Bộ Giáo dục và Đào tạo
Bộ Giáo dục và Đào tạoBộ Giáo dục và Đào tạo
Bộ Giáo dục và Đào tạo
Viện
ViệnViện
Viện
Khoa học và công nghệ Việt nam
Khoa học và công nghệ Việt nam Khoa học và công nghệ Việt nam
Khoa học và công nghệ Việt nam

Viện Công nghệ sinh học

Đinh Thị Thu Hằng
Nghiên cứu Sự phân hủy sinh học
hợp chất hydrocarbon mạch vòng ở
một số vi khuẩn quang hợp tía
phân lập tại việt nam


PGS.TSKH. Trần Văn Nhị
PGS.TS. Trơng Nam Hải
Phản biện 1: GS.TSKH. Phạm Thị Trân Châu, Trờng Đại học Khoa
học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Phản biện 2: GS.TSKH. Lê Don Diên, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông
nghiệp Việt Nam

Phản biện 3: GS.TS. Đặng Thị Thu, Trờng Đại học Bách khoa Hà Nội
Luận án sẽ đợc bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án tiến sỹ cấp Nhà
nớc, tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học & Công nghệ Việt
Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.
Vào hồi 9 giờ, ngày 30 tháng 11 năm 2007
Có thể tìm thấy luận án tại : - Th viện Viện Công nghệ sinh học
- Th viện Quốc Gia Hà Nội
1Mở đầu
1. Tính cấp thiết của đề tài
Các hợp chất thơm rất phổ biến trong tự nhiên, đồng thời chúng

đtg, 1999) và khả năng sinh trởng trên BA trong điều kiện kỵ khí (Đỗ
T.T.Uyên và đtg, 2002). Tuy nhiên, những nghiên cứu về sự phân hủy
các hợp chất thơm ở VKQHT vẫn cha đợc quan tâm nghiên cứu.
Vì vậy, trong luận án này chúng tôi đặt ra nhiệm vụ: Nghiên cứu
sự phân hủy sinh học hợp chất hydrocacbon mạch vòng ở một số vi
khuẩn quang hợp tía phân lập tại Việt Nam nhằm góp phần tìm hiểu
về sự phân hủy một số hợp chất thơm đơn nhân của VKQHT và định
hớng ứng dụng chúng trong công nghệ sinh học môi trờng.
2. Mục tiêu của đề tài:
Tìm hiểu khả năng phân hủy một số hợp chất thơm đơn nhân ở
VKQHT phân lập từ một số khu vực ô nhiễm khác nhau.
Nghiên cứu gen m hóa enzym chìa khóa benzoate-CoA ligase
(BadA) tham gia vào quá trình phân hủy BA ở VKQHT.
Nghiên cứu sự biểu hiện gen badA, tính chất của enzym tái tổ hợp.
3. Nội dung nghiên cứu:
Tuyển chọn VKQHT có khả năng tồn tại và sinh trởng trên một số
hợp chất thơm đơn nhân nh: BA, phenol và một số dẫn xuất, đồng
thời đánh giá khả năng sử dụng và phân hủy những hợp chất này ở
những chủng đợc lựa chọn.
Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số đại diện VKQHT.
Nghiên cứu ảnh hởng của một số yếu tố môi trờng (oxi, ánh sáng,
nguồn C ) đến khả năng phân hủy BA và 4-hydroxybenzoate
(4-OHBen) ở chủng VKQHT đại diện.
Xác định sự có mặt của enzym chìa khóa benzoate-CoA ligase trong
quá trình phân hủy BA ở chủng VKQHT đại diện.
Tách dòng gen badA của chủng VKQHT đại diện, biểu hiện gen
badA trong E. coli và xác định một số tính chất của enzym BadA tái
tổ hợp.
3



Các gen liên quan đến con đờng phân hủy kỵ khí BA ở VKQHT
41.5.1. Tổ chức và sắp xếp các gen chức năng
1.5.2. So sánh con đờng phân hủy kỵ khí BA ở VKQHT
Rhodopseudomonas palustris với vi khuẩn khử nitrate
1.5.3. Điều hòa quá trình phân hủy kỵ khí BA
1.6.

