LỜI CẢM
ƠN
Hoàn thành Đồ án này cho tôi được bày tỏ lòng biết ơn
sâu
sắc đến thầy giáo Thầy Tạ Ngọc Ly đã tận tình giúp đỡ tôi
trong
suốt thời gian học tập, thực tập nghiên cứu vừa
qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong bộ môn
Công
Nghệ Sinh Học đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi được trang bị
nhiều
kiến thức bổ ích cũng như hoàn thành Đồ án
này.
Cuối cùng xin cho phép con được cảm ơn các bạn trong
lớp
09SHLT đã động viên, giúp đỡ cho tôi hoàn thành Đồ án này.
Xin
được tri ân tất cả những
người.
Đà Nẵng, ngày 22 tháng 12 năm
2009
Sinh viên thực
hiện
Võ Khắc
Phi
GVHD: Tạ Ngọc
Ly
1
SVTH: Võ Khắc
Phi

tăng cường vi chất vào thực phẩm. Tuy nhiên, biện pháp này chưa thể giải quyết
được
vấn đề vì tốn kém. Các loại thực phẩm giàu dinh dưỡng nằm ngoàI khả năng thu
nhập
của cộng đồng dân cư nghèo. Vì vậy, hiện nay một giải pháp mới được đề nghị là
chọn
tạo các giống cây trồng, đặc biệt là lúa, có chứa hàm lượng các vi chất dinh dưỡng
cao
hơn các giống đang có. Giải pháp tăng cường vi chất bằng sinh học
(biofortification)
này được xem là hiệu quả, kinh tế và bền
vững.
Theo hướng này, các trung tâm nghiên cứu lúa gạo trên thế giới đã tiến
hành
nghiên cứu tạo được nhiều dòng lúa giàu β-caroten (tiền vitamin A) bằng phương
pháp
chuyển nạp gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens và chọn lọc bằng
mannose
thay thế cho hệ thống chọn lọc bằng chất kháng sinh hoặc chất diệt cỏ. Phương
pháp
chuyển nạp gen này có ý nghĩa trong việc tạo ra các dòng lúa biến đổi gen sạch,
khắc
phục các mối lo ngại về tính an toàn của cây biến đổi gen hiện nay. Để góp phần
phổ
biến cho mọi người hiểu về ý nghĩa của việc nghiên cứu lúa (gạo) chuyển gen giàu
β-
caroten, cũng như cách thức mà các nhà khoa học tạo ra giống lúa này, em đã chọn
đề
tài “Tìm hiểu Phương pháp chuyển gen thực vật tạo gạo vàng giàu vitamin A” để
vừa

bằng phương thức nhân tạo thay vì thông qua lai tạo như trước đây. Những gen
được
tạo đưa vào (gen chuyển) có thể được phân lập từ những loài thực vật có quan hệ
họ
hàng hoặc từ những loài khác biệt hoàn toàn. Thực vật tạo ra được gọi là thực
vật
“chuyển gen” mặc dù trên thực tế tất cả thực vật đều được “chuyển gen” từ tổ
tiên
hoang dại của chúng bởi quá trình thuần hóa, chọn lọc và lai giống có kiểm soát
trong
một thời gian
dài.
1.2. Các phương pháp chuyển gen thực
vật
Nhiều phương pháp khác nhau đã được phát minh để đưa gen vào tế bào và
mô
thực vật. Kỹ thuật đơn giản nhất là chuyển DNA trần bằng vi tiêm
(microinjection),
xung điện (electroporation), súng bắn gen. Ngoài ra còn phương pháp phức tạp và
hiệu
quả hơn là chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn
Agrobacterium,
Tuỳ thuộc vào đối tượng chuyển gen mà người ta lựa chọn phương pháp
chuyển
gen phù
hợp.
1.2.1. Vi
tiêm
Nguyên tắc của phương pháp vi tiêm là một lượng nhỏ DNA được tiêm trực
tiếp

