ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
 NGUYỄN THỊ Ý NHI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LIMONOID
CỦA LÁ CÂY NEEM AZADIRACHTA INDICA A. JUSS
TRỒNG Ở NINH THUẬN Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 62 44 27 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH-2012

1

MỞ ĐẦU
Họ Xoan (Meliaceae) có khoảng 50 chi với khoảng 550 loài, trong đó chi
Azadirachta là một chi thuộc họ này, nó có ba loài là A. indica, A. excelsa và
A. siamensis. A. indica là một loài được biết đến nhiều nhất trong chi với tên
thường gọi là cây neem (neem Ấn Độ). Hai loài còn lại thường thấy ở khu vực
Đông Nam Á là A.excelsa hay còn gọi là marrango (cây neem Philippine) và

50
<100 µM, thấp hơn giá trị tương ứng của
chất đối chứng dương khá nhiều.
BỐ CỤC LUẬN ÁN
Luận án gồm 138 trang với 4 chương, 20 bảng, 13 sơ đồ, 63 hình, 106 tài
liệu tham khảo và 156 phụ lục các phổ. Trong đó, mở đầu 1 trang, tổng quan
38 trang, thực nghiệm 11 trang, kết quả và thảo luận 73 trang, kết luận 2 trang,
kiến nghị 1 trang, danh mục công trình 1 trang, tài liệu tham khảo 11 trang.
NỘI DUNG LUẬN ÁN

Chƣơng 1. TỔNG QUAN
- Tổng hợp các tài liệu nghiên cứu về thành phần hóa học và dược tính của
loài Azadirachta indica của các tác giả trong và ngoài nước.
- Trình bày ngắn gọn các quá trình sinh tổng hợp các limonoid trong
Azadirachta indica
- Trình bày sơ lược về bệnh đái tháo đường.
Chƣơng 2. THỰC NGHIỆM
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Lá cây neem được thu hái tại xã Phước Dinh, huyện Ninh Phước, Tỉnh
Ninh Thuận, Việt Nam vào tháng 03/2006.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
Trong phần này, chúng tôi trình bày ngắn gọn về các hóa chất và thiết bị
sử dụng trong phần thực nghiệm của luận án.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Điều chế các loại cao

3

Lá neem được sấy khô, xay nhỏ, và ngâm với dung môi metanol, thu được

sinh ra giữa mẫu có ức chế và mẫu không có ức chế để xác định % ức chế.
Xây dựng đường biểu diễn giữa % ức chế và nồng độ chất ức chế để xác định
chỉ số IC
50
.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Khảo sát cấu trúc hóa học

4

Từ cao etyl acetat, chúng tôi đã cô lập và xác định được 20 hợp chất
triterpenoid, trong đó có 16 hợp chất được xác định là mới. Do khuôn khổ có
hạn, chúng tôi xin chỉ trình bày phần biện luận cấu trúc các hợp chất mới.
3.1.1. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 39
Hợp chất NEEM 39 có dạng bột vô định hình, không màu. Khối phổ
phân giải cao HR-ESI-MS cho mũi ion giả phân tử ở m/z 543,3292
[M+H
2
O+Na ]
+
tương ứng với công thức phân tử C
30
H
46
O
6
(M 502,3294).
Phổ
1
H- và

O
H-H COSY

O
CH
3
H
O
OH
CH
3
CH
3
H
H
OAc
CH
3
CH
3
H
H
H
C C
CH
2
CH
3
O
H

25
+
110,0 (c 0,36; MeOH). Nhiệt độ nóng chảy là 170-174
o
C.
Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS cho mũi ion giả phân tử ở m/z
515,3405 [M+H]
+
tương ứng với công thức phân tử C
31
H
46
O
6
. Phổ
1
H- và
13
C-
NMR của NEEM 33 (bảng 3.3) cho thấy NEEM 33 cũng là một limonoid với
sự hiện diện của một nhóm senecioyloxy ở C-1, hai nhóm OH tự do ở C-3 và
C-7 và nhánh vòng tetrahydrofuran trên C-17. Cấu trúc của hợp chất NEEM

5

33 được đề nghị là 3-desacetyldeoxyazadirachtolid. Hóa học lập thể của hợp
chất NEEM 33 được xác định qua phổ NEOSY (hình 3.6).