Phơng pháp quan trắc phân tử (molecular monitoring)
Chơng 2. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
2.1. Đối tợng, vật liệu:
các chủng VKQHT đợc phân lập từ một số
nguồn thải; các chủng E. coli DH5 và BL21; các plasmid pCR2.1
và pET32a(+); các cặp mồi fD1 và rD1, badAf và badAr.
2.2. Hóa chất:
tất cả các loại hóa chất đợc cung cấp bởi các hng có uy
tín nh Fermentas, Merck, Invitrogen, Sigma
2.3. Các phơng pháp nghiên cứu:
2.3.1. Phơng pháp nghiên cứu vi sinh vật: phân lập, nuôi cấy VKQHT
và nghiên cứu đặc điểm sinh học của VKQHT theo Bergey
(1989), đánh giá sinh trởng của VKQHT theo mật độ quang học
ở bớc sóng 660 nm và hàm lợng protein.
2.3.2. Phơng pháp hóa sinh: tách chiết enzym (Geissler và đtg, 1988),
tinh sạch protein bằng phơng pháp sắc kí ái lực, điện di protein,
xác định hàm lợng protein (Bradford, 1976), xác định hoạt độ
enzym (Bulaj và đtg, 1998), xác định tốc độ ban đầu V
o

3.2.1. Khả năng sử dụng phenol
Trong số 9 chủng, 4 chủng NMS49, MI1, VA31 và ĐG218 có khả
năng sinh trởng tốt trên môi trờng chứa phenol ở nồng độ < 2 mM sau
168 giờ. ở nồng độ phenol cao hơn, sự sinh trởng của các chủng này
bắt đầu giảm dần và bị ức chế ở nồng độ 6 mM. Trong khi đó, sinh
trởng của các chủng NĐ71; QP21; VH121; NMG16 và ĐG217 giảm
mạnh khi có mặt phenol trong môi trờng nuôi cấy ở tất cả các nồng độ.
Cả chín chủng VKQHT này đều không có khả năng sử dụng phenol là
nguồn C duy nhất cho sinh trởng trong điều kiện quang dị dỡng.
3.2.2. Khả năng sử dụng BA và 4-OHBen
3.2.2.1. Khả năng sử dụng BA và 4-OHBen
Khi môi trờng có bổ sung BA hoặc 4-OHBen ở nồng độ từ 2ữ10
mM, sự tích luỹ sinh khối của cả 9 chủng VKQHT nghiên cứu đều tăng
lên so với đối chứng (chỉ chứa acetate - AA- là nguồn C) sau 96 hoặc 48
giờ nuôi cấy. Sự sinh trởng của chúng giảm dần và dừng lại khi nồng
độ hai hợp chất bổ sung này vợt quá 12 mM. Khi BA hoặc 4-OHBen
đợc thay thế cho các nguồn C khác nh AA, succinate và ethanol,
những chủng VKQHT này đều có khả sử dụng hai hợp chất thơm này là
nguồn C duy nhất trong điều kiện quang dỡng giống nh một số
6VKQHT đ đợc nghiên cứu trớc đây (Gibson và Harwood, 1988,
1995; Sasikala và Ramana, 1998). Tốc độ sinh trởng của chủng đại
diện MI1 trên môi trờng chứa một số nguồn C ( 1 g/l) khác nhau
trong 9 ngày đợc trình bày ở Hình 3.1.
0
0.4
0.8
1.2

Sau 96 giờ nuôi cấy, sinh trởng của các chủng VKQHT bị ức chế
trong môi trờng chứa 4-CBA/ 3-CBA/ 2-CBA ở nồng độ 4 mM và hầu
Thời gian (giờ
)

Bảng 3.1. Khả năng phân hủy BA và
4-OHBen ở một số chủng VKHQT.
BA 4-OHBen Hợp
chất
thơm
Chủng
Hàm
lợng
bị phân
hủy
(mM)