phép điều chỉnh các kim theo không gian 3 chiều. Kim tiêm và kim giữ được lắp
vào
máy vi thao tác và được nối với syringe qua ống bằng chất dẻo được nạp đầy
dầu
parafin.
Vi tiêm được tiến hành qua các bước: nạp gen vào kim tiêm bằng phương
pháp
capillar (ngâm đầu kim tiêm vào dung dịch gen khoảng 10 -12 giờ) hoặc bơm trực
tiếp
dung dịch gen vào, lắp kim tiêm và kim giữ vào máy vi thao tác, chuyển trứng
tiền
nhân vào đĩa petri có chứa môi trường được đặt dưới kính hiển vi, giữ trứng tiền
nhân
vào đầu kim giữ bằng lực hút của syringe, điều chỉnh kính hiển vi để xác định đĩa
phôi
và điều chỉnh máy vi thao tác để đưa kim tiêm vào vị trí của trứng tiền nhân, đẩy
gen
vào trứng tiền nhân bằng cách vặn nhẹ syringe. Khi thấy trứng tiền nhân hơi phồng
to
và trở nên sáng hơn thì dừng lại và kéo nhanh kim tiêm ra. Trứng tiền nhân sau
khi
tiêm được di chuyển xa đến cuối đĩa petri trước khi tiêm trứng tiền nhân tiếp
theo.
Mỗi một nhóm trứng tiền nhân đã hoàn thành được chuyển sang một đĩa môi
trường
khác để ấp và đánh giá bằng mắt trong một vài tiếng. Sau đó tất cả các trứng tiền
nhân
được nhìn thấy rõ ràng và được chuyển vào ống dẫn trứng của con cái
nhận.
Ðối với thực vật thì phương pháp này được sử dụng đối với các tế bào tiền phôi

dụng
nhưng không thường xuyên do giá cả đắt). Các hạt này được đặt trên một cái đĩa ở
mặt
bên trong của súng. Sự bùng nổ khí helium ở 1000psi làm cho cái đĩa bắn về
phía
trước với tốc độ 1300 food/s, tương đương với tốc độ khi một viên đạn rời
khỏi
nòng súng. Một tấm chắn làm dừng đĩa lại và các hạt vàng hay tungsten được
phóng
về phía các tế bào đích. Chúng xuyên qua vách tế bào và phóng thích các phân
tử
DNA.
Hình 1.2. 2 – Súng bắn gen thực vật và nguyên lý hoạt
động
Mục tiêu của súng bắn gen thường là callus của các tế bào thực vật giống nhau
sinh
trưởng trong môi trường gel trên đĩa petri. Sau khi các hạt tungsten đã va chạm
vào
đĩa, gel và callus bị phá vỡ nhiều. Tuy nhiên một số tế bào không bị phá vỡ khi
va
chạm mạnhvà đã tiếp nhận các hạt tungsten được bao bọc DNA và cuối cùng các
phân
tử DNA ngoại lai đã xâm nhập và hợp nhất vào nhiễm sắc thể thực vật. Các tế bào
từ
đĩa petri được tập hợp lại và chọn lọc các tế bào đã hợp nhất thành công và biểu
hiện
DNA ngoại lai bằng các kỹ thuật hóa sinh hiện đại như sử dụng gen chọn lọc
nối
tiếp và Northern blots. Các tế bào đơn đã chọn lọc từ callus có thể được xử lý với
một

phù tế bào. Một xung điện cần thiết cho kỹ thuật này thường là khoảng
10.000-
100.000 v/cm (thay đổi tùy theo kích thước của tế bào) trong vài phần triệu giây
đến
một phần ngàn giây. Xung điện này làm rối loạn phospholipid kép của màng tế bào
và
tạo ra các lỗ tạm thời. Khả năng điện qua màng tế bào cùng lúc tăng lên 0,5-1,0 v
vì
vậy các phân tử đã được nạp điện này đi qua màng tế bào thông qua các lỗ bằng
cách
thức tương tự như điện
di.
Hình 1.2.3 – Máy xung gen và sơ đồ bố trí mạch cơ bản của máy xung
điện
Khi các ion đã nạp điện và các phân tử đi qua các lỗ, màng tế bào phóng điện
và
các lỗ này đóng lại một cách nhanh chóng và phospolipid kép phục hồi lại cấu
trúc
cũ. Lúc này các phân tử mong muốn đã ở trong tế bào và chúng được sử dụng cho
các
nghiên cứu tiếp
theo.
Phương pháp này có thể sử dụng đối với tế bào thực ật ở dạng protoplast Với
một
số cây một lá mầm quan trọng (loài lúa phụ Japonica, ngô, lúa mì). Hiệu quả biến
nạp
cao.
1.2.4. Chuyển gen nhờ vi khuẩn
Agrobacterium
Agrobacterium có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng cách chuyển