O
OH

H
1
3
5
6
7
8
9
10
11
13
14
15
17
20
18
19
21
22
28
29
30

Hình 3.5. Một số tương quan trong phổ HMBC Hình 3.6. Một số tương quan trong
và COSY của hợp chất NEEM 33 phổ NOESY của NEEM 33
Bảng 3.3. Số liệu phổ
1
H-NMR của hợp chất NEEM 39, NEEM 33 và NEEM 31

(Ghi chú: Sen: senecioyl, Meth: Methacryloyl)

limonoid với sự hiện diện của liên
kết eter giữa C-6 với C-28, một
nhóm OH tự do ở C-1, nhóm acetyl
ở C-3, một nhóm methacryloyloxy
ở C-7 và nhánh vòng
tetrahydrofuran trên C-17. Cấu trúc
hợp chất NEEM 31 được xác định
và gọi tên 1-desenecioyl-7-O-
methacryloyldeoxyazadirachtolid.
Hóa học lập thể của hợp chất
NEEM 31 được xác định qua phổ
NOESY ( hình 3.8).

O
O
H
H
O
OH
CH
3
CH
3
H
H
AcO
CH
3
CH
3

21
22
23
28
29
30

Hình 3.8.Một số tương quan trong
phổ NOESY của NEEM 31

Bảng 3.4. Số liệu phổ
13
C-NMR của hợp
chất NEEM 39, NEEM 33 và NEEM 31

(Ghi chú: Sen: senecioyl, Meth: Methacryloyl)

7

3.1.4. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 25
Hợp chất NEEM 25 t hu được dưới dạng tinh thể hình kim, không
màu. [α]
D
25
-359,4 (c 0,22; MeOH). Nhiệt độ nóng chảy 168,0-171,0
o
C
Khối phổ phân giải cao (+)-HR-ESI-MS cho mũi ion giả phân tử ở m/z
529,3210 [M+H]
+

H
OH
OSen
CH
3
CH
3
H
H
OH
CH
3
CH
3
H
H
H
H
H
H
O
H
1
3
4
5
6
7
8
9

32
H
44
O
8
. Phổ
1
H- và
13
C-NMR (bảng 3.6) cho thấy NEEM 3 là một limonoid với sự hiện diện của
liên kết eter giữa C-6 với C-28, một nhóm acetyl ở C-3, nhóm methacryloyl ở
C-7 và nhánh vòng lacton trên C-17.
Cấu trúc của hợp chất NEEM 3 được
xác định là 1-desenecioyl-7-O-
methacryloylazadirachtolid. Hóa lập
thể của hợp chất NEEM 25 được xác
định qua phổ NOESY (hình 3.13).
O
O
H
H
O
OH
CH
3
CH
3
H
H
AcO

14
15
17
18
19
20
21
22
23
28
29
30

Hình 3.13. Một số tương quan trong
phổ NOESY của NEEM 3

8

Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất NEEM 25 và NEEM 3

(Ghi chú: Sen: senecioyl; Meth: methacyoyl, Ac: acetyl)

3.1.6. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 19
Hợp chất NEEM 19 có dạng tinh thể hình kim, không màu. [α]
D
25
-
39,0 (c 0,4; MeOH). Nhiệt độ nóng chảy: 221,0 - 223,0
o
C.

phổ NOESY (hình 3.15).

