bộ giáo dục và đào tạo bộ quốc phòng

học viện quân y

Tô Minh Hùng
nghiên cứu bo chế
mng đặt nhn khoa indomethacin
tác dụng kéo di

Chuyên ngành: Bào chế
Mã số: 62.73.01.05
tóm tắt luận án tiến sĩ dợc học Hà nội 2008 Công trình đợc hoàn thành tại Học viện Quân y

indomethacin", Tạp chí Y - Dợc học quân sự, 31 (Số Đặc san), tr.
146 - 152.
2 Tô Minh Hùng, Nguyễn Văn Minh, Phạm Ngọc Bùng (2007),
"ảnh hởng của các polymer hydroxypropylmethylcellulose,
polyvinyl alcol, polyvinylpyrrolidon tới sự hấp thu indomethacin
qua giác mạc thỏ", Tạp chí Y- Dợc học quân sự, 32 (6), tr. 12-19.
3 Tô Minh Hùng, Nguyễn Văn Minh, Phạm Ngọc Bùng (2008),
"Nghiên cứu định lợng indomethacin trong thủy dịch mắt thỏ
bằng phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao", Tạp chí Kiểm
nghiệm thuốc, 6, (1), tr. 16-19.

1
một số chữ viết tắt

FDA

: Food and Drug Administration
(Tổ chức quản lý thuốc và thực phẩm)
HPLC

: High Performance Liquid Chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
HPMC : Hydroxypropylmethylcellulose
PEG : Polyethylen glycol
PVA : Polyvinyl alcol
PVP : Polyvinylpyrrolidon
SKD : Sinh khả dụng


3
indomethacin có nhợc điểm chung của thuốc nhỏ mắt là sinh khả
dụng thấp và bệnh nhân phải nhỏ thuốc nhiều lần trong ngày. Do đó,
nhiều tác giả đã tập trung nghiên cứu nhằm khắc phục những nhợc
điểm này của thuốc nhỏ mắt indomethacin. Một số dạng bào chế mới
của indomethacin nh dung dịch tạo gel, hệ tiểu phân, hệ điều trị cấy
vào mắt đã đợc quan tâm nghiên cứu. Màng nhãn khoa
indomethacin dạng hoà tan cũng đã đợc Karatas A. và Baykara T.
nghiên cứu. Tuy nhiên, các tác giả mới nghiên cứu về cơ chế giải
phóng dợc chất in vitro, cha nghiên cứu sâu về thiết kế công thức
và thử nghiệm in vivo.
Để góp phần nâng cao sinh khả dụng cho thuốc nhãn khoa
indomethacin và giảm số lần dùng thuốc cho bệnh nhân, chúng tôi
tiến hành đề tài:
"Nghiên cứu bào chế màng đặt nhãn khoa indomethacin tác
dụng kéo dài "

Mục tiêu của luận án

- Xây dựng công thức bào chế màng nhãn khoa indomethacin tác
dụng kéo dài
- Đánh giá sinh khả dụng của màng nhãn khoa indomethacin trên mắt
thỏ
- Đánh giá khả năng dung nạp và tác dụng chống viêm của màng
nhãn khoa indomethacin trên mắt thỏ. 4
Những đóng góp mới của luận án

phân loại, u nhợc điểm, thành phần và các phơng pháp bào chế hệ
điều trị đặt tại mắt. Ngoài ra, phần này còn đợc tổng hợp thêm một
số vấn đề liên quan đến sinh khả dụng của hệ điều trị đặt tại mắt nh
các yếu tố ảnh hởng tới sinh khả dụng, các phơng pháp đánh giá
sinh khả dụng in vitro và in vivo, thẩm định phơng pháp phân tích
trong nghiên cứu sinh khả dụng của thuốc nhãn khoa.
Phần sơ lợc về indomethacin dùng trong nhãn khoa bao
gồm công thức hóa học của indomethacin, tính chất lý hóa, dợc
động học, tác dụng, chỉ định, chống chỉ định của indomethacin trong
nhãn khoa. Ngoài ra, phần này còn trình bày tóm lợc một số phơng
pháp định lợng indomethacin và một số công trình nghiên cứu về
các dạng bào chế indomethacin dùng trong nhãn khoa.