Hiệu
suất
(%)
Hàm
lợng
bị phân
hủy
(mM)

Hiệu

với đối chứng khi môi trờng có bổ sung thêm các hợp chất CBA ở nồng
độ từ 0,5ữ2 mM. Trong điều kiện này, các chủng VKQHT nghiên cứu
(trừ chủng ĐG217) đều có khả năng sinh trởng tốt trên 4-CBA/ 3-CBA/
2-CBA ở nồng độ 1 mM (Hình 3.2).0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
VH121 MI1 NMS49 NMG16 QP21 N71 VA31 G218 G217
OD
660
(nm)
BA BA + 4-CBA BA + 2-CBA BA + 3-CBA

Hình 3.2. Biểu đồ sinh trởng của 9 chủng VKQHT trên môi trờng chứa hỗn hợp BA và
một trong các hợp chất CBA. BA: benzoate 2 mM; BA + 4-CBA: benzoate 2 mM +
4-chlorobenzoate 1 mM; BA + 2-CBA: benzoate 2 mM + 2-chlorobenzoate 1 mM; BA +
3-CBA: benzoate 2 mM + 3-chlorobenzoate 1 mM.
Tất cả 9 chủng VKQHT nghiên cứu đợc nuôi cấy trên môi trờng
cơ bản nhng các hợp chất CBA đợc thay thế cho các nguồn C khác
nh AA, succinate hoặc ethanol đều không có khả năng sử dụng các hợp
chất CBA là nguồn C duy nhất. Tuy nhiên, sau 7ữ8 lần cấy chuyển liên
tiếp sang môi trờng chứa 3-CBA hai chủng NMS49 và VH121 có khả
năng sử dụng 3-CBA là nguồn C duy nhất cho sinh trởng quang dị

CBA
AA AA +
CBA
AA AA +
CBA
AA AA +
CBA
AA AA +
CBA
Ngun C trong mụi trng
OD
660
(nm)
NMS49 VH121 NMG16 QP21 VA31

Hình 3.3. ảnh hởng của 3-CBA (CBA) đến sinh trởng của một số chủng VKQHT trên
môi trờng chứa acetate (AA).
b. Sinh trởng trên môi trờng chứa 4-OHBen
Kết quả thu đợc cho thấy 3-CBA cũng ức chế quá trình sinh
trởng của các chủng VKQHT ở giai đoạn đầu (Hình 3.4). Tuy nhiên
sau 72 giờ, hai chủng NMS49, và VH121 bắt đầu tăng sinh khối so với
đối chứng. Sự tăng sinh khối này đợc nhận thấy một cách rõ rệt ở tất cả
các vi khuẩn nghiên cứu sau 96 giờ. Sự tăng sinh khối so với đối chứng ở
các chủng khác nhau đợc thể hiện ở mức độ đồng đều 20ữ30%. Nh
vậy, sinh trởng của các chủng VKQHT cũng bị ức chế khi bổ sung
3-CBA ở giai đoạn đầu nhng sau một thời gian thích nghi, quá trình
sinh trởng của chúng đều tăng.
0

24 48

OD
660
(nm)
NMS49 VH121 NMG16 QP21 VA31

Hình 3.4. ảnh hởng của 3-CBA (CBA) đến sinh trởng của một số chủng VKQHT trên
môi trờng chứa 4-hydroxybenzoate (HBA).
c. Sinh trởng trên môi trờng chứa BA
Cũng nh trên môi trờng chứa AA hoặc 4-OHBen, sinh trởng
của 5 chủng VKQHT trên môi trờng chứa BA (2 mM) bị 3-CBA ức chế
ở giai đoạn đầu (Hình 3.5). Nhng sau 48 giờ, sinh trởng của 3 chủng
NMS49, VH121, NMG16 trong môi trờng bổ sung 3-CBA (1 mM) bắt
đầu tăng lên so với đối chứng. Tuy nhiên, các chủng khác nhau có sự
tăng sinh khối ở mức độ không giống nhau so với đối chứng, trong đó
chủng VH121 có sự tăng sinh khối cao nhất (52,8%).
0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
BA BA +
CBA
BA BA +
CBA
BA BA +
CBA
BA BA +
CBA

