Các phương pháp chuyển gen

Nhiều phương pháp khác nhau đã được phát minh để đưa gen vào tế bào và
mô động vật và thực vật. Kỹ thuật đơn giản nhất là chuyển DNA trần bằng vi tiêm
(microinjection), xung điện (electroporation), súng bắn gen. Các phương pháp
phức tạp và hiệu quả hơn bao gồm sử dụng các phức hợp lipid-DNA (liposome),
vector virus, tế bào gốc phôi, chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium,
chuyển gen bằng súng bắn gen... Tuỳ thuộc vào đối tượng chuyển gen mà người
ta lựa chọn phương pháp chuyển gen phù hợp.

I. DEAE-dextran
DEAE-dextran là một polycation. Ðây là tác nhân hóa học đầu tiên được sử
dụng để chuyển DNA vào tế bào động vật nuôi cấy.
Trong phương pháp này, DNA ngoại lai được cho vào một trường nuôi cấy
với sự có mặt của DEAE-dextran. DEAE-dextran sẽ kết hợp với DNA tích điện âm
(Hình 2.1). Sự dư thừa điện tích dương trong phức hợp DNA-polycation do sự
đóng góp của polycation, cho phép phức hợp này đi đến kết hợp chặt chẽ hơn với
màng tế bào tích điện âm. Sự xâm nhập của phức hợp có thể đạt được nhờ sự
nhập bào (endocytosis).
Hình 2.1: Sự kết hợp giữa DEAE-dextran và DNA
Phương pháp này được sử dụng thành công trong việc chuyển DNA vào
các tế bào biểu hiện nhất thời, có nghĩa là thời gian biểu hiện ngắn chỉ vài ngày
trong quá trình nghiên cứu. Tuy nhiên, phương pháp này nói chung là không hữu
ích đối với các nghiên cứu cần sự chuyển nhiễm ổn định dựa vào sự hợp nhất của
DNA ngoại lai vào nhiễm sắc thể, hiệu quả biến nạp thấp, chỉ được sử dụng cho
một số loại tế bào và cho kết quả tốt đối với tế bào ex vivo.
Các polycation khác cũng đã được sử dụng để chuyển DNA vào tế bào như
polybrene, polyethyleneimine và dendrimers.

II. Kỹ thuật calcium phosphate

DNA (Hình 2.5). Ðối với các tế bào nuôi cấy, toàn bộ lưới tích điện dương của
phức hợp liposome-DNA nói chung là gây ra hiệu quả chuyển gen cao hơn bởi vì
nó cho phép phức hợp này kết hợp với màng tế bào tích điện âm bền hơn. Nhờ
cơ chế nhập bào, các phức hợp xuất hiện trong endosome và sau đó đi vào nhân
(Hình 2.6). Chưa rõ DNA được phóng thích từ endosome và đi qua màng nhân
như thế nào. DOPE được xem là một lipid kích thích sự dung hợp và vai trò của
nó là phóng thích các phức hợp này từ endosome cũng như làm cho sự dung hợp
của màng tế bào phía ngoài với phức hợp liposome-DNA xảy ra dễ dàng. Trong
phương pháp này, các đại phân tử trước hết được đưa vào trong các túi
phospholipid. Các loại túi khác nhau đã được mô tả, nhưng túi một lớp mỏng là
thích hợp nhất cho chuyển gen vì chúng có tỉ lệ khoảng trống chứa nước ở bên
trong tương đối cao đối với mỗi đơn vị lipid và bởi vì chúng có tỉ lệ phân phối cao
hơn. Sự dung hợp của liposome với màng plasma là một sự kiện hiếm. Hiệu quả
biến nạp của phương pháp này thấp hơn so với phương pháp vi tiêm vào tiền
nhân. Các nổ lực nghiên cứu đang được tiến hành để tìm ra các điều kiện thí
nghiệm mà có thể làm tăng sự phóng thích các phân tử đã kết nang từ con đường
ẩm bào.
Hình 2.3: Cấu trúc tổng quát của lipid cation tổng hợp

Hình 2.4: Cấu trúc của DOPE (L-diolecyl phosphatidylethanolamine)

Hình 2.5: Phức hợp liposome-DNA
Hình 2.6: Sơ đồ hoạt động của vector liposome
Liposome đã được sử dụng để đưa protein, lipid và các phân tử nhỏ vào
nhiều loại tế bào nuôi cấy, tuy nhiên hiệu quả thấp hơn vi tiêm đối với RNA hoặc
protein. Cũng như thế, chuyển gen qua liposome và sự biểu hiện của gen chuyển
là không vượt qua được các phương pháp chuyển gen thông thường (như hệ
thống virus), sự biểu hiện gen chuyển thường nhất thời, sự ức chế bởi các thành
phần của huyết thanh có thể xảy ra. Bên cạnh đó, kỹ thuật này có nhiều ưu điểm
là gen chuyển sẽ không hợp nhất vào genome chủ, có hiệu quả tốt đối với cả tế


