BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
ðẶNG THỊ DỊU
BƯỚC ðẦU NGHIÊN CỨU VI KHUẨN GÂY BỆNH
TRÊN CÁ RÔ PHI VẰN(Oreochromis niloticus) GIỐNG
LỚN NUÔI NƯỚC LỢ TẠI QUÝ KIM HẢI PHÒNG
LUẬN VĂN THẠC SỸ NÔNG NGHIỆP
Chuyên ngành: Nuôi trồng thủy sản
Mã số: 60.62.70
Người hướng dẫn khoa học: TS. Phan Thị Vân
Hà Nội 2012
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ..................................
i
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ..................................
ii
MỤC LỤC
Lời cam ñoan......................................................................................................i
Phương pháp nghiên cứu. ......................................................................16
3.2.1. Thu mẫu.......................................................................................16
3.2.2. Xử lý mẫu trong phòng thí nghiệm. ............................................16
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ..................................
iii
3.2.3. Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn ....................................................17
3.2.4. Cảm nhiễm nhân tạo....................................................................21
3.2.5. Thử kháng sinh ñồ .......................................................................24
3.2.6. Phương pháp xử lý số liệu ...........................................................26
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................27
4.1.
Dấu hiệu bệnh lý bệnh xuất huyết do liên cầu khuẩn Streptococcus ....27
4.2.
Kết quả phân lập vi khuẩn .....................................................................28
4.3.
Kết quả cảm nhiễm nhân tạo..................................................................39
4.4.
Kết quả thử kháng sinh ñồ .....................................................................44
trên kít API 20 Strep và một số phản ứng phụ. ................................30
Bảng 7. Thành phần loài vi khuẩn trên cá rô phi giống lớn bị bệnh xuất
huyết do liên cầu khuẩn Streptococcus ............................................38
Bảng 8. Kết quả cảm nhiễm vi khuẩn gây bệnh trên cá rô phi vằn của 2
lần cảm nhiễm 3 chủng vi khuẩn ñã phân lập ..................................40
Bảng 9. Kết quả thử kháng sinh ñồ..................................................................46
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ..................................
v
DANH MỤC HÌNH
STT
Nội dung
Trang
Sơ ñồ 1: Tác nhân gây bệnh trên cá rô phi ở các giai ñoạn nuôi .......................8
Hình 1. Sơ ñồ nghiên cứu phân lập vi khuẩn...................................................17
Hình 2. Quy trình kít API 20E .........................................................................19
Hình 3. Sơ ñồ gây nuôi cảm nhiễm các chủng vi khuẩn ñã phân lập ..............22
Hình 5. Sơ ñồ bố trí thí nghiệm cảm nhiễm cá lần 2 .......................................24
Hình 6. Cá bị chết, nắp mang, gốc vây xuất huyết, mắt lồi, mật sưng to,
gan xuất huyết, xoang bụng tích dịch. Ảnh nhìn từ trái qua phải
và trên xuống dưới............................................................................28
Hình 7. Vi khuẩn dạng cầu, bắt màu Gram(+) có trong tiêu bản phết tươi
mô gan,thận sau khi nhuộm Gram soi ở vật kính 100X...................28
vii
DANH SÁCH PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Kết quả phân tích Anova
Phụ lục 2: ðường kính vòng vô khuẩn của các vk ở các nông ñộ kháng sinh
Phụ lục 3: Danh sách thuốc kháng sinh cấm sử dụng trong NTTS
Phụ lục 4: Bảng kết quả ñịnh danh bằng kít Api 20 Strep.
Phụ lục 5: Bảng kết quả theo dõi tỉ lệ cá chết sau khi cảm nhiễm.
