Hà Nội - 2007


- Bộ môn Vi sinh vật, Khoa Sinh học, Trờng Đại học Khoa học Tự
nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
- Viện Vi sinh vật & Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội Ngời hớng dẫn khoa học:
1. GS.TS. Phạm Văn Ty
2. GS.TS. Nguyễn Lân Dũng Phản biện 1: GS. TS. Nguyễn Đình Quyến
Phản biện 2: PGS. TS. Lê Gia Hy
Phản biện 3: PGS. TS. Nguyễn Xuân Thành Luận án sẽ đợc bảo vệ trớc Hội đồng cấp chấm luận án tiến
sĩ họp tại
Vào hồi giờ ngày tháng năm 200
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Th viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm Thông tin- Th viện, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Mở đầu
Tính cấp thiết của luận án
Nấm men sinh bào tử bắn là một nhóm nấm men lớn, tồn tại trong
tự nhiên, chiếm 14/90 chi nấm men với số lợng loài chiếm hơn 1/10
tổng số loài nấm men đã biết (khoảng 80 loài). Đây là nhóm vi sinh vật

học của nhóm nấm men này.
Bố cục luận án:
Luận án bao gồm phần mở đầu, tổng quan, đối tợng và phơng
pháp nghiên cứu, kết quả và thảo luận, kết luận và kiến nghị, danh mục
công trình, tài liệu tham khảo, phụ lục. Luận án có 22 bảng, 45 hình, 109
tài liệu tham khảo.
Nội dung luận án
Chơng 1. Tổng quan
1.1. Đa dạng sinh học và đa dạng vi sinh vật
1.2. Đại cơng về nấm men
1.3. Các chỉ tiêu đợc sử dụng trong phân loại nấm men
1.4. Nấm men sinh bào tử bắn
Chơng 2. Đối tợng v phơng pháp nghiên cứu
1. Chủng nấm men: Các chủng nấm men sinh bào tử bắn đợc phân
lập theo phơng pháp của Nakase và Takashima (1993).
2. Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá: Chủ yếu theo mô tả của
Yarrow (1998). Khả năng đồng hoá nitơ đợc xác định theo phơng
pháp của Nakase và Suzuki(1986). Vitamin đòi hỏi bắt buộc đợc xác
định theo Komagata và Nakase (1967).
3. Các đặc điểm hoá phân loại (chemotaxonomy): Tách chiết, tinh
sạch và xác định ubiquinon theo phơng pháp của Nakase và Suzuki
(1986). Xyloza trong tế bào đợc phân tích bằng sắc ký lớp mỏng hoặc
sắc ký lỏng cao áp theo Nakase và cộng sự (1976).
4. Phân tích trật tự và xây dựng cây phát sinh: Trình tự của ADNr 18S,
ITS bao gồm 5,8S và D1/D2 của 26S đợc xác định theo Takashima và
Nakase (1999), Kurtzman và Robnnet (1997). Sử dụng chơng trình
computer CLUSTAL X ver 1.83 của Thompson và cộng sự (1994).
Các trình tự tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng
loại đợc lấy từ dữ liệu của DDBJ, EMBL và Gen Bank. Cây phát sinh
đợc xây dựng theo Kimura (1980) sử dụng phơng pháp của Saitou

lợng
chủng

Xyloza
trong
tế bào

Ubiquinon
chủ yếu
Hình
dạng
bào tử
bắn
Bào
tử
đính
có
cuốngChi Lớp
39 + Q-10 Đối
xứng
-
Bullera
5 + Q-10 Đối
xứng
Urediniomycetes

