycline, Streptomycine (nguồn gốc Oxoid).
Các loại dụng cụ và hóa chất cần thiết khác.
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp điều tra
Tiến hành điều tra những hộ nuôi cá tra trên vùng nước lợ ở Trà Vinh
và Bến Tre về tình hình dịch bệnh trên cá và những loại thuốc/hóa chất thường
được dùng để phòng và xử lý khi có bệnh xảy ra bằng các phiếu câu hỏi đã
chuẩn bị trước (phiếu điều tra xem phụ lục 1).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com

12
Địa điểm thu mẫu và điều tra được chọn theo vùng có nuôi thâm canh
cá tra cao ở Trà Vinh và Bến Tre.
Số liệu điều tra được xử lý bằng phần mền Excel.
3.3.2 Phương pháp thu mẫu
Chọn điểm thu mẫu: ao nuôi cá tra thịt thâm canh ở vùng nước lợ hai
tỉnh Trà Vinh và Bến Tre.
Mỗi lần thu 5 con cá tra. Nếu ao bệnh thì thu 3-4 con cá bệnh và 1-2
con cá khỏe. Đồng thời với việc thu mẫu cá phân tích thì cũng cần ghi nhận
thông tin thêm về kỹ thuật nuôi, hiện trường ao nuôi, dấu hiệu bên ngoài, bên
trong của cá (phiếu thu thập thông tin xem phụ lục 2).
Phương pháp thu mẫu cá theo tài liệu của Furones (2001)

13
Vi khuẩn sau khi được phục hồi và tách ròng đến thuần thì tiến hành
kiểm tra kháng sinh đồ.
Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trên đĩa vi khuẩn cho vào ống
nghiệm chứa 10 ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl) đã tiệt trùng. Trộn đều
trên máy voxtec sau đó đem đo trên máy so màu quang phổ ở bước sóng
610nm, điều chỉnh độ đục ở mức OD=0,1 ± 0,02. Khi đó mật độ vi khuẩn
trong ống nghiệm vào khoảng 1x10
8
cfu/ml.
Ø Sau khi đã xác định mật số vi khuẩn thì tiến hành cho vi khuẩn lên
môi trường thạch
Sử dụng tăm bông tiệt trùng nhúng vào dung dịch vi khuẩn, quét đều
lên môi trường thạch MHA. Sau đó để yên khoảng 1 phút rồi dùng pel tiệt
trùng lấy đĩa thuốc kháng sinh đặt vào đĩa Petri sao cho khoảng cách giữa 2
tâm của các đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24 mm và khoảng cách giữa tâm đĩa
kháng sinh với mép đĩa Petri 10-15 mm. Mỗi đĩa Petri (Φ 100 mm) môi trường
đặt tối đa 6 đĩa kháng sinh.
Ø Đọc kết quả
Đo đường kính vòng vô trùng (mm) dựa vào chuẩn đường kính vòng vô
trùng của tài liệu CLSI (2006b) để xác định loại kháng sinh nhạy, trung bình
nhạy và kháng.
3.4.5 Phương pháp xác định MIC
Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn dựa
trên phương pháp pha loãng môi trường loãng (Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI). 2006b), Các bước tiến hành như sau:
Ø Chuẩn bị môi trường-hóa chất
Vi khuẩn được lấy từ tủ âm 80
o
C sau khi rã đông thì được cấy lên môi

tiếp theo.
Nồng độ thuốc sẽ giảm đi một nữa khi cho dung dịch vi khuẩn vào.
Ghi tên thuốc và nồng độ trước khi bắt đầu thí nghiệm.
Ø Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn
Xác định mật số vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng
610 nm và điều chỉnh mật độ vi khuẩn bằng môi trường BHIB (không dùng
nước cất) ở điểm OD = 0,1 ± 0,02 (mật số vi khuẩn khoảng 1x10
8
CFU/ml) rồi
pha loãng xuống 1000 lần để mật độ vi khuẩn còn khoảng 1x10
5
CFU/ml. Sau
đó, mỗi chủng vi khuẩn đều được cấy trên môi trường TSA để kiểm tra sự
thuần chủng và được ủ trong điều kiện với các ống MIC.
Cho 3 ml dung dịch vi khuẩn vào từng ống nghiệm có chứa 3 ml dung
dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau: 0,25; 0,5…1024 µg/ml (cần lắc đều ống
kháng sinh trước khi cho vào ống nghiệm).
Thí nghiệm có 2 đối chứng:
Đối chứng âm: (3 ml BHIB + 3 ml nước muối sinh lý)
Đối chứng dương: (3 ml dung dịch vi khuẩn + 3 ml nước muối sinh lý)
Tất cả các ống nghiệm được ủ ở 28
o
C, trong 20-24 giờ.
Ø Đọc kết quả
Kiểm tra sự thuần chủng của vi khuẩn, nếu có tạp khuẩn thì loại bỏ kết
quả hoặc loạt ống nghiệm của chủng vi khuẩn nào phát triển không liên tục,
làm lại thí nghiệm.
Đọc kết quả bằng cách so sánh độ đục của ống MIC với ống đối chứng
âm và dương.
Giá trị nồng độ MIC được xác định là nồng độ thấp nhất của thuốc