Chơng 2
Đối tợng, thiết bị
v phơng pháp nghiên cứu

2.1. Đối tợng và thiết bị nghiên cứu
Nguyên liệu gồm các hóa chất, dung môi đạt tiêu chuẩn dợc
điển hoặc đạt tinh khiết dùng trong phân tích.
Thỏ thí nghiệm khỏe mạnh, cân nặng từ 2,5 - 3,5 kg, đợc cung cấp
từ ban cung cấp động vật thí nghiệm - Học viện quân y.

7
Thiết bị phân tích gồm các máy HPLC, máy khuấy từ, đợc trang bị
tại Trung tâm đào tạo- nghiên cứu dợc - Học viện quân y.
2.2. Phơng pháp nghiên cứu
Phơng pháp nghiên cứu bao gồm 4 nhóm chính.
2.2.1. Phơng pháp định lợng indomethacin trong dung dịch đệm
và trong thủy dịch mắt thỏ

indomethacin qua giác mạc
* Phơng pháp đánh giá in vitro tốc độ giải phóng indomethacin
Dùng phơng pháp hòa tan trong cốc, không khuấy trộn.
Màng indomethacin đợc thấm ớt bằng dung dịch đệm rồi ép nhẹ
vào một lam kính (kích thớc 10 x 10 x 1mm), thả vào cốc thuỷ tinh
(đờng kính 2,5 cm, cao 3,5 cm) chứa 3 ml dung dịch đệm và ổn định
nhiệt độ 35 1
0
C. Sau mỗi giờ, dùng panh gắp nhẹ nhàng lam kính
cho sang cốc mới cũng chứa 3 ml dung dịch đệm nh trên. Tiếp tục
làm nh vậy trong thời gian 7 giờ. Lợng indomethacin giải phóng ra
đợc định lợng bằng phơng pháp HPLC.
* Phơng pháp đánh giá in vitro tốc độ thấm indomethacin
Tiến hành dựa trên mô hình bình Franz.
- Chuẩn bị mẫu giác mạc: Thỏ đợc mổ lấy nhãn cầu (sử dụng nhãn
cầu trong vòng 2 giờ sau khi giết thỏ). Dùng kéo cong để cắt và tách
riêng phần giác mạc trong suốt, để lại 1 viền củng mạc xung quanh
giác mạc để dễ kẹp trên bình Franz. Ngâm, rửa giác mạc nhẹ nhàng
trong dung dịch đệm phosphat cho sạch thuỷ dịch.
- Dụng cụ thử: Bình Franz
- Tiến hành: Đặt giác mạc vào đúng vị trí bình Franz, dùng kẹp để
kẹp lại. Cho vào ngăn dới 9 ml dung dịch đệm phosphat và 1 que
khuấy từ. Ngăn trên cho 1 ml dung dịch đệm phosphat. Bình Franz
đợc đặt vào cốc thuỷ tinh chứa nớc cất để điều nhiệt rồi toàn bộ

9
thiết bị đợc đặt trên máy khuấy từ. Điều chỉnh nhiệt độ 35 1
o
C và
tốc độ khuấy hằng định.

Màng nhãn khoa indomethacin đợc đóng gói đơn liều trong
lọ thuỷ tinh màu nâu, nút kín và đợc bảo quản ở nhiệt độ thực (30
2
0
C, độ ẩm 70 5%) trong 15 tháng. Sau định kỳ 3 tháng, kiểm
nghiệm màng theo tiêu chuẩn cơ sở để đánh giá độ ổn định.
2.2.3. Phơng pháp đánh giá sinh khả dụng của màng
indomethacin trên thỏ so với dung dịch nhỏ mắt indomethacin
Sử dụng mỗi thời điểm 06 thỏ. Mỗi thỏ đợc đặt 1 màng
indomethacin vào túi cùng 1 mắt. Mắt còn lại đợc nhỏ dung dịch
indocollyre 0,1% với liều nh sau: Nhỏ 3 lần, mỗi lần 1 giọt (50 l),
khoảng cách giữa các lần nhỏ là 2,5 giờ. Sau 15 phút, giết thỏ. Dùng
bơm tiêm 1ml hút 100 - 150 l thuỷ dịch cho vào lọ đựng mẫu, nút
kín. Bảo quản mẫu trong tủ lạnh -20
0
C không quá 1 tuần. Định lợng
indomethacin bằng phơng pháp HPLC đã nghiên cứu. Tiến hành
tơng tự nh trên nhng lấy mẫu ở các thời điểm 30 phút; 1h; 2h; 3h;
4h; 5h; 5,5h; 6h; 7h; 8h; 9h và 10h. Các thông số dợc động học nh
C
max
, T
max
và AUC đợc tính toán bằng quan sát trực tiếp các số liệu
thực nghiệm và nhờ sự trợ giúp của phần mềm Kinetica 4.4.
2.2.4. Phơng pháp đánh giá khả năng dung nạp và tác dụng
chống viêm của màng nhn khoa indomethacin
2.2.4.1. Phơng pháp đánh giá khả năng dung nạp của màng