2

-

Q-10
dài,
cong
lỡi
liềm

-

Tilletiopsis

Ustilaginomycetes
Có 39 chng nấm men thuc chi Bullera đợc c trng bi
khun lc mu trng n hi vng, sinh sn bng bo t bn dng i
xng v bng bo t ny chi, cha xyloza trong t bo v ubiquinon
ch yu l Q-10. Có 5 chủng có các đặc điểm: chứa xyloza trong tế
bào, Q-10 là ubiquinon chủ yếu, sinh sản bằng bào tử bắn dạng đối
xứng, bào tử đính có cuống và tế bào nảy chồi. Đây là các đặc điểm đặc
trng cho chi Kockovaella. Có 34 chủng nấm men đợc đặc trng bởi
khuẩn lạc có màu hồng, cam đến đỏ, sinh sản bằng bào tử bắn dạng
không đối xứng, không chứa xyloza trong tế bào và có ubiquinon chủ
yếu là Q-10 những chủng này thuộc chi Sporobolomyces. Có 5 chủng
nấm men đợc đặc trng bởi khuẩn lạc có màu hồng, cam, sinh sản bằng

loài thuộc nhánh Bullera huiaensis và B. mrakii của dòng (lineage)
Cryptococcus luteolus. Nhóm này phân lập đợc ở 15/20 mẫu lá, chứng
tỏ chúng rất phổ biến ở Vờn quốc gia Cúc Phơng. Nhóm B gồm 1
chủng cùng nhánh với Cryptococcus podzolicus (không sinh bào tử bắn).
Nhóm C gồm 4 chủng nằm ở vị trí gần với B. coprosmaensis, B. sinensis
và C. luteolus. Nhóm D gồm 4 chủng có quan hệ họ hàng gần với nhóm
B. variabilis. Nhóm E gồm 2 chủng hợp thành nhóm với các loài B.
pseudoalba, B. unica, C. cellulolyticus và C. laurentii của dòng
Bulleromyces.
Để xác định chính xác vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh
bào tử bắn đến loài chúng tôi tiến hành nghiên cứu kết hợp giữa các
đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và so sánh các trình tự ADNr ITS
và 26S (D1/D2).
Berbee và đtg (1995); Fell và đtg (2000); James và đtg (1996) đã sử
dụng trình tự vùng ITS nh một thớc đo phân loại hữu ích nhờ vùng
này có tỷ lệ sai khác cao hơn hẳn so với các vùng ADNr 18S và 26S
Fell và đtg (2000); Sugita và đtg (1999) cũng đã chứng minh rằng tỷ lệ
nucleotit trong vùng ITS ở cùng một loài thờng khác nhau nhỏ hơn 1%. Hình 3.3. Vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh bào tử bắn
thuộc chi Bullera với các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào
trình tự ADNr 18S
Udeniomyces puniceus (D31658)
Trimorphomyces_papilionaceus (AB085808)
K
ockovaella thailandica
VY-68 (AB110694)
B
ullera pseudoalba (D31660)

ullera variabilis (D31654)
B
ullera pseudovariabilis (AF453290)
VY-128
100
100
99
VY 2
B
ullera setariae (AB118875)
89
100
51
100
B
ullera oryzae (D31652)
Cryptococcus luteolus (AB032641)
B
ullera kunmingensis (AF325169)
91
VY-132
85
B
ullera sinensis (D78328)
VY-77
B
ullera derxii (D78329)
50
90
88

79
B
ullera
p
seudoschimicola
(
AF314997
)
72
77
72
76
83
52
VY-45
VY-105
VY-145
VY-57
VY-60
VY-140
VY-86
B
uller
VY-55
VY-142
VY-65
VY-103
a anomala (AF453291)
54
B

54
61
50
52
93
68
86
61
54
0.02
Nhóm A
Nhóm B
Nhóm C
Nhóm E
91
Nhóm D
Cả 39 chng nấm men thuộc chi Bullera c xác định trình t
ADNr các vùng ITS (480- 580 bp). Cây phả hệ c xây dng da
trên trình t ADNr các vùng ITS ca các chng nghiên cứu so sánh vi
38 loi thuc các chi Auriculibuller, Bullera, Bulleromyces, Calathella,
Cryptococcus, Dioszegia. Trên cây phả hệ, 39 chủng nấm men nghiên
cứu cũng nằm rải rác trong 5 nhóm nh ở cây phả hệ của ADNr 18S ở
các dòng Bulleromyces và C. luteolus của lớp Hymenomycetes.
Hiện nay, ngày càng có nhiều dữ liệu về đoạn D1/D2 của ADNr
26S của nấm men đã đợc gửi vào GenBank và càng có nhiều ngời
sử dụng các số liệu này trong phân loại nấm men. Fell và đtg (2000);
Kurtzman và Robnett (1997, 1998); Sugita và Nishikawa (2003) chứng
minh rằng các chủng nấm men có tỷ lệ nucleotit khác nhau lớn hơn
1% sẽ thuộc các loài khác nhau.
Tất cả 39 chng nấm men thuộc chi Bullera c xác nh trình t

phân loại của nhóm này cần thực hiện lai ADN genom.