Hình 2.7: Vi tiêm gen ngoại lai vào tiền nhân của trứng thụ tinh

Ðể tạo kim tiêm trước hết phải tạo ra đầu kim nhọn nhờ máy kéo kim. Sau đó
sử dụng máy gia cố để cắt đầu nhọn của ống capillar sau khi kéo tạo ra mũi kim
tiêm có đường kính thích hợp. Ðường kính bên trong mũi kim tiêm tuỳ thuộc vào
loại tế bào chuyển gen. Ðối với trứng tiền nhân động vật có vú có đường kính
khoảng 70 µm thì đường kính của kim tiêm khoảng 0,75 µm là thích hợp, đối với
phôi cá một tế bào đường kính của kim tiêm là khoảng 3-4 µm. Cuối cùng đưa kim
lên máy mài để làm sắc nhọn và trơn láng đầu kim (Hình 2.8).
Kim giữ được chế tạo từ những ống capillar có đầu nhẵn bình thường để cố
định trứng trong quá trình vi tiêm. Ðể tạo kim giữ, dùng máy kéo kim tự động để
tạo ra đầu kim nhỏ sau đó dùng bút kim cương hoặc sợi platin đốt nóng cắt bớt
đầu nhọn để tạo ra đầu kim với đường kính thích hợp. Làm nhẵn đầu kim giữ
bằng cách để đứng kim này ngay trên mặt đoạn cong platin của máy gia cố. Ðốt
nóng sợi platin và điều chỉnh đầu kim giữ cho nó chảy từ từ. Quan sát dưới kính
hiển vi và dừng lại khi đầu kim đã đạt yêu cầu.
Vi tiêm được tiến hành trên hệ thống thiết bị vi tiêm (Hình 2.9). Hệ thống này
gồm có hai bộ phận chính là kính hiển vi và máy vi thao tác.Hình 2.8 : Các máy làm kim (Hãng Narishige)
1. Máy gia cố kim Microforge
2. Máy mài kim
3. Máy kéo kim tự động Pipette Puller

Kính hiển vi dùng cho mục đích này là kính hiển vi soi ngược (vật kính
xoay ngược lên). Ðộ phóng đại thích hợp cho việc tiến hành vi tiêm vào phôi cá
một tế bào là khoảng từ 40-60 lần. Máy vi thao tác gồm 2 phần giống hệt nhau
được bố trí hai bên kính hiển vi, một dùng để điều chỉnh kim tiêm, một dùng cho

tiêm ra. Trứng tiền nhân sau khi tiêm được di chuyển xa đến cuối đĩa petri trước
khi tiêm trứng tiền nhân tiếp theo. Mỗi một nhóm trứng tiền nhân đã hoàn thành
được chuyển sang một đĩa môi trường khác để ấp và đánh giá bằng mắt trong
một vài tiếng. Sau đó tất cả các trứng tiền nhân được nhìn thấy rõ ràng và được
chuyển vào ống dẫn trứng của con cái nhận.
Cho đến nay, trong các kỹ thuật chuyển gen vào động vật thì phương pháp vi
tiêm dung dịch DNA vào hợp tử là phương pháp có hiệu quả nhất trên động vật có
vú và hiện là phương pháp chủ yếu được sử dụng để chuyển gen vào vật nuôi.
Ðối với thực vật thì phương pháp này được sử dụng đối với các tế bào tiền
phôi của hợp tử hoặc các tế bào tiền phôi của hạt phấn.
Tuy nhiên sự xâm nhập của gen chuyển vào DNA tế bào vật chủ là một quá
trình ngẫu nhiên và xác suất để gen chuyển xen vào vị trí DNA vật chủ mà sẽ cho
phép nó biểu hiện là thấp. Hiệu quả của vi tiêm là không cao (Bảng 2.1).

Bảng 2.1: Hiệu quả vi tiêm ở một số loài động vật
(Hammer và cộng sự, 1985)
Loài
động vật
Số lượng
trứng được
vi tiêm
Số lượng
con sinh ra
từ trứng vi
tiêm
Số lượng
con chuyển
gen
Thỏ 1907 218 (11,4%) 28 (1,5%)
Cừu 1032 73 (7,1%) 1(0,1%)

1
) cần kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển. Khi gen chuyển
đã hợp nhất trong các tế bào sinh dục thì được gọi là thể khảm dòng mầm và sau
đó chúng được lai cùng dòng khoảng 10-20 thế hệ cho đến khi thu được các động
vật chuyển gen đồng hợp tử và gen chuyển có mặt ở trong tất cả mọi tế bào. Ở
giai đoạn này, phôi mang gen chuyển có thể được đông lạnh và được bảo quản
cho các quá trình cấy chuyển về sau. Hình 2.11: Chuyển gen nhờ vector là virus

VI. Chuyển gen bằng cách sử dụng tế bào gốc phôi
Xuất phát từ lý do các tế bào gốc phôi (tế bào phôi ở giai đoạn 16-32 tế bào)
là các tế bào đa năng (totipotent) nghĩa là có thể phân hoá thành bất kỳ loại mô
nào và từ đó sẽ tạo nên cơ thể hoàn chỉnh. Từ các túi phôi nuôi cấy in vitro, người
ta đã tiến hành tách chiết các tế bào gốc phôi và biến nạp gen ngoại lai vào những
tế bào này.
Sau khi chọn ra những tế bào đã được biến nạp gen lạ người ta đưa nó vào
phôi khác ở giai đoạn phôi nang để tạo ra động vật chuyển gen thể khảm. Trên
30% động vật chuyển gen tạo thành là những động vật chuyển gen thể khảm dòng
mầm mang kiểu gen của dòng tế bào này. Ở đây các tế bào gốc phôi được sử
dụng như là một phương tiện để chuyển gen (Mintz, 1977).
Ưu điểm của phương pháp chuyển gen này là tỉ lệ phôi sống sót sau thao tác,
sự tích hợp và biểu hiện tính trạng của gen mới khá cao. Ðiều quan trọng hơn là
trong thực tế việc chuyển gen có thể được tiến hành thông qua sự thao tác với
phôi dâu và túi phôi. Phôi ở các giai đoạn này có thể thu nhận mà không cần phẫu
thuật (đặc biệt là đối với bò), do vậy công việc chuyển gen được tiến hành rất dễ
dàng.
Phương pháp này có ý nghĩa đặc biệt đối với sự nghiên cứu kiểm tra di
truyền của các quá trình phát triển. Sự thuận lợi của nó là cho phép tạo ra một