Khả năng dung nạp của màng đợc đánh giá trên thỏ bằng

Cột C18, kích thớc 150 mm x 4,6 mm x 5m
Tốc độ dòng: 1ml/phút
Thể tích mẫu tiêm: 20 l
Detector UV, bớc sóng phát hiện 266 nm
Pha động: Acetonitril - Dung dịch đệm phosphat 0,01M
(30:70).

12
3.1.2. Kết quả về thẩm định phơng pháp phân tích
3.1.2.1. Phơng pháp phân tích indomethacin trong dung dịch đệm

* Độ chọn lọc: pic indomethacin đợc tách riêng trên sắc ký đồ
* Độ tuyến tính: hệ số tơng quan r đạt từ 0,99996 - 0,99999
* Khoảng đo mẫu: 0,1 - 10 g/ml
* Độ lặp lại: Hệ số biến thiên đạt từ 5,48 - 0,17%
* Độ đúng: 6,5 - 0,20%
* Giới hạn định lợng: 0,1g/ml
3.1.2.2. Phơng pháp phân tích indomethacin trong thủy dịch

* Độ chọn lọc: pic indomethacin đợc tách riêng trên sắc ký đồ
* Độ tuyến tính: hệ số tơng quan r đạt từ 0,99930 - 0,99978
* Khoảng đo mẫu: 0,1 - 10 g/ml
* Độ lặp lại: Hệ số biến thiên đạt từ 15,32 - 4,07%
* Độ đúng: 14,24 - 3,13%
* Giới hạn định lợng: 0,1g/ml
* Độ ổn định của mẫu sau 7 ngày bảo quản ở -20
0
C: Hàm lợng
indomethacin còn lại 96,67% (nồng độ 0,1 g/ml) và 97,80% (nồng
độ 10 g/ml).

Lợng
indomethacin
(mg)
Lợng
natri
alginat
(mg)
Loại polyme
phối hợp
(1134 mg)
Hóa
dẻo
(225
mg)
Dung
dịch
đệm
vừa đủ
CT1 15 126 HPMC Gly 100 ml
CT2 15 126 HPMC PEG 100 ml
CT3 15 126 HPMC Pro 100 ml
CT4 15 126 PVA Gly 100 ml
CT5 15 126 PVA PEG 100 ml
CT6 15 126 PVA Pro 100 ml
CT7 15 126 PVP Gly 100 ml
CT8 15 126 PVP PEG 100 ml
CT9 15 126 PVP Pro 100 ml
CT10 15 126 Natri alginat Gly 100 ml
CT11 15 126 Natri alginat PEG 100 ml
CT12 15 126 Natri alginat Pro 100 ml

nhãn khoa indomethacin. Trên cơ sở đó, tìm công thức tối u thoả

15
mãn các mục tiêu: Indomethacin đợc giải phóng đều đặn, kéo dài 7-
8 giờ và tốc độ thấm phải đạt mức cao. Do đó, thí nghiệm đợc thiết
kế nh sau:
* Các biến độc lập: Gồm 2 biến định lợng và 1 biến định tính đợc
trình bày ở bảng 3.16 và 3.17.
Bảng 3.16: Các biến định lợng