Nhóm nhỏ A4: chủng VY-50 sai khác ADNr với các loài đã biết
10,1 27,4% ở vùng ITS và 1,4-3.8 % ở 26S (D1/D2). Các đặc điểm
sinh lý sinh hoá giữa VY-50 và các loài đã biết sai khác nhiều. VY-50
thuộc loài mới.
Nhóm nhỏ A5: gồm các chủng VY-45, VY-57, VY-105, VY-139 và
VY-145 đợc xếp vào cùng một loài vì sự sai khác giữa chúng ở mức độ
ADNr rất nhỏ 0-0,2% ở vùng ITS và 26S (D1/D2), ngoài ra các đặc điểm
sinh lý sinh hoá giữa chúng cũng tơng tự nhau. Năm chủng này sai
khác với B. pseudoschimicola 0,5-0,7 % trong vùng ITS và 0- 0,5 % ở
26S (D1/D2). Các đặc điểm sinh lý sinh hoá cũng tơng tự khi so sánh
với B. pseudoschimicola. Các chủng VY-45, VY-57, VY-105, VY-139
và VY-145 thuộc loài Bullera pseudoschimicola.
Nhóm nhỏ A6: gồm 3 chủng VY-60, VY-86 và VY-140. Ba chủng
này tơng đồng về trình tự ADNr ITS, sai khác 0,2-0,5 % ở 26S
(D1/D2) nên chúng thuộc cùng loài. ADNr của 3 chủng nghiên cứu sai
khác 20,0-24,9 % ở vùng ITS và 3,5-5,5 % đoạn D1/D2 với các loài đã
biết. Vì vậy 3 chủng VY-60, VY-86 và VY-140 thuộc một loài và là
loài mới.
Nhóm nhỏ A7: gồm 3 chủng VY-55, VY-65 và VY-142 sai khác
ADNr 0,3- 0,7 % trong vùng ITS và 26S (D1/D2), và sai khác với các
loài đã biết 25,5-28% trong vùng ITS và 3,7-5,5 % đoạn D1/D2. Các
chủng VY-55, VY-65 và VY-142 là các loài cha biết. Cần xác định
vị trí của 3 chủng này thông qua lai ADN genom.
Nhóm B: sự sai khác về trình tự ADNr của chủng VY-112 với
Cryptococcus podzolicus đủ lớn để khẳng định VY-112 là loài mới
(8,7 % ở vùng ITS và 5% ở đoạn D1/D2).
Nhóm C: gồm 3 nhóm nhỏ
Hai chủng VY-132 và VY-144, tơng đồng về trình tự ADNr vùng