nhập
bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gen chuyển
đặc
biệt. Tuy nhiên, một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến
nạp
là loại mô được biến nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức
độ
khởi đầu của vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng, môi trường
để
nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử dụng để chọn
lọc
thể biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực
vật.
Hình 1.2.
4
Chuyển gen
nhờ
Agrobacterium
1.3. Mục đích, ý nghĩa, và một số thành tựu của chuyển gen thực
vật
1.3.1. Mục đích của chuyển gen thực
vật
Mục đích của Công nghệ chuyển gen thực vật chủ yếu
là:
+ Duy trì và mở rộng đa dạng sinh học
(biodiversity).
+ Tăng khả năng kháng (sức khỏe cây trồng và chống chịu các điều kiện bất
lợi).
+ Nâng cao chất lượng sản
phẩm.

- Chuyển gen tạo dầu ăn có lợi cho sức khoẻ hơn từ đậu nành và cải
dầu.
1.4. Những nguy cơ từ chuyển gen thực
vật
Bên cạnh những ưu điểm chuyển gen thực vật cũng có những nguy cơ tiềm
ẩn
trong việc phát triển những kỹ thuật mới. Bao
gồm:
- Mối nguy hiểm trong việc vô tình đưa những chất gây dị ứng hoặc làm giảm
dinh
dưỡng vào thực
phẩm.
- Khả năng phát tán những gen biến nạp trong cây trồng sang họ hàng hoang
dại.
- Sâu bệnh có nguy cơ tăng cường tính kháng với các chất độc tiết ra từ cây
chuyển
gen.
- Nguy cơ những chất độc này tác động tới các sinh vật không phải là loại sinh
vật
cần diệt, vì thế có thể làm mất cân bằng sinh
thái.
Nhìn chung, mặc dù còn những điểm còn chưa rõ ràng về cây chuyển gen
nhưng
với khả năng tạo ra những giống cây trồng mới có giá trị kinh tế, công nghệ này có
vai
trò không thể phủ nhận được. Tuy vậy, vẫn còn một số vấn đề đáng lo ngại. Để
giải
quyết những vấn đề này thì những kết luận thu được phải dựa trên những thông tin
tin
cậy và có cơ sở khoa

Nam
Việt Nam có hai vùng trồng lúa chính là đồng bằng sông Hồng ở phía Bắc và
đồng
bằng sông Cửu Long ở miền Nam. Hàng năm sản lượng của cả nước đạt 33-34
triệu
tấn thóc, trong đó chỉ sử dụng khoảng 8 triệu tấn (tương đương 4 triệu tấn gạo sau
khi
xay xát) cho xuất khẩu, còn lại là tiêu thụ trong nước và bổ sung dự trữ quốc
gia.
- Ở miền Bắc một năm có hai vụ lúa chính: vụ chiêm và vụ
mùa.
- Ở miền Nam, nông dân trồng ba vụ một năm: vụ đông xuân (có sản lượng
cao
nhất và thóc cũng đạt chất lượng tốt nhất cho xuất khẩu), vụ hè thu và vụ ba. Do
lũ
GVHD: Tạ Ngọc
Ly
10
hàng năm ở đồng bằng sông Cửu Long trong những năm gần đây ảnh hưởng đến
sản
xuất, một phần nữa người dân có thể kiếm lời ổn định hơn từ việc nuôi thủy sản
(tôm)
hay trồng cây ăn quả, chính quyền đã khuyến cáo nông dân giảm và chuyển đổi
một
phần đất trồng lúa vụ
ba.
Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn là bộ chủ quản, quản lý việc sản xuất
lúa
gạo của Việt
Nam.