Biến định
lợng
Ký hiệu
Mức thấp
(-1)
Mức cơ sở
(0)
Mức cao
(+1)
Tỷ lệ % chất
hoá dẻo
X1 5 15 25
Tỷ lệ natri
alginat/PVA
X2
5/95
(5)
10/90
(10)
15/85

16
Bảng 3.19: Bảng thiết kế thí nghiệm

STT CT X1 X2 X3
1 CT13 5 5 Gly
2 CT14 15 5 Gly
3 CT15 25 5 Gly
4 CT16 5 10 Gly
5 CT17 15 10 Gly
6 CT18 25 10 Gly
7 CT19 5 15 Gly
8 CT20 15 15 Gly
9 CT21 25 15 Gly
10 CT22 5 5 PEG
11 CT23 15 5 PEG
12 CT24 25 5 PEG
13 CT25 5 10 PEG
14 CT26 15 10 PEG
15 CT27 25 10 PEG
16 CT28 5 15 PEG
17 CT29 15 15 PEG
18 CT30 25 15 PEG
19 CT31 5 5 Pro
20 CT32 15 5 Pro
21 CT33 25 5 Pro
22 CT34 5 10 Pro
23 CT35 15 10 Pro
24 CT36 25 10 Pro
25 CT37 5 15 Pro
26 CT38 15 15 Pro

3.2.3.5. Kết quả đánh giá các màng về tốc độ thấm indomethcin qua
giác mạc in vitro
Mặc dù tốc độ giải phóng nhanh nhng tốc độ thấm
indomethacin diễn ra rất chậm. Trong giờ đầu tiên chỉ có 1,59 -
8,51g indomethacin đợc thấm qua giác mạc, trong khi đó đã có
20,83 - 35,89 g indomethacin đợc giải phóng. Sau 7 giờ, lợng
indomethacin đợc thấm qua giác mạc cũng chỉ đạt từ 37,14 -
59,22g, tơng đơng với 21 - 40% tổng lợng indomethacin đợc
giải phóng trong ngăn trên của bình Franz, cha đạt đợc nồng độ
dợc chất cân bằng giữa 2 ngăn.
Lợng indomethacin đợc thấm từ 1 - 7 giờ có quan hệ tuyến
tính chặt chẽ theo thời gian với các hệ số tơng quan r đạt từ 0,9872 -
0,9996. Tốc độ thấm thay đổi từ 5,01 - 8,27 g/cm
2
/h.

18
3.2.3.6. Kết quả dự đoán công thức tối u

Với mục đích tìm công thức màng có khả năng giải phóng
indomethacin gần với động học bậc không, kéo dài giải phóng 7- 8
giờ và dợc chất giải phóng ra đợc thấm nhiều nhất, kết quả tính
toán từ phần mềm Modde 5.0 cho biết thành phần dự đoán của công
thức tối u nh sau:
Indomethacin 1%
Glycerin 15,16%
Hỗn hợp natri alginat và PVA 83,84%
Tỷ lệ giữa natri algianat và PVA 15/85
3.2.3.7. Bào chế công thức tối u


thỏ. Do đó, phơng pháp in vitro đợc đa vào xây dựng tiêu chuẩn
cơ sở cho màng nhãn khoa indomethacin.
3.2.3.11. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở màng

* Hình thức: Hình tròn, màu vàng nhạt, mềm dẻo, đờng kính 5,8 -
6,2 mm.
* Mất khối lợng do làm khô: Không quá 10%
* Định tính:
- Phổ tử ngoại trong khoảng 300 - 350 nm phải có 1 cực đại hấp thụ
tại 320 nm.
- Sắc ký đồ: Thời gian lu của mẫu chuẩn và mẫu thử trên sắc ký đồ
trong phần định lợng phải giống nhau
* Độ hoà tan: Phải đáp ứng các tiêu chuẩn sau đây:
Tỷ lệ indomethacin đợc giải phóng sau 1 giờ: 30 - 40%
Tỷ lệ indomethacin đợc giải phóng sau 3 giờ: 55 - 70%
Tỷ lệ indomethacin đợc giải phóng sau 5 giờ: 70 - 80%
Tỷ lệ indomethacin đợc giải phóng sau 7 giờ: > 80 %
* Độ đồng đều về hàm lợng: 85 - 115%
* Độ đồng đều về khối lợng: 85 - 115%

20
* Độ vô khuẩn: Phải vô khuẩn
* Định lợng: Hàm lợng indomethacin (C
19
H
16
ClNO
4
) trong màng
phải đạt từ 90-110% so với hàm lợng ghi trên nhãn.