Lai ADN genom
Thí nghiệm lai ADN genom đợc thực hiện giữa các chủng
nấm men cha xác định rõ vị trí phân loại với các chủng nghiên cứu hoặc
với chủng chuẩn có quan hệ gần nhất.
Nhóm A có 3 nhóm nhỏ A2, A3 và A7.
Nhóm nhỏ A2 có hai chủng VY-42 và VY-75 đợc chọn làm
đại diện để thực hiện lai ADN. Kết quả ghi ở bảng 3.9 cho thấy tỷ lệ
bắt cặp ADN của chúng rất cao (92-93 %), hai chủng VY-42 và VY-
75 thuộc cùng một loài.
Nhóm nhỏ A3, gồm 5 chủng chia làm đôi là VY-5, VY-23, VY-
103 và VY-21, VY-69, chúng sai khác nhau 18-19 bp ở ADNr vùng
ITS và 4-5 bp ở đoạn D1/D2, tỷ lệ G+C cũng khác nhau 2,5 %. Hai
chủng VY-5 và VY-69 đợc chọn để lai cùng chủng chuẩn Bullera
nakasei JCM 13329. Kết quả ghi ở bảng 3.9 cho thấy cả 3 chủng này
có tỷ lệ bắt cặp ADN thấp 16,3- 48,8 %, vì vậy chúng thuộc 3 loài
khác nhau. VY-5 và VY-69 là 2 loài mới khác nhau.
Nhóm nhỏ A7 gồm 3 chủng VY-55, VY-65 và VY-142, khác với
các loài đã biết, nhng khác nhau 4 bp ở ADNr cả 2 vùng ITS và
D1/D2. Kết quả lai cho thấy chúng thuộc cùng một loài (tỷ lệ bắt cặp
ADN 72,3 - 93,1%).
Bảng 3.9. Kết quả lai ADN genom của các chủng nấm men nghi ngờ
là loài mới thuộc nhóm A chi Bullera
Tỷ lệ ADN bắt cặp (%)
Nhóm A2 Nhóm A3 Nhóm A7 Chủng

Tỷ lệ
G+C

genom bắt cặp rất cao 95,2-100 %, giống nh kết quả tơng đồng về
trình tự ITS và D1/D2. Trái lại chúng có tỷ lệ bắt cặp ADN thấp với
Cryptococcus luteolus, là loài không sinh bào tử bắn (24-35%). Có thể
nhận định VY-48 và VY-104 là cùng một loài và là loài mới.
Nhóm D. Lai ADN genom đợc thực hiện giữa các chủng VY-63, VY-
118 và chủng chuẩn B. panici JCM 11819. Kết quả lai của 3 chủng
khẳng định rõ VY-63 và VY-118 là cùng một loài và khác hẳn với B.
panici vì có tỷ lệ bắt cặp ADN thấp (13,1-16,5%) và khác xa ở tỷ lệ G+C
(8,3 %). VY-63 và VY-118 là một loài (bảng 3.10).
Nhóm E. Chủng VY-68 và chủng chuẩn B. pseudoalba JCM 5290 đợc
lai ADN với nhau. Tỷ lệ bắt cặp ADN của chúng rất thấp 12-14 % đã
khẳng định VY-68 là loài mới.
Bảng 3.10. Kết quả lai ADN genom của các chủng nấm men nghi
ngờ là loài mới của các nhóm C, D và E thuộc chi Bullera
Tỷ lệ ADN bắt cặp (%)
Nhóm C Nhóm D Nhóm E

Chủng

Tỷ lệ
G+C
(Mol%)
VY-
48
VY-
104
JCM
3689
VY-
63

bào tử bắn; sự tạo thành khuẩn ty thật và khuẩn ty giả; các đặc điểm
sinh lý sinh hoá: khả năng lên men, khả năng đồng hoá 46 nguồn
cacbon, khả năng đồng hoá 6 nguồn nitơ, nhiệt độ giới hạn cao nhất cho
sinh trởng, vitamin bắt buộc, cơ chất tạo thành giống tinh bột, phản
ứng mầu với xanh Diazoni B, phân giải urê, tách axít béo, hoá lỏng
gelatin, sinh trởng trên môi trờng chứa 50% glucoza; các đặc điểm
hoá phân loại nh thành phần C+G của ADN, hệ thống ubiquinon chủ
yếu và sự tồn tại xyloza trong tế bào. Tên chủng chuẩn, nguồn gốc và
mã số của 2 nơi lu giữ ở Việt Nam và Nhật Bản.
3.2.3. Vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh bào tử
bắn thuộc chi Kockovaella
Để xác định vị trí phân loại của các chủng phân lập thuộc chi
Kockovaella, chúng tôi tiến hành đọc trình tự ADNr 18S, vùng ITS,
26S đoạn D1/D2 và nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các
chủng nấm men. Những chủng cha xác định rõ vị trí phân loại sẽ tiến
hành lai ADN genom.
Có 5 chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi Kockovaella:
VY-61, VY-67, VY-125, VY-127 và VY-137. Trình t gần 1800
nucleotit của ADNr 18S ca 5 chng nấm men c xác nh. So sánh
tng ng vi trình t ca các loi có quan h h hng gn, bng
chng trình Blast.
Cây phả hệ c xây dng da trên trình t ADNr 18S ca 5 chng
nghiên cứu vi 26 loi thuc các chi Bullera, Cryptococcus, Fellomyces,
Fibulobasidium, Filobasidiell, Kockovaella và Trimorphomyces (Hình
3.6). Quan sát trên cây phả hệ, 5 chủng nghiên cứu nằm rất gần với nhóm
Fellomyces sichuanensis, F. chinensis, F. lichenicola và K. schimae.
0.01

