ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để chọn mẫu dịch não tuỷ
cho phân lập virut do muỗi truyền từ bệnh nhân
có hội chứng não cấp ở miền bắc việt nam
Phan Thị Ngà, Mary B. Crabtree*
Viện Vệ sinh dịch tễ trung -ơng (VSDTTƯ), Hà Nội
*Trung tâm kiểm soát bệnh tật, Fort Collins, Colorado
virut, kỹ thuật này nhạy nh-ng chỉ có thể ứng
I. Đặt vấn đề
dụng để định loại sự hiện diện vật liệu di
Trong những năm gần đây, có rất nhiều
truyền của những virut đã biết [8, 9, 10].
căn nguyên virut gây HCNC mới đ-ợc phát
Trong thực tế vật liệu di truyền của nhiều virut
hiện, hoặc mới thấy xuất hiện ở những vùng
nh- là một túi cóp nhặt (grap-bags), nó có
tr-ớc đây ch-a có sự l-u hành của những
đ-ợc một số gen từ vật chủ của nó cũng nh-
virut này ví dụ nh- virut Hendra, virut viêm
có đ-ợc một số gen từ những virut khác. Do
não Nhật bản (VNNB) ở Australia, virut Nipah
vậy vật liệu di truyền của nhiều virut trong các
ở Malaysia, virut West Nile ở Mỹ [6, 8]. ở Việt
họ khác nhau trong phần lớn các tr-ờng hợp
Nam theo số liệu thống kê, hàng năm có
rất khác nhau, nh-ng trong một số tr-ờng
khoảng 2000 - 3000 tr-ờng hợp bị HCNC,
hợp lại t-ơng tự nh- nhau về trình tự của vật
nh-ng cho đến nay mới xác định đ-ợc virut
liệu di truyền [3, 5]. Nên có giả thiết rằng: kết
VNNB, virut đ-ờng ruột là căn nguyên, số
quả xác định d-ơng tính từ mẫu bệnh phẩm

virut Arbo mới đ-ợc phát hiện ở Việt nam 2002, còn 1 chủng ch-a định loại đ-ợc.
15
TCNCYH 30 (4) - 2004
Tế bào muỗi Aedes Albopictus dòng
II. Vật liệu và ph-ơng pháp
C6/36, môi tr-ờng nuôi tế bào Eagle Minimun
2.1. Vật liệu:
Essential Medium (EMEM) có 10 % huyết
Mẫu bệnh phẩm: 53 mẫu DNT của bệnh
thanh bê bào thai.
nhân HCNC đ-ợc lấy ở Viện Nhi trung -ơng
Máy PCR, các trang thiết bị, sinh phẩm
trong tháng 4 và tháng 5 năm 2003, các mẫu
hoá chất và vật liệu cần thiết khác.
DNT đ-ợc xác định không có kháng thể IgM
2.2. Ph-ơng pháp:
kháng VNNB.
Tách chiết ARN của virut từ DNT bằng bộ
Sử dụng mồi đột biến một số nucleotit
sinh phẩm QIAamp theo h-ớng dẫn của bộ
(denegenate primer) để tăng độ nhậy của kỹ
sinh phẩm.
thuật RT-PCR: Với nhóm virut do muỗi truyền
sử dụng cặp mồi của virut nhóm Alpha, Flavi,
Kỹ thuật RT-PCR thực hiện theo h-ớng
Bunya. Với nhóm virut tiềm tàng sử dụng cặp
dẫn của sinh phẩm.
mồi của nhóm virut Herpes. Với nhóm virut
Phát hiện vật liệu di truyền của virut trong
lây truyền qua đ-ờng tiêu hoá, tiếp xúc, sử

phút, đọc kết quả bằng máy đọc Polaroid
Takara Bio Inc, Nhật Bản.
theo nguyên lý hoá phát quang
(Chemilluminescence).
Bảng 1. Kết quả xác định căn nguyên virut gây HCNC, 2003
bằng kỹ thuật RT-PCR với mồi của 3 nhóm virut

Mồi của nhóm virut

Số mẫu

xét nghiệm
Số mẫu

d-ơng tính

%

Do muỗi truyền 53 8 15,09
Virut tiềm tàng 53 7 12,96
Lây qua đ-ờng tiêu hoá, tiếp xúc 53 1 1,88

16
TCNCYH 30 (4) - 2004VN105 VN89 VN82 VN81 VN79 Neg. Pos. 1 Kb
Trong số 53 mẫu DNT của bệnh nhân năm Có 8/53 (15,09 %) mẫu d-ơng tính với mồi
2003 đ-ợc xác định không có kháng thể IgM của nhóm virut do muỗi truyền (nhóm virut
kháng virut VNNB, ứng dụng kỹ thuật RT- Bunya), có 7/53 (12,96 %) mẫu d-ơng tính với