O
OH
AcO
O
OCH
3
O C C
O
CH
2
CH
3
HMBC
H-H COSY

O
O
H
H
O
OH
CH
3
CH
3
H
H
AcO

C.
Phổ (+)-HR-ESI-MS cho tín hiệu ở m/z 587,3604 [M+H]
+
cho thấy
NEEM 20 có công thức phân tử C
34
H
51
O
8
. Phổ
1
H- và
13
C-NMR (bảng 3.7 và
3.8) cho thấy hợp chất NEEM 20 có nhiều điểm giống với hợp chất NEEM
19 ở trên. Sự khác biệt được nhìn thấy là sự biến mất của các tín hiệu của
nhóm methacryloyloxy ở vị trí C-7, thay vào đó là nhóm senecioyloxy. Cấu
trúc hóa học của hợp chất NEEM
20 được xác định là 23-metoxy-1-
desenecioyl-7-O-
senecioyldeoxyazadirachtolid. Cấu
hình tương đối của các tâm thủ tính
trong hợp chất NEEM 20 được xác
định qua phổ NOESY (hình 3.17).

O
O
H
H

phổ NOESY của NEEM 20

10

3.1.8. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 22
Hợp chất NEEM 22 có dạng
tinh thể hình kim, không màu.
[α]
D
25
- 38,0 (c 0,41; MeOH).
Nhiệt độ nóng chảy 265,0 - 267,0
o
C. Phổ (+)-HR-ESI-MS cho tín
hiệu ở m/z 635,3623 [M+H]
+
cho
thấy NEEM 22 có công thức phân
tử C
38
H
50
O
8
. Phổ
1
H- và
13
C-NMR
(bảng 3.7 và 3.8) cho thấy hợp chất

H
H
H
H
H
H
C
OCH
3
O
H
H

Hình 3.19. Một số tương quan trong
phổ NOESY của NEEM 22
Bảng 3.8. Số liệu phổ
13
C-NMR của hợp
chất NEEM 19, NEEM 20 và NEEM 22

(Ghi chú: Meth: methacryloyl; Sen: senecioyl;
Cin: cinnamoyl)

11

3.1.9. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 1
Hợp chất NEEM 1 có dạng tinh thể hình kim, không màu. [α]
D
25
-

H-H COSY
HMBC
O
O
OH

H
CH
3
H
H
O
O
H
O
CH
3
CH
3
H
3
C
H
H
MeOOC
HO
H
H
COOMe
H

kết eter giữa C-7 với C-15, hai nhóm metyl ester ở C-12 và C-28, một nhóm
hydroxyl tự do ở C-6 và nhánh vòng 21-hydroxy-23-butenolid trên C-17. Hóa
lập thể của hợp chất NEEM 17 được xác định qua phổ NOESY (hình 3.24).

12 O
O
O
CO
2
Me
MeO
2
C
O
OH
HO
HMBC
H-H COSY

H
CH
3
H
H
O
O
H

29
H
36
O
10
.

13

Phổ NMR của hợp chất NEEM 4
cho thấy NEEM 4 cũng là một limonoid
với sự hiện diện của một nhóm ceton
liên hợp dạng 2-en-1-on, hai nhóm
metyl ester ở C-12 và C-28, một liên kết
eter giữa C-7 với C-15 và nhánh vòng
trên C-17 là vòng γ-hydroxybutenolid với nhóm metoxy gắn ở vị trí C-23.
Hợp chất NEEM 4 được đặt tên là 23-metoxyazadirachtolid A.
3.1.12. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 35
Hợp chất NEEM 35 có dạng tinh thể hình kim, không màu. [α]
D
25
+
452 (c 0,2; MeOH). Nhiệt độ nóng chảy: 192,0 - 195,0
o
C.
Khối phổ phân giải cao (+)-HR-ESI-MS cho mũi ion giả phân tử ở m/z
489,2157 [M+H]
+
tương ứng với công thức phân tử C
26

O
OHOH
HMBC
H-H COSY

H
CH
3
H
H
O
O
H
O
CH
3
CH
3
H
3
C
H
H
MeOOC
HO
H
H
OH
H
H

chảy: 191,0 - 193,0
o
C
Khối phổ phân giải cao (+)-HR-
ESI-MS cho mũi ion giả phân tử ở m/z
489,2160 [M+H]
+
tương ứng với công
thức phân tử C
26
H
32
O
9
(M 488, 2046).
Các phổ
1
H-,
13
C-, DEPT-NMR (bảng
3.12) của hợp chất NEEM 14 tương tự
như phổ của hợp chất NEEM 35 đã được xác định cấu trúc ở trên, cho thấy
NEEM 14 cũng là một pentanortriterpen mở vòng C với phần nhánh là vòng
γ-hydroxybutenolid như NEEM 35 và được đặt tên là nimbandiol B .
Bảng 3.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất NEEM 35 và NEEM 14