Hình 3.6. Vị trí phân loại của 5 chủng nấm men sinh bào tử bắn
thuộc chi Kockovaella với các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào

K
ockovaella barringtoniae_ AB052631
94
K
ockovaella machilophila_ AB005479
K
ockovaella phaffii_AB005481
51
83
F
ellomyces thailandicus_ AB044804
F
ellomyces ogasawarensis_ AB001035
F
ellomyces distylii_AB001036
F
ellomyces lichenicola_ AB032661
F
ellomyces chinensis_AB032660
K
ockovaella schimae_AB005482
75
F
ellom
y
ces sichuanensis AB032662
VY-125
VY-127
VY-137
VY-67

có trình tự ITS tơng đồng, sai khác với VY-127 và VY-137 là 9 bp
(1,6 %). Chủng VY-127 sai khác với VY-137 là 12 bp (2,1 %). Từ
những kết quả này có thể sắp xếp 5 chủng nghiên cứu thuộc 4 loài
khác nhau và khác với các loài đã biết.
Trình t ADNr 26S đoạn D1/D2 (600 bp) c xác nh. Cây phả
hệ c xây dng giữa 5 chng nghiên cứu vi 27 loi thuc các chi
Auriculibuller, Bullera, Cryptococcus, Fellomyces, Kockovaella và
Sterigmatosporidium. Quan sát trên cây phát sinh chủng loại cho thấy
5 chủng nghiên cứu nằm rất gần nhau và tách hẳn một nhánh cùng
Kockovaella schimae. So sánh trình tự ADNr đoạn D1/D2 cũng khẳng
định điều này: 5 chủng nghiên cứu sai khác nhau 2-5/591 bp (0,3-
0,8 %), sai khác với Kockovaella schimae 3-5/591 bp (0,5-0,8 %) và
sai khác với các loài có quan hệ gần khác 6-12/591 bp (1,0-2,0 %).
Từ những kết quả phân tích trình tự ADNr 18S, vùng ITS và
D1/D2 26S của 5 chủng nấm men thuộc chi Kockovaella cha thể
khẳng định đợc vị trí phân loại của chúng. Muốn biết chắc chắn
chúng có phải là loài mới không cần phải thực hiện lai ADN genom.
Kết quả ghi ở bảng 3.14 cho thấy chủng VY-61 có tỷ lệ bắt cặp
ADN thấp với các chủng nghiên cứu khác (15-35 %) và rất thấp với
các loài có quan hệ gần (2-22 %). Hai chủng VY-67 và VY-125 có tỷ
lệ bắt cặp với nhau cao (84-93 %), nhng thấp với các loài nghiên cứu
khác 28-47 %, và cũng thấp với các loài có quan hệ gần (3-30 %).
Chủng VY-127 có tỷ lệ bắt cặp ADN thấp với các chủng nghiên cứu
khác (15-47 %) và cũng thấp với các loài có quan hệ gần (2-39 %).
Chủng VY-137 có tỷ lệ bắt cặp ADN thấp với các chủng nghiên cứu
khác (25-47 %) và rất thấp với các loài có quan hệ gần (21-26 %). Từ
các kết quả nghiên cứu đã khẳng định VY-67 và VY-125 thuộc một
loài mới, VY-61, VY-127 và VY-137 thuộc 3 loài mới khác.
Bảng 3.14. Kết quả lai ADN genom giữa các chủng nghiên cứu
thuộc chi Kockovaella với các loài có quan hệ họ hàng gần