Gạo vàng được bắt đấu tiến hành nghiên cứu từ năm 1999. Đến năm 2000 thì
GR1
ra
đời.
Vào ngày 27-3-05, một đội ngũ khoa học gia của công ty Hạt Giống Syngenta
ở
Cambridge, Anh Quốc, đã tuyên bố khám phá được loại gạo vàng mới (GR 2)
chứa
lượng β-caroten gấp 23 lần lớn hơn gạo vàng cũ (GR 1) được khám phá vào
năm
2000.
Ngày 14-10-2008, Rockefeller Foundation tuyên bố sẽ tài trợ Viện Thí
Nghiệm
Lúa Quốc Tế (IRRI) ở Philippines để hỗ trợ dự án “Hạt gạo vàng”, nhằm tăng tốc
quy
trình kiểm tra chấp thuận loại lương thực GM này tại các nước đông dân: Ấn
Độ,
Bangladesh, Indonesia và Philippines. Cơ quan Rockefeller hy vọng tài trợ nêu trên
sẽ
giúp Hạt gạo vàng đến tay nông dân sớm hơn để họ có thể sản xuất đại
trà.
1.6.2. Ý nghĩa của việc tạo ra Gạo vàng (Golden
Rice)
Người ta dự tính khoảng 100 đến 140 triệu trẻ em trên thế giới đang bị
thiếu
vitamin A, gây ra mù mắt, bệnh sởi và tử vong. Việc nghiên cứu tạo thành công
giống
lúa cho Gạo vàng có thể cứu hàng trăm ngàn trẻ em bị mù hàng năm vì thiếu
vitamin
A.

tiên hoa vàng hoặc từ cây ngô và vi khuẩn Erwinia uredovora vào bộ gen của lúa,
tạo
ra giống lúa mới có hàm lượng vi-ta-min
A.
Sử dụng hai loại vector chuyển gen gồm hai plasmid là pCaCar và pFun3
để
chuyển gen vào vi khuẩn Agrobacterium
tumefactien.
Dùng vi khuẩn A. tumefactien đã được gắn plasmid nói trên để chuyển đoạn
DNA
mong muốn vào trong phôi của các giống lúa được chọn
lọc.
2.2. Phương pháp nghiên
cứu
Hạt gạo vàng là một thành quả lớn trong chương trình nghiên cứu của đội ngũ
khoa
học gia Thụy Sĩ và Đức, được cơ quan Rockerfeller Foundation của Mỹ tài trợ
100
triệu USD trong 10 năm. Đội ngũ này được hướng dẫn bởi Giáo sư Ingo
Potrykus,
Viện Kỹ Thuật Liên Bang ở Thụy Sĩ, và Tiến Sĩ Peter Beyer, Đại học Freiburg
ở
Đức.
Các nhà khoa học đã sử dụng phôi của hạt lúa nuôi cấy mô tái sinh cây lúa
phòng
thí nghiệm rồi chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để đưa tất cả
các
gen lạ vào phôi hạt lúa sau
đó.
Kiểm tra biểu hiện của gen qua kiểm tra kiểu hình (hạt gạo có màu vàng), kiểm

hóa GGPP (20 C) thành phytoen (40 C). Tiếp theo đoạn gen crtI mã hóa để sinh
tổng
hợp enzim phytoene desaturase có nhiệm vụ chuyển hóa phytoen thành ζ-Caroten
rồi
chuyển hóa tiếp thành Lycopen. Cuối cùng gen lcy mã hóa để sinh tổng hợp
enzim
Lycopen β-Cyclase có nhiệm vụ xúc tác chuyển hóa Lycopen thành β-caroten. Và
kết
quả là hạt gạo chuyển gen thể hiện kiểu hình có màu vàng đặc trưng của β-caroten
và
chứa một lượng tiền vitamin A rất lớn so với hạt gạo bình
thường.
Hình 2.3.1 – Sự khác biệt giữa gạo thường và gạo chuyển
gen
2.3.2. Quy trình kỹ
thuật
Tách chiết gen psy và gen
lyc
từ cây Daffodil hoặc từ
cây
ngô
Tách chiết gen crt1
từ
vi khuẩn đất Erwinia
-
uredovora
Chuẩn bị hạt
giống
B4
B3