3.1.14. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 30

MeO
2

(M 594,2676).
Số liệu phổ
1
H và
13
C-NMR (bảng 3.13) cho thấy hợp chất NEEM 30 cũng là
một limonoid mở vòng C với sự hiện diện của nhóm ceton liên hợp dạng 2-en-
1-on trong vòng A, liên kết eter giữa C-7 với C-15, hai nhóm metyl ester ở C-
12 và C-28 và cấu trúc phần nhánh trên C-17 được xác định là 20,22-
dihydroxy-21,23-dimetoxytetrahydrofuran. Đề nghị cấu trúc của hợp chất
NEEM 30 là 20,22-dihydroxy-21,23-dimetoxynimbinolid. Hóa học lập thể
của NEEM 30 cũng được xác định thông qua phổ NOESY (hình 3.30).

O
MeOOC
O
OH
O
H
3
CO OCH
3
OH
OH
COOCH
3
H-H COSY
HMBC

H

3

Hình 3.29. Một số tương quan trong phổ Hình 3.30. Tương quan NOESY
HMBC và COSY của hợp chất NEEM 30 của hợp chất NEEM 30
3.1.15. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 28
Hợp chất NEEM 28 có dạng tinh thể hình kim, không màu. [α]
D
25

+100,0 (c 0,38; MeOH). Nhiệt độ nóng chảy: 114,0-116,0
o
C.

O
MeOOC
O
OH
O
H
3
CO OCH
3
OH
OH
OH
HMBC
H-H COSY

H
CH

H

Hình 3.31. Một số tương quan trong phổ Hình 3.32. Tương quan NOESY
HMBC và COSY của hợp chất NEEM 28 của hợp chất NEEM 28
Phổ HR-ESI-MS xác định hợp chất NEEM 28 có công thức phân tử
C
28
H
41
O
11

từ mũi ion giả phân tử ở m/z 553,2699 [M+H]
+
. Phổ
1
H- và
13
C-
NMR (bảng 3.13) của hợp chất NEEM 28 cho thấy NEEM 28 cũng là một

16

limonoid mở vòng C tương tự như hợp chất NEEM 30, trong đó nhóm metyl
ester ở C-28 gắn trên C-4 trong NEEM 30 được thay thế bằng nhóm hydroxyl
tự do. Hợp chất NEEM 28 được xác định là 20,22-dihydroxy-21,23-
dimetoxynimbandiol. Hóa lập thể của hợp chất NEEM 28 được xác định
thông qua phổ NOESY (hình 3.32).
Bảng 3.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất NEEM 30 và NEEM 28


nimbadiolactam-23. Hóa lập thể của hợp chất NEEM 34 được xác định qua
phổ NOESY (hình 3.34).

N
MeOOC
O
O
O
OH
OH
H
HMBC
H-H COSY

H
CH
3
H
H
O
O
H
NH
CH
3
CH
3
H
3
C

Hình 3.35. Số liệu phổ
1
H- và
13
C-NMR đặc trưng của hợp chất limonoid
không mở vòng C và hợp chất mở C.
3.2.2. Nhận diện đặc điểm đặc trƣng trên vòng A
3.2.2.1. Vòng A có nối đôi liên hợp dạng en-on