VY-
125
53.6 35 93
100
28 44 9 5 9 9 30

VY-
127
54.1 33
ND
47
100
30 10 12 3 8 39

VY-
137
53.5 31
ND
47 25
100
8 8 1 6 14
K. schimae
JCM
10051
52.8 16
ND
17 10 26
100
14 5 8 46
F. distylii

ND, không có số liệu
Mô tả loài mới thuộc chi Kockovaella.
Có 5/5 chủng nấm men sinh bào thử bắn thuộc chi Kockovaella
đợc xếp vào 4 loài mới. Bốn chủng chuẩn đại diện cho các loài là:
VY-61, VY-125, VY-127 và VY-137. Các chủng chuẩn đợc mô tả
bằng tiếng Latin và tiếng Việt gồm các đặc điểm hình thái, nuôi cấy;
các đặc điểm sinh lý sinh hoá; các đặc điểm hoá phân loại; tên chủng
chuẩn, nguồn gốc và mã số của 2 nơi lu giữ ở Việt Nam và Nhật Bản.
3.3. sự đa dạng của nấm men sinh bào tử bắn ở Vờn
quốc gia cúc phơng
Từ 20 mẫu lá cây thu thập ở Vờn Quốc gia Cúc Phơng, đã
phân lập đợc 151 chủng nấm men, trong đó có 121 chủng sinh bào tử
bắn. Các chủng nấm men sinh bào tử bắn đợc phân lập trên 100% số
mẫu lá thu thập và chiếm 80,13 % số chủng phân lập. Trong số 85
chủng đợc lựa chọn để nghiên cứu, 44 chủng thuộc lớp
Hymenomycetes gồm 2 chi Bullera (39 chủng) và Kockovaella (5
chủng). Có 39 chủng thuộc lớp Urediniomyces gồm 2 chi Bannoa (5
chủng), Sporobolomyces (34 chủng). Hai chủng còn lại ở chi Tilletiopsis
thuộc lớp Ustilaginomyces.
Trong luận án này, chúng tôi mới thực hiện nghiên cứu sâu đợc
44 chủng thuộc lớp Hymenomycetes đã cho thấy sự đa dạng loài rất
phong phú của Vờn Quốc gia Cúc Phơng.
Số lợng chủng nấm men là loài mới thuộc lớp Hymenomycetes
trên mẫu lá cây thu thập ở Vờn Quốc gia Cúc Phơng rất phong phú,
chiếm 70,4 % số lợng các chủng nghiên cứu. Điển hình trên lá cây Mù
u, (Calophyllum membranaceum) 4/6 chủng nấm men sinh bào tử bắn
thuộc loài mới, lá cây Bời lời (Litsea euosma) và Thăng mộc núi
(Anadendrum montanum) 3/4 chủng thuộc loài mới. Lá cây Tình hoa
đẹp (Eranthemum pulchellum) và Shimastoglottis calyptrata chứa 3/3
chủng thuộc loài mới. Chỉ có 3 mẫu lá (15%) là không tìm thấy nấm

Tỷ
lệ
(%)
1
Bullera mrakii
5 11,4 12
Bullera sp. 4*
2 4,5
2
Bullera sp. 1*
5 11,4 13
Bullera sp. 5*
1 2,3
3
Bullera sp. 2*
3 6,8 14
Bullera sp. 6*
2 4,5
4
Bullera sp. 3*
2 4,5 15
Bullera sp. 7*
1 2,3
5
B. cuulongensis**
1 2,3 16
Bullera japonica
1 2,3
6
B.pseudoschimicola