48 72 96

120

144 (giờ)

10mạnh ở các giai đoạn tiếp theo. Kết quả thu đợc ở thí nghiệm này có
thể là VKQHT cần một chất có vai trò nh một đồng cơ chất (co-
substrate) và một giai đoạn thích nghi để chúng có thể sử dụng đợc
3-CBA cho sinh trởng. Vai trò của một đồng cơ chất trong quá trình
phân hủy một số hợp chất thơm chứa clo cũng đ đợc quan sát ở một số
vi khuẩn nh Pseudomonas sp. và R. palustris (Haigler và đtg, 1992;
Kamal và đtg, 1990; Oda và đtg, 2004).
3.2.3.3. Khả năng phân hủy 3-CBA của các chủng VKQHT
Năm chủng nghiên cứu đều có khả năng phân hủy hợp chất 3-CBA
trên môi trờng chứa nguồn C là BA hoặc 4-OHBen (Bảng 3.2).

Bảng 3.2. Khả năng phân hủy hợp chất
3-CBA bởi 5 chủng VKQHT.
BA 4-OHBen Nguồn
C
Chủng
Hàm
lợng


0,533 46,7

NMG16 0,564

43,6

0,577 42,3

QP21 0,706

29,4

0,527 47,3

VA31 0,843

15,7

0,716 28,4

Chú thích: các hợp chất thơm đợc thử
nghiệm ở nồng độ1 mM
.
Tuy nhiên, khả năng phân hủy 3-CBA trên hai nguồn cơ chất sinh
trởng BA và 4-OHBen của chúng rất khác nhau. Trong cả hai trờng
hợp, chủng phân hủy 3-CBA yếu nhất là VA31. Khả năng phân hủy
3-CBA của các chủng còn lại gần nh tơng đơng khi môi trờng có
mặt 4-OHBen. Hai chủng NMS49 và VH121 có khả năng phân hủy
mạnh hợp chất 3-CBA trong sự có mặt của BA. Trong điều kiện này,

11thời gian thí nghiệm (144 giờ) (Hình 3.6). Chủng VH121 có khả năng
phân hủy 50% lợng 3-CBA có trong môi trờng sau 72 giờ và 1 mM
hợp chất này đợc phân hủy hết sau 120 giờ trên môi trờng chứa BA
(1 mM).

Nh vậy, 5 chủng trong nghiên cứu này đều có khả năng sử dụng
3-CBA là nguồn C cho sinh trởng ở những mức độ khác nhau với đồng
cơ chất là BA hoặc 4-OHBen. Theo một số nghiên cứu, nhóm vi khuẩn
VKQHT không những có khả năng phân hủy các hợp chất thơm đơn
giản mà còn có khả năng khoáng hóa các hợp chất thơm chứa clo nh
axit halocarboxylic, chlorobiphenyl và các hợp chất CBA (Kamal và đtg,
1990; Khanna và đtg, 1992; Oda và đtg, 2001, 2004).
Tóm lại, khả năng sinh trởng trên một số hợp chất thơm đơn nhân
và sử dụng các chất này cho sinh trởng ở những chủng VKQHT trong
nghiên cứu này đ đợc xác định. Đồng thời, khả năng phân hủy BA,
4-OHBen và 3-CBA cũng đ đợc khảo sát trong điều kiện các hợp chất
này đợc sử dụng là nguồn C duy nhất hoặc đồng chuyển hóa. Tổng hợp
kết quả nghiên cứu khả năng tồn tại, sinh trởng và sử dụng các hợp chất
thơm theo các cơ chế khác nhau đợc trình bày tóm tắt ở Bảng 3.3.
3.3. Đặc điểm sinh học của một số chủng đại diện
Tế bào của các chủng NMS49, VH121 và MI1 có một số đặc điểm
hình thái nh những loài thuộc chi Rhodopseudomonas: có dạng hình
gậy, kích thớc 0,6ì1,7 ữ 1,25ì2,6 àm; chuyển động tịnh tiến, phân
cực, sinh sản bằng hình thức nảy chồi và phân chia tế bào bất đối xứng;
dịch huyền phù của các chủng này có màu đỏ và có phổ hấp thụ cực đại
ở: 375, 468, 493, 520-545, 589, 803-805, 862-868 nm. Chúng có khả
năng sinh trởng hiếu khí trong tối nhng khi đó khả năng tổng hợp