Phụ lục 6: Hình ảnh quá trình thực hiện ñề tài
NHỮNG CHỮ VIÊT TẮT
TB: Trung bình
tm: Môi trường
tb: Tế bào
ctv: Cộng tác viên
vk: Vi khuẩn
NTTS: Nuôi trồng thủy sản
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ..................................
viii
PHẦN 1. MỞ ðẦU
- Xác ñịnh ñược loài vi khuẩn gây bệnh cho cá rô phi vằn (Oreochromis
niloticus) giống lớn nuôi ở nước lợ.
- ðưa ra ñược biện pháp trị bệnh vi khuẩn trên cá rô phi vằn
(Oreochromis niloticus) giống lớn nuôi ở nước lợ.
1.2 Nội dung nghiên cứu.
- Thu mẫu, phân lập vi khuẩn có mặt trên cá rô phi vằn (Oreochromis
niloticus) giống lớn nuôi ở nước lợ.
- Cảm nhiễm vi khuẩn cho cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus) giống
lớn nuôi ở nước lợ.
- Thử kháng sinh ñồ làm cơ sở cho việc ñưa ra giải pháp trị bệnh do vi
khuẩn trên cá rô phi.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ..................................
2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.
Vài nét về ñặc ñiểm sinh học của cá rô phi vằn Oreochromis
niloticus
2.1.1. Vị trí phân loại.
Cá rô phi vằn thuộc
Lớp cá xương : Actinopterygii
Bộ cá Vược: Perciformes
Họ cá rô phi: Cichlidae
Giống cá rô phi: Oreochromis
Loài rô phi vằn : Oreochromis niloticus
việc nuôi cá rô phi thâm canh ñạt năng suất cao. Với những ñặc ñiểm ưu việt
ñó cá rô phi ñược phân bố và ương nuôi khá rộng rãi trong các vùng miền ở
nước ta.
2.2 Tình hình dịch bệnh và nghiên cứu bệnh vi khuẩn ở cá rô phi trên thế giới
Cá rô phi vằn (O.niloticus) là loài cá ưa nhiệt và có nguồn gốc từ châu
Phi. Xuất phát từ thực tế ñó mà hầu hết các công trình nghiên cứu khoa học
về cá rô phi trong ñó có bệnh trên cá rô phi nói chung và bệnh do vi khuẩn
trên cá rô phi nói riêng ñều xuất phát từ khu vực ñó.
Cá rô phi từ lâu ñã ñược coi là 1 loài cá lý tưởng ñể sử dụng trong nuôi
trồng thủy sản do tính chất tối ưu của nó, tăng trưởng nhanh, thích hợp với
môi trường nước cao và khả năng kháng bệnh. Tuy nhiên, như với tất cả các
loài cá nuôi, cá rô phi vẫn còn bị ảnh hưởng bởi bệnh và dễ bị tổn thương gia
tăng cùng với mật ñộ nuôi.
Vi khuẩn viêm màng não cá rô phi và cá hồi ñã xuất hiện tại Isreal vào
năm 1986, sau ñó nhanh chóng lan rộng ra các quốc gia khác và nó ñã gây tổn
thất kinh tế cho người nuôi cá. Tác nhân gây bệnh viêm màng não ñược xác
ñịnh là vi khuẩn Streptococcus shiloi và Streptococcus difficile (S.shiloi sau
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ..................................
4
ñó ñược xác nhận là S.iniae, còn S.difficile ñược xác nhận là S.agalactiae).
Trong thực tế hầu hết các hệ thống nuôi cá rô phi thâm canh có nhiều nguyên
nhân gây chết cá nuôi, trong ñó tác nhân gây bệnh quan trọng của cá rô phi là
S.iniae, một loại vi khuẩn gram dương gây thiệt hại ñáng kể trong cá rô phi
nuôi thâm canh [20].