03CSF25
03VN82
+ (Weak band) D-ơng tính VNNB
03CSF62
03VN89
+ (Weak band) D-ơng tính VNNB
03CSF78
03VN99
+ (Weak band) D-ơng tính Ch-a xác định
03CSF85
03VN105
+ (Weak band) D-ơng tính VNNB Hình 1: Kết quả định loại virut phân lập đ-ợc với cặp mồi đặc hiệu với virut VNNB
17
TCNCYH 30 (4) - 2004
Thử nghiệm phân lập virut bằng tế bào muỗi với mồi đặc hiệu với virut VNNB, những mẫu
C6/36 từ các mẫu DNT đ-ợc xác định d-ơng âm tính đ-ợc kiểm tra với mồi đặc hiệu của
tính bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi của virut nhóm Alpha, virut nhóm Bunya và virut
nhóm virut do muỗi truyền, kết quả phân lập Arbo mới phát hiện ở Việt Nam 2002. Kết quả
đ-ợc 7 chủng virut từ 7 mẫu DNT. Virut VNNB xác định có 5 chủng là virut VNNB, có 1
trong n-ớc nổi tế bào gây nhiễm đ-ợc phát chủng là thuộc nhóm genotyp của virut Arbo
hiện bằng kỹ thuật ELISA-Sandwich với mới phân lập ở Việt Nam năm 2002, còn 1
kháng thể đặc hiệu kháng virut VNNB, xác chủng virut ch-a định loại đ-ợc, không có
định 5 mẫu d-ơng tính, 2 mẫu âm tính bằng mẫu nào d-ơng tính với mồi của virut nhóm
kỹ thuật này. Những mẫu d-ơng tính đ-ợc Alpha và virut nhóm Bunya.
kiểm tra và xác dịnh bằng kỹ thuật RT-PCR

1 Kp Pos. VN 76 VN 99 Neg. 100 bp

Mặt khác kỹ thuật PCR cũng có những Việt Nam năm 2002, 1 chủng ch-a định loại
giới hạn nhất định vì nó không định loại đ-ợc đ-ợc.
toàn bộ thành phần virut, nên kết quả xác
Lời cảm ơn:
định d-ơng tính bằng kỹ thuật RT-PCR
không thể thay thế đ-ợc kết quả phân lập
Đề tài thực hiện tại CDC Fort Collins,
virut.
Colorado và Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung
Ương.
Với giả thiết kết quả xác định d-ơng tính
bằng kỹ thuật PCR từ mẫu bệnh phẩm là
Tập thể tác giả xin trân trọng cảm ơn:
đồng nghĩa với nhận định có vật liệu di truyền
- Sự hỗ trợ của nhóm Pathogen Discovery
của virut trong mẫu; nh-ng nếu phân lập virut
Group, CDC Atlanta về việc trợ giúp kỹ thuật
từ những mẫu bệnh phẩm này, khả năng
và sinh phẩm để phát hiện vật liệu di truyền
phân lập đ-ợc virut rất cao. Kết quả phân lập
của virut nhóm Herpes, Adeno và Entero.
đ-ợc 7 chủng virut từ 7 mẫu DNT đ-ợc xác
- GS. Kouichi Morita về việc cung cấp sinh
định d-ơng tính bằng kỹ thuật RT-PCR trong
phẩm cho kỹ thuật RT-PCR để phát hiện vật
nghiên cứu này là một minh chứng cho nhận
liệu di truyền của virut Nipah, virut VNNB,
định trên. Mặc dù 7 mẫu DNT đ-ợc xác định
virut Arbo mới.
d-ơng tính bằng kỹ thuật RT-PCR với mồi

Isolation of a newly recognized Alphavirus Waqar M. A. 1994. Detection of West Nile
from mosquitoes in Vietnam and evidence for and Japanese Encephalitis viral genome
human infection and disease. Am. J. Trop. sequences in cerebrospinal fluid from acute
Med. Hyg. 53(1): 100 -104. encphalitis cases in Karachi, Pakistan.
Microbiol Immmunol, Vol. 38: 827 -830.
5. Hazelton P. R., Gelderblom H. R. 2003.
Electron Microscopy for rapid diagnosis of 8. Parida M., Posadas G., Inoue S.,
infection agents in Emergent situation. Hasebe F. and Morita K. 2004. Real-Time
Emerging Infectious Diseases. Vol. 9, No. 3: Reverse Transcription Loop-Mediated
294 303. Isothermal Amplification for Rapid Detection
of West Nile virus. Journal of clinical
6. Mackenzie J.S., Johansen C.A.,
Microbiology, Vol. 42 No. 1: 257 263.
Ritchie S.A., Van den Hurk A.F & Hall R.A.
2002. Japanese encephalitis as an emerging 9. Read S. J., Jeffery K. J. M. anh
virus: The emergence and spread of Bangham C. R. M. 1997. Aseptic Meningitis
Japanese encephalitis virus in Australia. In and Encephalitis: The Role of PCR in the
Current topics in microbiology and
diagnostic laboratory. Journal of Clinical
Immunology: Japanese encephalitis and
Microbiology : 691 696.
West Nile virus infections, Vol. 267: 49-73.
10. Weidmann M., Rudaz V., Nunes M. R.
Edited by J.S. mackenzie, A.D. Barret & V.
T., Vasconcelos P. F. C. and Hufert F. T.
Deubel. Berlin: Springer-Verlag.
2003. Rapid detection of human pathogenic
7. Igarashi A., Tanaka M., Morita K.,
Orthobunyaviruses. Journal of Clinical
Ahmed Akhtar, Ahmed Arsalam, Akram D. S.,