4-OHBen

+
AA
+
AA

+
BA
+
AA

+
BA
+
AA

+
BA
BA 4-
OHBen
Phenol

BA 4-
OHBen

3-
CBA

Nguồn phân lập

++++ - ++ - + - - KXĐ

KXĐ - ++ ++ - Nhà máy Dệt Nam Định, Nam Định
NMG16

- ++++

++++ - ++ - ++ - + +++ ++ - +++ +++ - Nhà máy Giấy Phú Thọ, Phú Thọ
ĐG217 - +++ +++ - - - - - - KXĐ

KXĐ - + ++ - Nông trờng Đồng Giao, Ninh Bình
ĐG218 ++ ++++

++++ - +++ - +++ - +++ KXĐ

KXĐ - ++ ++ - nt
Chú thích: (a): nồng độ các hợp chất thơm: 1 mM phenol, 2 mM BA/4-OHBen; 1 mM 3-CBA/2-CBA/4-CBA; 8 mM acetate (AA). Mật độ tế bào tăng (OD
660
) so với môi trờng chỉ
chứa nguồn C là AA hoặc BA: (-): < 0; (+): 1ữ5%; (++): 5ữ20%; (+++): 20ữ40%; (++++): 40ữ50%.
(b): sử dụng 1 mM 3-CBA trong môi trờng chứa 2 mM BA hoặc 4-OHBen là nguồn carbon sau 144 giờ. Mật độ tế bào tăng (OD
660
) so với môi trờng chỉ chứa nguồn C
là BA hoặc 4-OHBen: (-): < 0; (+): 1ữ 5%; (++): 5ữ20%; (+++): 20ữ40%; (++++): 40ữ50%.
(c): sử dụng 2 mM các hợp chất thơm là nguồn C duy nhất sau 144 giờ. Mật độ tế bào tăng (OD
660
) so với môi trờng không C: (+++): > 1; (++): 0,75ữ1; (+): 0,5ữ0,75.
(*): 3-CBA đuợc sử dụng nh nguồn C duy nhất sau 7ữ8 lần cấy chuyển liên tiếp.
13


Rhodopseudomonas palustris ATCC17001
Rhodopseudomonas palustris DSM 126

MI1

VH121

Blastobater denitrificans

Bradyrhizobium japonicum

Rhodopseudomonas palustris DSM 123

Rhodopseudomonas rhenobacensis

Rhodoblastus acidophilus

Rhodoplanes roseusBlastochloris viridis

Rhodomicrobium vannielii

Rhodobacter capsulatus

Rhodobacter sphaeroides

Rhodobium marinumHình 3.8. Sinh trởng của chủng MI1 trên môi trờng chứa BA (A) và 4-OHBen (B)
trong các điều kiện k khí ngoài sáng (); k khí trong tối (); hiếu khí ngoài sáng ()
và hiếu khí trong tối (ì). Nồng độ các hợp chất thơm đợc thử nghiệm ở nồng độ 2 mM.
3.4.2. ảnh hởng của nồng độ BA và 4-OHBen
Mức độ tích lũy sinh khối của chủng MI1 phụ thuộc nhiều vào
nồng độ BA hoặc 4-OHBen có mặt trong môi trờng nuôi cấy sau 96 giờ
(Hình 3.9). Chủng này sinh trởng cực đại trên môi trờng chứa BA từ
4ữ8 mM hoặc 4-OHBen từ 6ữ8 mM. Sinh trởng của chủng MI1 bắt đầu
giảm mạnh khi nồng độ BA hoặc 4-OHBen vợt quá 8 mM. Theo một số
nghiên cứu đ đợc công bố (Harwood và đtg, 1988; Sasikala và đtg,
0
0.4
0.8
1.2
0 24 48 72 96 120
OD (nm)
0
0.4
0.8
1.2
0 24 48 72 96 120
OD (nm)