Thiệt hại nghiêm trọng xảy ra trên cá rô phi do liên cầu khuẩn
Streptococcus ñã ñược báo cáo tại Mỹ. Tỉ lệ chết cao 75% ñã ñược báo cáo
trong hệ thống nuôi cá rô phi khép kín và tỉ lệ chết 30 – 50% ở cá rô phi nuôi
Số ñiểm thu
S. agalactiae
219
22
S. iniae
75
14
Flavobacterium
columnare
Quốc gia
Indonesia,
Philippin,
Malaysia,
Thái
Lan, Trung Quốc,
40
16
Việt
Tác nhân gây bệnh trên cá rô phi ñã ñược biết ñến ngoài vi khuẩn
Streptococcus còn nhiều tác nhân vi khuẩn khác như vi khuẩn kí sinh nội bào
Francicella sp , Rickettsia, vi khuẩn dạng sợi Flavobacterium columnare, …
Ở ðông Nam Á và Trung Mỹ, cá rô phi bị ảnh hưởng bởi bệnh u hạt gây
ra bởi 1 tác nhân gây bệnh là vi khuẩn kí sinh nội bào ñã ñược xác ñịnh. Các
nghiên cứu sử dụng kỹ thuật phân tử xác ñịnh vi khuẩn này là Francicella sp.
Vi khuẩn này ñược mô tả như là hiếm khí, ký sinh nội bào, không di ñộng,
trực khuẩn gram âm [24] .
Gần ñây bùng phát dịch bệnh gây ra bởi vi khuẩn Francicella sp ở dòng
cá rô phi vằn trong trang trại nuôi cá rô phi ở hệ thống tuần hoàn tại Vương
Quốc Anh cũng ñã ñược nghi nhận. Nghiên cứu ñầu tiên chi tiết chẩn ñoán
rằng vi khuẩn Francicella sp là nguyên nhân gây ra bệnh làm cá rô phi nuôi ở
hệ thống tuần hoàn chết hàng loạt. Với dấu hiệu bệnh lý là cá bị hôn mê, nổi
gần bề mặt, nhợt nhạt, nổi các u hạt, mang và một số ñiểm xuất huyết, xuất
huyết trên và xung quanh vây ngực. Bên trong cá ruột rỗng, túi mật rất lớn.
Kiểm tra các u hạt phát hiện thấy vi khuẩn là trực khuẩn ngắn, gram âm, hiếm
khí, kí sinh nội bào, không di ñộng. Kiểm tra mô bệnh học cho thấy tổn
thương ñược thể hiện ở hầu hết các mô. ðáp ứng của cơ rõ ràng nhất là sự
hình thành các u hạt. Kết quả kiểm tra mô bệnh học và chạy PCR ñã khẳng
ñịnh bệnh phồng rộp do vi khuẩn gây ra trên cá con ở hệ thống nuôi cá rô phi
tuần hoàn ở Vương Quốc Anh là F. Asiatica [24].
Một bệnh do vi khuẩn khác ñược biết ñến gây bệnh trên cá rô phi nuôi
là Columnaris. Bệnh Columnaris ñược xác ñịnh là do vi khuẩn
Flavobacterium columnare. Vi khuẩn F. columnare hình que, gram âm và
phát triển tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng thấp. Bệnh rất dễ lây ñặc biệt
ở giai ñoạn cá bột và cá giống. Cá bị bệnh thường có dấu hiệu tổn thương bên
ngoài như ở da, xói mòn mang và hoại tử. Trong trường hợp cấp tính, các tổn
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ..................................