B8
Nuôi tăng sinh và tái tạo cây con
từ
mầm tái sinh đã chuyển
gen
B9
Trồng lúa chuyển gen và cho
lai
với giống lúa địa
phương
B10
Trồng đại trà thu
sản
phẩm gạo
vàng
2.3.3. Thuyết minh quy
trình
Trong cây lúa biến đổi gen người ta đưa vào để biểu hiện hai gen mã hóa,
phytoene
synthase (psy) và lycopene cyclase (lcy) từ cây hoa thủy tiên vàng và gen mã
hóa
carotoene synthetase 1 (crt1) từ vi khuẩn đất Erwinia uredovora. Nhưng người ta
thấy
rằng loại lúa này không cho nhiều tiền tố vitamin A như mong đợi vì psy làm
giảm
hiệu quả tích tụ β-caroten trong nội nhũ của hạt gạo. Vì thế gen psy từ cây hoa
thủy
tiên vàng được thay thế bằng gen psy từ
ngô.
Bước 1: Giống lúa Taipei 309, IR64 và MTL 250 (Indica) được trồng trong

2
O
4.4
MgSO
4
.7H
2
O
3.7
B.Phosphat
(g/l)
KH
2
PO
4
1.7
NaH
2
PO
4
1.7
C.Vi lượng1
(g/l)
H3BO3
0.62
MnSO4.H2O
1.69
ZnSO
4
.2H

2
O
0.278
G.Vitamin
(mg/100ml)
Glycin
200
Nicotinic acid
50
Pyridoxin-HCl
50
Thiamin-HCl
10
Myo-inositol
10.000
* Muốn có 1 lít môi trường làm việc
MS
-Chuẩn bị một bình dung tích 2 lít, chứa sẵn 400ml nước
cất
-Thêm 100ml A và 100ml
B
-Thêm 10ml C và 10ml
F
-Thêm 1ml D và 1ml
G
-Thêm 0,1ml
E
-Thêm nước cất cho đủ 1
lít.
Bước 3: Tách chiết ADN từ vi khuẩn đất Erwinia uredovora, sau đó tiến hành

là
hỗn hợp các chất – là bộ kid để test nhanh), rồi đem ủ ở 56
0
C trong máy ổn
nhiệt
trong 30 phút để hoạt hóa enzim. Bấm đồng hồ để canh thời
gian.
Sau 30 phút lấy ống thí nghiệm ra khỏi máy ổn nhiệt và đem ống đi lắc mạnh
trong
10 giây bằng máy vortex. Sau đó tiếp tục đưa ống vào đặt trong bể ổn nhiệt ở
95
0
C
hoặc nước sôi trong 8 phút. Bấm đồng hồ để canh thời
gian.
Sau 8 phút, lại lấy ống ra đem lắc mạnh bằng vortex trong 10 giây. Rồi đem ly
tâm
với chế độ ly tâm được cài đặt
là:
- Tốc độ: 11000
vòng/phút
- Thời gian ly tâm: 2-3
phút
- Nhiệt độ ly tâm:
10
0
C
Sau khi ly tâm, lấy ống nghiệm ra quan sát thấy hỗn hợp phân thành 3 lớp. Lớp
trên
cùng chính là ADN có khối lượng nhỏ nhất nên nổi lên trên sau khi ly

- Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở nhiệt độ
phòng.
Sau khi lắc chuyển dịch chiết tách trên qua ống dùng để quay li tâm và tiến hành
quay
li tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20
phút)
- Chuyển lớp nước ở phía trên vào ống nghiệm mới sau đó cho 2 ml dung
dịch
CTAB 10 % đã được hâm nóng ở 70
0
. Sau đó trộn
đều.
- Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở nhiệt độ
phòng.
Sau đó quay li tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20
phút).
- Cho 30 ml đệm kết tủa CTAB sau đó trộn đều cho tới khi có một màng
ADN
màu trắng đục nổi
lên.
- Quay li tâm ở nhiệt độ phòng (3000rpm, 20 phút). Loại bỏ phần dịch lỏng
thu
phần kết
tủa.
- Hòa tan kết tủa bằng 5ml dung dịch muối ở nhiệt độ 56
o
C NaCl 1M và cho
vào
dung dịch 5µl enzyme RNase 10mg/ml để phân hủy RNA
.

chuyển
vào bên trong tế bào vi khuẩn, nhờ sự tăng sinh của vi khuẩn chúng được nhân
bản
với
số lượng lớn và được sử dùng trong giai đoạn tiếp
theo.
Bước 7, 8: Nuôi cấy A. tumefactien trên môi trường có chứa mầm tái sinh cây
lúa
đã được chuẩn bị ở bước 2. Các đoạn gen ngoại lai từ A. tumefactien sẽ được
chuyển
vào mầm tái sinh từ
phôi.
Môi trường để nuôi cấy được pha chế thử nghiệm như bảng dưới đây, thực
nghiệm
sẽ lựa chọn ra môi trường tối ưu để sử dụng trong quá trình chuyển
gen.
GVHD: Tạ Ngọc
Ly
20
(Số liệu thu thập từ kết quả công bố của Viện lúa Đồng bằng sông Cửu
Long)
Kết quả thực nghiệm của Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long cho biết trong số
các
môi trường được nghiên cứu nói trên thì môi trường MSReg3 là môi trường tối
ưu
nhất cho quá trình chuyển gen bằng A.
tumefactien.
+ Trong giai đoạn tiếp theo vi khuẩn mang gen chuyển được đưa vào nuôi
cấy
trong môi trường có chứa phôi của hạt lúa Indica đã được chuẩn bị ở trên. Vi

quan
Quan sát và so sánh nội nhủ của hạt gạo thường và hạt gạo chuyển gen
β-caroten.
Quan sát sẽ thấy hạt gạo thường có màu trắng trong, còn hạt gạo chuyển gen
β-caroten
có màu vàng ngà. Hạt gạo nhận gen chuyển từ cây ngô có màu vàng sẫm hơn so
với
hạt gạo nhận gen chuyển từ hoa thủy tiên, cho thấy lượng β-caroten có trong hạt
gạo
nhận gen chuyển từ cây ngô cao hơn so với hạt gạo nhận gen chuyển từ hoa thủy
tiên.
Hình 10 – Kiểm tra kết quả chuyển gen bằng cảm
quang
2.5.1. Kiểm tra bằng kỹ thuật phân tích phân
tử
2.5.1.1. Sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện sự có mặt của các gen psy, crt,
lcy.
Hình 2.5 .1.1 – Kết quả chụp
UV
Hỗn hợp dùng trong phản ứng PCR và một sô dụng cụ cần
thiết
- Tag polymerase 0,025 U/µl
(1,25U/50µl)
- Tris-HCl (pH 8.8 )
75mM
- (NH4)2SO4
20mM
- Tween 20
0,01%
- dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 200µM mỗi

B1. 94
0
C 1-1,5’ (Biến tính
ADN)
B2. 95
0
C 20 s (Tách ADN sợi đôi thành sợi
đơn)
B3. 65
0
C 20 s (Mồi bắt cặp với sợi
khuôn)
B4. 72
0
C 1’ (Phản ứng kéo
dài)
B5. lặp lại B2 đến B4 29
lần
B6. 72
0
C 10’ ( Tổng hợp nốt các đoạn chưa được hoàn
chỉnh)
B7 4 độ
∞
2.5.1.2. Trích DNA và phân tích
Southern
DNA được trích từ lá theo phương pháp của McCouch và ctv. (1988).
Mười
micrograms DNA được cắt đoạn với EcoRI (hai điểm cắt) để xác định sự hiện diện
của