A

Thời gian (h)


660
(nm)
Hình 3.10. Động thái tích lũy sinh khối
của chủng MI1 trên môi trờng chứa BA
là nguồn C duy nhất khi không () và có
() bổ sung NaHCO
3
.
3.4.3. ảnh hởng của NaHCO
3

Sinh trởng của chủng MI1 đạt cực đại sau 72 giờ trong môi
trờng có NaHCO
3
(10 mM) (Hình 3.10). Trong môi trờng không chứa
NaHCO
3
,

thời gian đạt cực đại của chủng MI1 chậm hơn và kéo dài đến
120 giờ (Hình 3.10). Theo một số nhà nghiên cứu (Elder và đtg, 1992a;
Imhoff và đtg, 1989; Sasikala và đtg, 1998) VKQHT cần CO
2
ở dạng
bicacbonate (NaHCO
3
) để giữ cân bằng thế oxi hóa khử trong suốt quá
trình sinh trởng của chúng trên môi trờng chứa một số hợp chất thơm.
NaHCO
3

S
sự phân hủy BA diễn ra chậm hơn và BA (2 mM) chỉ đợc phân hủy
hoàn toàn sau 120 giờ (Hình 3.12).
0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
0 24 48 72 96 120
Thi gian (gi)
OD (nm)
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
N ng ủ b enzoate (m M)

Hình 3.11. Biến động tích lũy sinh khối
của chủng MI1 ( và ) và hàm lợng BA
(

và

) trong môi trờng khi không (hình
rỗng) và có (hình đặc) bổ sung NaHCO
3


BA đ làm tăng tốc độ tích lũy sinh khối của chủng MI1 (Hình 3.13).
Tuy nhiên, khác với NaHCO
3
và Na
2
S, bổ sung hai nguồn C này lại làm
giảm khả năng phân hủy BA của chủng MI1 (Hình 3.13).
0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
0 24 48 72 96 120
Thi gian (gi)
OD (nm)
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
Nng ủ benzoate (mM)Hình 3.13. Động thái tích lũy sinh
khối của chủng MI1 và hàm lợng BA
trong môi trờng có bổ sung acetate
hoặc succinate. Sinh khối tế bào

Hoạt độ tổng
số (U)
Hoạt độ riêng
(U/mg)
BA (6) 50 34,5 1,2 0,035
Acetate (12) 50 38,4 - -
Chú thích: dấu (-): không xác định đợc. Hàm lợng protein tham gia phản ứng là 14 àg.
3.6. Tách dòng gen m hóa enzym BadA từ chủng MI1
Trong nghiên cứu này, gen badA m hóa cho enzyme chìa khóa
tham gia vào quá trình phân hủy BA của chủng MI1 đ đợc tách dòng
và biểu hiện để từ đó có thể tạo tiền đề cho khả năng ứng dụng enzym
BadA tái tổ hợp trong quá trình đánh giá và xa hơn nữa là xử l ý ô nhiễm
hợp chất thơm.
Gen badA từ DNA genom của chủng MI1 đợc nhân lên bằng kỹ
thuật PCR với cặp mồi đợc thiết kế là badAf và badAr. Sản phẩm PCR
đợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pCR2.1 và đợc biến nạp vào tế
bào E. coli DH5. Để có thể kết luận chính xác đoạn DNA ngoại lai
chèn vào vector có phải là gen đích, các plasmid tái tổ hợp đợc sử dụng
18làm khuôn để nhân gen mong muốn bằng phản ứng PCR với cặp mồi
badAf và badAr và đợc cắt kiểm tra bằng các enzym hạn chế.
Kết quả phân tích trình tự cho thấy đoạn gen đ đợc nhân lên có
kích thớc 1575 nucleotide (đợc ký hiệu là badA/MI1) với bộ ba mở
đầu là ATG. Một gen với kích thớc nh vậy có thể m hóa cho một
protein với 523 axit amin có khối lợng phân tử ớc tính khoảng 57.530
Da. Kích thớc này gần giống với kích thớc của enzym benzoate-CoA
ligase (58.000 Da) đợc tinh sạch từ R. palustris (Geissler và đtg, 1988).
Trình tự nucleotide của gen badA ở chủng MI1 đợc so sánh với trình tự