nhiều, khả năng kháng thuốc của các chủng vi khuẩn gây bệnh ngày càng tăng
gây khó khăn trong việc điều trị.
4.1.2 Thông tin về kỹ thuật nuôi
Kết quả điều tra cho thấy diện tích nuôi cá tra trung bình ở Trà Vinh và
Bến Tre là tương đối nhỏ (2.132 ± 975m
2
) hơn so với các tỉnh có truyền thống
nuôi các tra như Cần Thơ và An Giang (15.439 ± 25.436 m
2
) (Nguyễn Tấn
Duy Phong, 2008). Diện tích nuôi của các hộ ở đây còn nhỏ là do nơi đây vừa
mới chuyển đổi từ làm ruộng, vườn sang nuôi cá và hiệu quả mang lại từ nuôi
cá trong thời gian gần đây không cao nên nhiều người dân khu vực này chưa
dám mạnh dạng đầu tư nuôi với diện tích lớn. Bên cạnh đó, diện tích nuôi nhỏ
và đa số các ao nuôi lại nằm giữa các vườn cây ăn trái nên làm cho ao nuôi
kém thông thoáng, không tạo được sự ổn định của các yếu tố môi trường nước
nhất là khi thời tiết thay đổi làm ảnh hưởng đến sức khỏe cá nuôi dẫn đến cá
dễ bị bệnh.
Qua bảng 4.1 cho thấy diện tích nuôi trung bình của các hộ ở Trà Vinh
(1.910 ± 1.009 m
2
) là nhỏ hơn và có sự dao động lớn về diện tích giữa các hộ
nuôi hơn so với Bến Tre (2.483 ± 932 m
2
)
Bảng 4.1 Diện tích mặt nước trung bình của các hộ nuôi
Địa điểm Diện tích trung bình (m
2
)
Trà Vinh 1910,53 ± 1009,34

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com

17
các hộ ở đây là tương đối nhỏ, chi phí đầu tư con giống ban đầu thấp nên họ
thường thả với mật độ cao.
Mật độ nuôi của các hộ dân ở Trà Vinh và Bến Tre là tương đối cao mà
kinh nghiệm và kiến thức về nuôi cá của họ là không cao nên rất dễ dẫn đến ô
nhiễm môi trường nuôi, thường xuyên xuất hiện bệnh trên cá nuôi từ đó dẫn
đến hiệu quả đầu tư thấp.
4.1.3 Thông tin về tình hình dịch bệnh và sử dụng thuốc-hóa chất
Cũng như nhiều hộ nuôi ở các tỉnh khác, các hộ nuôi cá ở Trà Vinh và
Bến Tre đều mua con giống từ cá trại ương cá tra giống ở tại địa phương và
các tỉnh lân cận, 100% số hộ được điều tra đều không có ương cá giống tại nhà
do đó nguồn con giống không ổn định và tỉ lệ hao hụt cao trong quá trình vận
chuyển.
Theo kết quả điều tra 100% hộ nuôi đều sử dụng thức ăn viên trong khi
ở An Giang chỉ có 80% và Cần Thơ 50% (Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008). Tất
cả các hộ nuôi cá ở đây đều dùng thức ăn công nghiệp là do nơi này không có
nguồn thức ăn tự chế hoặc có nhưng giá thành cao sử dụng không kinh tế.
Việc sử dụng thức ăn viên tạo điều kiện dễ dàng cho các hộ nuôi ở đây trong
việc quản lý chất lượng môi trường nước và chủ động được nguồn thức ăn.
Chi phí thức ăn chiếm khoảng 80% tổng chi phí đầu tư nuôi cá, do đó quản lý
tốt nguồn thức ăn và khâu cho ăn sẽ mang lại hiệu quả cao trong nuôi cá, điều
này rất cần thiết cho những tỉnh mới đầu tư nuôi cá như Trà Vinh và Bến Tre.
Thời gian nuôi cá trung bình của cá hộ nuôi ở Trà Vinh và Bến Tre là
6,95 ± 0,55 tháng cao hơn so với thời gian nuôi của các hộ nuôi ở An Giang
6,7 tháng và Cần Thơ 6,9 tháng (Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008). Thời gian
nuôi phụ thuộc vào nhiều yếu tố như kích cỡ con giống ban đầu, dịch bệnh,
thời tiết, giá cả thị trường, trong đó giá cả thị trường ảnh hưởng rất lớn đến
thời gian nuôi. Trong đợt khảo sát và thu mẫu lần này vào thời điểm giá cá