Hình 3.37. Số liệu phổ
1
H- và
13
C-NMR đặc trưng của hợp chất
có nối đôi liên hợp dạng en-on trong vòng A.
3.2.2.2. Vòng A không có nối đôi liên hợp dạng en-on
Nếu vòng A không có nối đôi liên hợp dạng en-on thì ở vị trí C-1 và C-3
sẽ gắn với nhóm thế -OR (R là các gốc: H-, acetyl-, tigloyl-, senecioyl-,
methacryloyl-, iso-valeroyl-, cinnamoyl- …) (hình 3.35, hình 3.36).
3.2.3. Nhận diện liên kết eter
Nếu hợp chất có liên kết eter giữa C-6 với C-28:Trên phổ
1
H-NMR cho
thấy có mũi đôi AB đặc trưng của H
2
-28 ở vùng 3,26-4,10 ppm với hằng số
ghép J=7,5 Hz, tương ứng với tín hiệu carbon C-28 ở # 77,8-79,5 ppm (hình
3.38). đây là dấu hiệu đặc trưng để nhận diện liên kết eter giữa C-6 với C-28

19

Hình 3.42. Số liệu phổ
1
H- và
13
C-NMR đặc trưng cho các hợp chất
có nhánh vòng γ-hydroxybutenolid
Như vậy, trên phổ
1
H-NMR, proton gắn trên carbon hemiacetal –O-CH-
OH có giá trị δ
H
ở khoảng 6,0 ppm, tương ứng với carbon hemiacetal ở 96,0-

20

97,0 ppm. Tín hiệu của carbon carbonyl (ở C-23 trong vòng 21-hydroxy-23-
butenolid hoặc ở C-21 trong vòng 23-hydroxy-21-butenolid) có giá trị δ
C

thường ở khoảng 171,0-171,7 ppm. Sự khác nhau của các tín hiệu proton
olefin H-22 và hai tín hiệu carbon olefin C-20 và C-22 (hình 3.42) trên vòng
γ-hydroxybutenolid trong hai trường hợp chính là dấu hiệu giúp phân biệt
vòng 21-hydroxy-23-butenolid và vòng 23-hydroxy-21-butenolid trên C-17.
3.3. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC
Các cao chiết gồm cao eter dầu hỏa, cao etyl acetat, cao butanol, cao
metanol và các hợp chất tinh khiết cô lập từ cao etyl acetat được đem thử
nghiệm hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase trên ống nghiệm. Hoạt tính ức


:
50 (Ghi chú: Pđ: phân đoạn, sđ: sơ đồ)
Bảng 3.18. IC
50
c chất phân lập từ cao etyl acetat. 22

Nhận xét kết quả thử nghiệm trên các cao: khi tiến hành thử nghiệm
trên các cao eter dầu hỏa, etyl acetat và cao butanol, kết quả cho thấy cao etyl
acetat và cao butanol có hoạt tính và được xác định giá trị IC
50
lần lượt là
144,95 µg mL
-1
và 196,57 µg mL
-1
. Ngoài ra, khi tiến hành thử nghiệm trên
hai phân đoạn A
4
và A
5
của cao etyl acetat, chúng tôi nhận thấy hai phân đoạn
này có khả năng ức chế enzym α-glucosidase mạnh hơn cao etyl acetat nhiều
lần. Từ các kết quả thử nghiệm khả năng ức chế enzym α-glucosidase trên các

C-

23

NMR, DEPT-NMR, COSY, HSQC, HMBC, NOESY, LC-MS và HR-ESI-
MS. Các hợp chất triterpen cô lập từ lá neem được sắp xếp theo từng nhóm:
Protolimnoid

Tetranortriterpenoid: các hợp chất tetranortriterpenoid hay còn gọi là
limonoid gồm hai nhóm chính là limonoid không mở vòng C, limonoid mở
vòng C. Trong đó, các limonoid không mở vòng C có mạch nhánh là vòng
tetrahydrofuran, vòng lacton, còn limonoid mở vòng C có mạch nhánh là
vòng γ-hydroxybutenolid, cụ thể gồm:
- Limonoid không mở vòng C



4.2. KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
- Tiếp tục khảo sát cao butanol của lá neem.
- Tiến hành thử nghiệm khả năng ức chế việc tăng đường huyết sau bữa ăn
trên chuột của cao etyl acetat và trên các hợp chất tinh khiết đã cô lập được.
- Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học trên các hợp chất tinh khiết như hoạt
tính hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, hoạt tính kháng ung thư…