7
ñộng vật máu lạnh như ếch, cá [31]. Sự phân lập các chủng S.agalactiae từ cá,
người và bò có thể dẫn ñến sự thích nghi kiểu hình trong các vật chủ. Những
yếu tố này có thể là một lý do cho sự ña dạng kiểu hình của chủng vi khuẩn
S.agalactiae. Phát hiện sự truyền nhiễm của những vi khuẩn Streptococcus ở
người xảy ra ở Texas, USA năm 1991 lần ñầu tiên và ca thứ 2 xảy ra ở
Ottawa, canada vào năm 1994 nhưng nguồn gốc lây không ñược xác ñịnh. Từ
tháng 12 năm 1995 ñến tháng 12 năm 1996, 09 bệnh nhân ñã ñược xác ñịnh
nhiễm khuẩn S.iniae . Tuổi trung bình của họ là 69, tỉ lệ nam, nữ là 02:01. Tất
cả các bệnh nhân bị nhiễm trùng xác nhận có nguồn gốc từ châu Á, 08 người
Trung Quốc và 01 người Hàn Quốc. Tất cả các bệnh nhân ñược báo cáo là
làm cá sống, 08 người nhớ lại là họ bị thương ở bàn tay do làm cá. 06 người
nhớ lại là họ chế biến cá rô phi, 03 người không chắc chắn chế biến loại cá
nào. Tất cả những người bị mắc bệnh do vi khuẩn S.iniae ñược báo cáo là bị
thương trong quá trình xử lý chế biến cá tươi [32].
Trên thế giới, ñã có những báo cáo của nhiều tác giả, nhóm tác giả ñưa
ra các loại kháng sinh ñể trị bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá rô phi như:
Thử nghiệm ñiều trị bệnh do vi khuẩn S.iniae gây bệnh cho cá Rô phi
xanh (Oreochromis aureus) ñã ñược thực hiện ở mức ñộ phòng thí nghiệm,
khi sử dụng oxytetracyline với liều lượng 100mg/kg cá trong 14 ngày liên tục
thì tỉ lệ sống cá rô phi là 98% [25].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ..................................
9
Sử dụng Amoxicillin với liều lượng 80mg/kg cá trong 12 ngày liên tục
có hiệu quả trong việc ñiều trị bệnh vi khuẩn S.iniae gây bệnh cho cá rô phi
xanh (Oreochromis aureus), tỷ lệ sống của cá rô phi ñạt 93,75% [26].
B. Austin và D.A. Austin ñã sử dụng 2 loại thuốc kháng sinh là
làm phát sinh dịch bệnh [2].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ..................................
10
Cho ñến nay, chúng ta có một số báo cáo về tác nhân gây bệnh, dấu hiệu
bệnh lý, thời gian xảy ra dịch bệnh trên cá rô phi nuôi ở nước ngọt nhưng cá
rô phi nuôi ở nước mặn thì còn hạn chế.
Cá rô phi nuôi thương phẩm thường gặp một số bệnh do vi khuẩn gây
bệnh xuất huyết và bệnh viêm ruột. Một số ñặc ñiểm của bệnh xuất huyết và
bệnh viêm ruột trên cá rô phi như sau:
Bệnh xuất huyết: tác nhân gây bệnh là do Streptococcus sp. Dấu hiệu bệnh lý
của bệnh là ñầu tiên cá yếu bơi lờ ñờ, kém ăn hoặc bỏ ăn, hậu môn, gốc vây
chuyển màu ñỏ; mắt, mang, cơ quan nội tạng và cơ xuất huyết; máu loãng;
thận, gan, lá lách mềm nhũn, cá bị bệnh nặng bơi quay tròn không ñịnh
hướng, mắt ñục và lồi ra, bụng trương to. Cách phòng trị bệnh xuất huyết trên
cá rô phi bao gồm: Bón vôi (CaO hoặc CaCO3 hoặc CaMg (CO3)2) tùy theo
pH môi trường, liều lượng 1- 2kg/100m3, 2 - 4 lần/tháng. Dùng
Erythromyxin: trộn vào thức ăn từ 3-7 ngày, dùng 2-5 g/100kg cá/ngày. Có
thể phun xuống ao nồng ñộ 1-2 ppm, sau ñó sang ngày thứ 2 trộn vào thức ăn
4 g/100kg cá, từ ngày thứ 3-5 giảm còn một nửa. Thuốc KN-04-12 cho ăn
4g/1kg cá/ngày và 3 - 6 ngày liên tục. Vitamin C phòng bệnh xuất huyết, liều
dùng thường xuyên 20 - 30mg/1kg cá /ngày, liên tục 7-10 ngày [7].