A. evansii
T. aromatica benzoate-CoA ligase
S. pomeroyi
R. palustris /4-hydroxybenzoate-CoA ligase
A. evansii /2-aminobenzoate-CoA ligase
N. crassa /acetate-CoA ligase
B. thetaiotaomicron /acetate-CoA ligase
M. acetivorans /axit béo chuỗi dài CoA ligase
19 Hình 3.15. Mối quan hệ giữa các trình tự axit amin của benzoate-CoA ligase ở MI1 và
một số CoA ligase: benzoate-CoA ligase (BA.lig); 4-hydroxybenzoate-CoA ligase
(HBA.lig); 2-aminobenzoate-CoA ligase (2AB.lig); acetate-CoA ligase (acet.lig); axit béo
chuỗi dài CoA ligase (f.a.lig) từ các loài Comamonas testosteroni (Coma), R. palustris
(Rhodo), T. aromatica (Thau), A. evansii (Azoa), Silicibacter pomeroyi (Sili),
Neurospora crassa (Neur), Bacteroides thetaotaomicron (Bact), Methanosarcina
acetivorans (Metha).

Coma.Aryl.lig

Rhodo MI1.BA.lig
Rhodo DCP3.BA.lig
Rhodo CGA009.BA.lig

Rhodo.HBA.lig

Azoa.BA.lig

Thau.BA.lig

Sili.BA.lig

Azoa.2AB.lig

Bact.acet.lig

Neur.acet.lig

Metha.f.a.lig

Hình 3.16.
So sánh
trình tự axit amin suy
diễn của benzoate-
CoA ligase ở chủng
MI1 với R. palustris
chủng
DCP3 (số

polyacrylamide 12,6%. Đờng
chạy 1: dòng tế bào không mang
gen badA; M: thang protein
chuẩn (Fermentas); 2, 3: dòng tế
bào mang gen badA.
Hình 3.18. Hàm lợng protein BadA theo thời
gian cảm ứng trên gel polyacrylamide 12,6% có
SDS. Đờng chạy 1: không cảm ứng (0 giờ);
2ữ4: sau 1ữ3 giờ cảm ứng; M: thang protein
chuẩn (Fermentas); 5 và 6: sau 4 và 5 giờ cảm
ứng.

Gen badA trong vector tái tổ hợp đợc điều khiển phiên m bởi
promoter T7 và đợc kiểm soát chặt chẽ bởi chất cảm ứng IPTG có trong
môi trờng. Do đó, để kiểm tra khả năng biểu hiện của badA, các thể
biến nạp đ đợc nuôi cấy ở 30
o
C trong môi trờng có nhân tố chọn lọc
là Amp với chất cảm ứng IPTG (Hình 3.17). Protein BadA tái tổ hợp
đợc tổng hợp ngay sau khi IPTG đợc bổ sung vào môi trờng và sau 4
giờ thì lợng protein thu đợc là đủ lớn để phục vụ cho các nghiên cứu
tiếp theo (Hình 3.18).
1
2