bào tử bắn thuộc chi Bullera
3.4.1. Khả năng sinh enzym ngoại bào
Ba mơi chín chủng nấm men sinh bào tử bắn đợc nuôi trong
môi trờng YM dịch thể, pH 6, trên máy lắc 220 vòng/phút, ở 20
0
C
trong 5 ngày. Ly tâm thu dịch trong, nhỏ vào các lỗ khoan trên môi
trờng đã chứa cơ chất (Tinh bột, CMC, cazein, kitin, Tween 80), đặt
trong tủ ấm 30
0
C. Sau 24 giờ, xác định vòng phân giải cơ chất. Kết quả
ghi ở hình 3.9 cho thấy khả năng phân giải các cơ chất của 39 chủng
nấm men là khác nhau. Trên cơ chất tinh bột và kitin, số chủng có hoạt
tính enzym mạnh chiếm 15%, đây cũng là tỷ lệ lớn vì nấm men chủ
yếu chỉ sử dụng đờng cho sinh trởng, khả năng sinh enzym ngoại
bào rất ít. Với cơ chất là CMC, số chủng có hoạt tính enzym mạnh
chiếm 8%. Trong khi đó trên Tween 80 và cazein, số lợng chủng
không sinh enzym phân giải các cơ chất chiếm 13 và 33 %, không có
chủng nào có hoạt tính enzym mạnh. Đa số các chủng đều có hoạt tính
enzym trung bình, đờng kính vòng phân giải cơ chất 10 <D-d <20
mm chiếm 41 -72 % số chủng.

1
0%
2
41%
3
44%
4
15%
1
0%
2
41%
3
26%
4
33%
Amylaza
Kitinaza
Xenlulaza
Lipaza
Proteinaza
2- Hoạt tính enzym trung bình: 10 <D-d <20 mm; 4- Không sinh enzym: D-d = 0 mm

Hình 3.9. Khả năng sinh enzym ngoại bào của 39 chủng nấm men
sinh bào tử bắn thuộc chi Bullera

Trong năm loại cơ chất trên, cả 39 chủng nấm men đều sinh ít
nhất 3 loại enzym. Điều này càng làm sáng tỏ thêm cho câu hỏi về môi
trờng sống các chủng nấm men này trong tự nhiên, chúng c trú trên
bề mặt lá cây và phân giải các cơ chất có trên bề mặt lá làm nguồn

enzym của 3 chủng nấm men trên môi trờng YM, pH6-7, nhiệt độ 20-
25
o
C, thời gian 6 ngày.

Kết luận
1. Từ 20 mẫu lá cây thu thập ở Vờn Quốc gia Cúc Phơng, đã phân
lập đợc 151 chủng nấm men, trong đó có 121 chủng sinh bào tử
bắn. Các chủng nấm men sinh bào tử bắn đã phân lập đợc trên
100% số mẫu lá thu thập và chiếm đến 80,13 % số chủng nấm
men phân lập.
2. 85 chủng lựa chọn nghiên cứu đợc xếp vào 5 chi dựa vào các
đặc điểm hoá phân loại (ubiquinone chủ yếu, sự tồn tại của
xyloza trong tế bào) và các kiểu sinh sản. Lớp Hymenomycetes
có 44 chủng, gồm 2 chi Bullera (39 chủng) và Kockovaella (5
chủng). Có 39 chủng thuộc lớp Urediniomycetes gồm 2 chi
Bannoa (5 chủng), Sporobolomyces (34 chủng). Hai chủng còn
lại thuộc chi Tilletiopsis lớp Ustilaginomycetes.
3. Trong số 44 chủng thuộc lớp Hymenomycetes, dựa vào phơng
pháp phân loại sinh học phân tử (trình tự ADNr 18S, vùng ITS,
26S đoạn D1/D2, tỷ lệ G+C, và lai ADN genom) đã phân loại
đợc 21 loài, 5 loài thuộc các loài đã biết (23,8 %), còn 16 loài
thuộc các loài mới (76,4%). Có 9 loài mới đợc đặt tên là
Bullera cuulongensis, B. nhoquanica, B. haininhensis, B.
ninhbinhensis, B. hoabinhensis, Kockovaella litseae, K.
cucphuongensis, K. vietnamensis, K. calophilli đã và đang công
bố, sáu loài còn lại sẽ đợc công bố trong thời gian tới.
4. Tất cả 39 chủng nấm men thuộc chi Bullera đều có khả năng
phân giải ít nhất 3 cơ chất trong số các cơ chất là: tinh bột,
cazein, CMC, kitin và lipit. Chúng đều không sinh chất kháng