Bệnh viêm ruột: tác nhân gây bệnh là do vi khuẩn Aeromonas hydrophila. Dấu
hiệu bệnh lý tương tự như bệnh xuất huyết và bệnh tích ñiển hình ruột trương
to,chứa ñầy hơi. Có thể dùng một số kháng sinh cho cá ăn như Erythromyxin
hoặc Oxytetramyxin, liều dùng 10 - 12g/ 100 kg cá/ngày ñầu, từ ngày thứ 2-7
liều bằng 1/2 ngày ñầu; thuốc KN-04-12 ñể phòng trị bệnh [7].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ..................................
12
Bảng 2. Tỷ lệ chết của cá rô phi trong các ao nuôi bị dịch bệnh
Tỷ lệ cá bị chết trong các ao nuôi (%)
Stt
ðịa Phương
Thấp nhất
Cao nhất
Trung bình
1
Hà Nội
6,25
100
53,63
2
Hải Dương
0,71
50
8,5
6,85
82,86
42,56
Trung bình
(Nguyễn Viết Khuê, 2010)
Kết quả nuôi cấy và phân lập vi khuẩn cho kết quả ñây là vi khuẩn dạng
cầu khuẩn dạng chuỗi (liên cầu khuẩn), Gram (+), catalase (-), esculin (-). Vi
khuẩn này là Streptococcus sp.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ..................................
13
Bảng 3. Kết quả phân lập vi khuẩn
Kết quả phân lập vi khuẩn
ðịa ñiểm thu
Số mẫu
14
100
0
0
Hải Phòng
14
14
100
0
0
Quảng Ninh
14
14
100
0
74
86,05
0
0
(Nguyễn Viết Khuê, 2010)
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ..................................
14
Bảng 4. Kết quả thử kháng sinh ñồ
Stt
Tên thuốc kháng sinh
ðường Kính vòng vô
khuẩn (cm)
1
Ampicillin
1,43± 0,8
2
Sunfamethoxazol/Trimethoxazol
1,50± 0,3
8
Emequine
1,06± 0,2
9
Erythromycine
2,37± 0,1
10 Rifampin
1,93± 0,1
11 Streptomicine
2,02± 0,1
(Nguyễn Viết Khuê, 2010)
Theo ðồng Thanh Hà và ctv, tác nhân gây bệnh trên cá rô phi ở miền
Bắc Việt Nam là S.agalactiae. Dựa vào ñặc ñiểm chính về hình thái (hiển vi
& siêu hiển vi), các ñặc ñiểm sinh hóa và sinh thái, Streptococcus sp ñược
phân loại là S.agalactiae. Nghiên cứu về hình thái học cho thấy S.agalactiae
những con cá có dấu hiệu của bệnh do vi khuẩn. Tổng số mẫu thu 150 con.
Nhằm ñánh giá, xác ñịnh nhanh và chính xác tác nhân gây bệnh có ñịnh
hướng cho việc xác ñịnh nguyên nhân gây chết cho cá rô phi vằn giống nuôi ở
nước lợ và từ kết quả ñó tập trung vào tác nhân chính, rút ngắn thời gian
nghiên cứu tôi ñã kiểm tra nhanh các tiêu chí ký sinh trùng, nấm gây bệnh và
nhuộm gram các tiêu bản mô các cơ quan ñích ñể kiểm tra sự có mặt của vi
khuẩn.
Kiểm tra ký sinh trùng theo phương pháp của Bùi Quang Tề (2007).
Kiểm tra nấm áp dụng theo phương pháp nghiên cứu nấm của K. Hatai và
S.S. Kubota, 1989.
3.2.2. Xử lý mẫu trong phòng thí nghiệm.
Sau khi mẫu cá bệnh ñược ñưa về phòng tiến hành xử lý ngay:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ..................................
16
Copyright: Tài liệu đại học ©