3
4 M

18

14BadA

21Protein BadA dạng tan chiếm đa số (khoảng 90%) trong tổng số
protein tái tổ hợp thu đợc (Hình 3.19). Protein BadA tái tổ hợp dạng tan
đợc tinh chế bằng cột sắc ký ái lực His-tag và đợc kiểm tra trên gel
polyacrylamide 12,6% có SDS (Hình 3.20). Hình 3.19. Protein tan và không tan của
E. coli BL21 mang gen badA trên gel
polyacrylamide 12,6%. Đờng chạy 1:
pha tan; 2: pha không tan; M: thang
protein chuẩn (Fermentas).

kDa116

66

45

35

2518

14M 1
2

3

E. coli cao gấp khoảng 3 lần so với dịch chiết tế bào chủng MI1 sinh
trởng trên BA (Bảng 3.4).
3.9. ảnh hởng của một số yếu tố môi trờng đến hoạt động
của enzym BadA tái tổ hợp
Enzym BadA tái tổ hợp có hoạt động thích hợp ở nhiệt độ
30ữ35
o
C; pH 8,0ữ9,5 với sự có mặt của ion Mg
2+
hoặc Mn
2+
nhng hoạt
độ enzym khi có sự tham gia của Mn
2+
chỉ đạt 90% so với khi có mặt
của ion Mg
2+
. Theo Geissler và đtg (1988), ion Mg
2+
cần cho cho hoạt
động xúc tác của enzym BadA ở R. palustris và vai trò hoạt hóa của nó
có thể đợc thay thế bằng ion Mn
2+
. BadA tái tổ hợp có hoạt tính cao đối
với BA và 2-fluorobenzoate. Tuy nhiên, 2-fluorobenzoate không phải là
cơ chất sinh trởng của R. palustris (Harwood và Gibson, 1988). BadA
tái tổ hợp hầu nh không có hoạt tính đối với các cơ chất sinh trởng của
R. palustris trong điều kiện quang dỡng nh 4-OHBen,

hợp nh vậy cho nên cấu hình không gian của enzym phần nào đ bị
thay đổi và làm ảnh hởng đến tính chất của nó. Tuy nhiên, để có thể
nghiên cứu chính xác hoạt tính xúc tác của BadA tái tổ hợp sau khi tách
khỏi protein thioredoxin thì cần phải có những nghiên cứu sâu hơn tiếp
theo. Mặc dù có những sai khác về các thông số K
m
và V
max
nh vậy
nhng BadA tái tổ hợp vẫn có tính đặc hiệu cao đối với BA. Do đó,
BadA tái tổ hợp có thể đợc ứng dụng để đánh giá tiềm năng phân hủy
kỵ khí của hệ thống xử lý nớc thải hoặc trong bùn đất ô nhiễm hợp chất
thơm nhằm đa ra biện pháp xử lý thích hợp thông qua việc tạo các kit
phát hiện nhanh sự hiện diện của chất trung gian trung tâm của quá trình
này.
Kết luận
1. Đ tuyển chọn đợc 9 chủng vi khuẩn quang hợp tía (NMS49, MI1,
VH121, VA31, QP21, NĐ71, NMG16, ĐG217 và ĐG218) có khả
năng sử dụng benzoate và 4-hydroxybenzoate là nguồn carbon duy
nhất cho sinh trởng trong điều kiện quang dỡng. Trong đó, hai
chủng NMS49 và VH121 còn có thể sử dụng đợc 3-chlorobenzoate
là nguồn carbon duy nhất và 5 chủng NMS49, VH121, NMG16,
QP21, VA31 có khả năng phân hủy 3-chlorobenzoate khi có mặt
benzoate hoặc 4-hydroxybenzoate.
2. Chủng MI1 có thể sử dụng benzoate chỉ trong điều kiện k khí sáng
và sử dụng 4-hydroxybenzoate trong cả hai điều kiện k khí sáng và
hiếu khí trong tối. Bicarbonate (NaHCO
3
) chỉ làm tăng khả năng phân
hủy benzoate nhng sulfide natri (Na