21
nhỏ thuốc. Dợc chất duy trì đợc trong thuỷ dịch kéo dài 8 giờ.
Trong khi đó, nếu đặt 1 màng nhãn khoa indomethacin thì nồng độ
indomethacin bắt đầu định lợng đợc trong thuỷ dịch cũng là 15
phút sau khi dùng thuốc, nhng đạt cực đại sau 3 giờ và duy trì kéo
dài 9 giờ trong thuỷ dịch.
- Về nồng độ thuốc trong thuỷ dịch: Trong 30 phút đầu sau khi nhỏ
mắt (hoặc đặt thuốc), nồng độ indomethacin trong thuỷ dịch của 2
nhóm tơng đơng nhau (p > 0,05). Các thời điểm từ 1 giờ đến 5 giờ,
nồng độ indomethacin trong thuỷ dịch của nhóm dùng màng cao hơn
rõ rệt (p < 0,01). C
max
của nhóm dùng màng là 2,2535 g/ml, cao gấp
3,9 lần C
max
của nhóm dùng dung dịch nhỏ mắt (0,6572g/ml). Các
thời điểm từ 5,5 giờ đến 8 giờ, nồng độ indomethacin trong thuỷ dịch
của 2 nhóm tơng đơng nhau (p > 0,05).
- Về sinh khả dụng: SKD của màng cao gấp 2,9 lần SKD của thuốc
nhỏ mắt indomethacin 0,1%.
3.4. Kết quả đánh giá khả năng dung nạp và tác dụng chống viêm
của màng nhãn khoa indomethacin
3.4.1. Kết quả đánh giá khả năng dung nạp của màng
Kết quả cho thấy màng nhãn khoa indomethacin đợc dung
nạp tốt trên mắt thỏ. Không gây kích ứng mắt.
3.4.2. Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm của màng
- Hai ngày sau khi gây viêm thực nghiệm, mức độ viêm mắt rất nặng
và đồng đều trên cả 2 lô thỏ.
- Hai ngày tiếp theo, các mắt không đợc điều trị vẫn bị viêm mức độ

Glycerin 15,16%
Hỗn hợp natri alginat và PVA 83,84%
Tỷ lệ giữa natri algianat và PVA 15/85

23
- Thời gian giải phóng dợc chất in vitro và in vivo trên mắt thỏ kéo
dài 7 - 8 giờ
- Tốc độ giải phóng dợc chất gần với động học bậc không (chỉ số f2
so với động học bậc không đạt từ 50,59 3,99 đến 57,18 5,66)
- Tốc độ thấm dợc chất in vitro qua giác mạc mắt thỏ từ 6,98 0,33
đến 7,66 0,40 g/cm
2
/h
- Độ ổn định: 15 tháng ở điều kiện thực (30 2
0
C, độ ẩm 70 5%).
2. Đã đánh giá sinh khả dụng của màng nhãn khoa indomethacin
0,15mg trên mắt thỏ, so sánh với sinh khả dụng của thuốc nhỏ
mắt indomethacin 0,1% đang lu hành trên thị trờng.
- Qui trình đánh giá sinh khả dụng đợc xây dựng và thẩm định từ
giai đoạn lấy mẫu thủy dịch với thể tích nhỏ (100 - 200 l), bảo quản
mẫu đến giai đoạn xử lý mẫu và định lợng indomethacin bằng
phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Các chỉ tiêu độ chọn lọc, độ
tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng đều đạt các qui định của cơ quan
quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (FDA) về thẩm định phơng pháp
phân tích dợc chất trong dịch sinh học. Giới hạn định lợng là 0,1
g/ml, khoảng nồng độ đo từ 0,1 - 10 g/ml.
- Kết quả đánh giá sinh khả dụng trên mắt thỏ cho thấy màng đặt
nhãn khoa indomethacin có thời gian tác dụng kéo dài và có diện tích
dới đờng cong nồng độ dợc chất trong thủy dịch - thời gian