BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN CHƢƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƢỚC KC.04/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT GRANULOCYTE
COLONY STIMULATI FACTOR (G-CSF) NGƢỜI TÁI TỔ
HỢP ĐỂ HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ BỆNH GIẢM BẠCH CẦU HẠT
KC.04.13/06-10 Cơ quan chủ trì đề tài:
Trƣờng ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc Gia Tp. HCM
Chủ nhiệm đề tài:
TS. VÕ MINH TRÍ TP. Hồ Chí Minh - 2010
TP. Hồ Chí Minh - 2010MỤC LỤC

PHẦN I. MỞ ĐẦU 1
1. Thông tin chung 1
2. Nội dung KHCN của đề tài 1
PHẦN II. NỘI DUNG KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐÃ THỰC HIỆN 6
Chương I. Giới thiệu về nhân tố kích thích tạo dòng bạch cầu hạt G-CSF 6
Chương II. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen để tạo ra các dòng vi sinh vật
tái tổ hợp tổng hợp hiệu quả G-CSF 16
1. Nghiên cứu phân lập dòng gen mã hóa G-CSF người 16
2. Nghiên cứu tạo dòng E. coli tổng hợp G-CSF dạng thể vùi trong tế bào chất 20
3. Nghiên cứu tạo dòng E. coli tổng hợp G-CSF dạng tan trong tế bào chất 27
4. Nghiên cứu tạo dòng E. coli tổng hợp G-CSF dạng tan trong chu chất 33
5. Nghiên cứu tạo dòng nấm men P. pastoris tổng hợp và tiết G-CSF ngoại bào 38
Chương III. Nghiên cứu quy trình lên men chủng tái tổ hợp tổng hợp G-CSF ở
quy mô 50L 45
1. Nghiên cứu lên men dòng E. coli tái tổ hợp và cảm ứng tổng hợp G-CSF ở
dạng thể vùi trong tế bào chất bằng Jar fermentor ở quy mô 1L 45
2. Nghiên cứu lên men dòng E. coli tái tổ hợp và cảm ứng tổng hợp G-CSF ở
dạng tan trong tế bào chất bằng Jar fermentor ở quy mô 1 lít 47
3. Nghiên cứu lên men dòng E. coli tái tổ hợp và cảm ứng tổng hợp G-CSF ở
dạng tan trong chu chất bằng Jar fermentor ở quy mô 1 lít 50
4. Nghiên cứu lên men dòng nấm men P. pastoris tái tổ hợp và cảm ứng tổng
hợp G-CSF bằng Jar fermentor ở quy mô 1L 51
5. So sánh, lựa chọn chủng vi sinh tái tổ hợp sử dụng trong qui trình sản xuất G-
CSF tái tổ hợp 54



Amp Ampicilline
Amp
r
Ampicilline resistance
ANC Asolube neutrophil count
BHK Baby hamster kidney
B. subtilis Bacillus subtilis
bp base pair
CHO Chinese hamster ovary
CRH Cytokine receptor homologous
CSF Colony stimulating factor
DNA Deoxyribose Nucleic Acid
dH
2
O distilled water (nước cất)
dNTP deoxyNucleotide TriPhosphate
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylene Diamine TetraAcetic acid
EPO Erythropoietin
FDA Food And Drug Administration
FPLC Flow Protein Liquid Chromatography
G-CSF Granulocyte colony stimulating factor
g-csf Gen mã hóa cho protein G-CSF
G-CSFR Thụ thể của protein G-CSF (G-CSF receptor)
G-MCSF Granulocyte macrophage colony stimulating factor
GMK Green monley kidney
GMP Good Manufacturing Practice
IMAC Immobilized Metal-ion Affinity Chromatography
IL-1 Interleukine-1

Hình 1. Trình tự acid amin của protein G-CSF 8
Hình 2. Cấu trúc protein G-CSF 9
Hình 3. Sự điều hòa sản xuất G-CSF 10
Hình 4. Cấu trúc thụ thể G-CSF 11
Hình 5. Cấu trúc phức hợp tương tác giữa G-CSF và G-CSFR 12
Hình 6. Con đường tín hiệu trong tế bào khi G-CSF gắn với G-CSFR 13
Hình 7. Sự hoạt động và biệt hóa tế bào máu do G-CSF và các cytokine khác 15
Hình 8. Cấu trúc plasmid pET-his 22
Hình 9. Chứng minh sự biểu hiện protein G-CSF không mang thẻ tinh chế bằng
lai Western 23
Hình 10. Kiểm tra sự biểu hiện của G-CSF-his dạng thể vùi trong tế bào chất E.
coli BL21(DE3)/pEGf bằng điện di SDS-PAGE 25
Hình 11. Kiểm chứng 6xHis-TEV-GCSF bằng Western blot 26
Hình 12. . Kiểm tra và xác nhận sự biểu hiện của FTNH-GCSF trong tế bào E.
coli BL21(DE3)/pET-FGH bằng SDS-PAGE và Western blot 32
Hình 13. Kiểm chứng sự biểu hiện G-CSF trong chu chất của E. coli
BL21(DE3)/pET28b-GCSF bằng SDS-PAGE và Western blot 37
Hình 14. Kết quả kiểm chứng sự biểu hiện protein G-CSF của chủng P. pastoris
GS115/GCSF bằng lai western blot với kháng thể kháng G-CSF 43
Hình 15. Kết quả kiểm chứng sự biểu hiện protein G-CSF của chủng P. pastoris
GS115/GCSF sau quá trình lên men bằng Western blot với kháng thể kháng G-
CSF 53
Hình 16. Kết quả tinh chế G-CSF 70
Hình 17. Đánh giá sơ bộ kết quả tinh chế G-CSF bằng Quantity One 72
Hình 18. Kiểm tra cấu hình và độ tinh sạch protein bằng RP-HPLC 72
Hình 19. Kết quả chạy MS-MS protein G-CSF 82

BẢNG LIỆT KÊ CÁC PLASMID SỬ DỤNG VÀ CÁC VECTOR TÁI TỔ HỢP

Phụ lục
1.2.1
pUC57
(Fermentas) g-csf
mE

pG-GCSF hay
pUC57-GCSF

E.coli
DH5α/pUC57-
GCSF
Gen được thu
nhận từ
pB/G-CSF
không có các
trình tự His,
TEV, SP pET-GCSF

Protein biểu
hiện dạng thể
vùi trong tế
bào chất,
không dung
hợp với thẻ His

E.coli DH5α/pET-
GCSF

E.coli
BL21(DE3)/pET-
GCSF
Ph ụ l ục
1.2.1
pET28a
(Novagen) ftnh
E.coli
DH5α/pFHG

E.coli
BL21(DE3)/pFHG

phụ lục
1.3
T7 Ter
BamH
I
NdeI

g-csf

T7
P
T7
t
HindIII
NdeI
XhoI
T7
P
T7
t
HindIII


tiết là
endoxylanase

pET28b-GCSF

Biểu hiện dạng
tan trong chu
chất
E.coli
DH5α/pET28b-
GCSF

E.coli
BL21(DE3)/pET2
8b-GCSF
Phụ lục
1.4
pZERO-2
g-csf
mY


MF dưới sự
kiểm soát
promoter
5’-AOX1 pPICZ-GCSF
Protein biểu
hiện được tiết
ra ngoài môi
trường

E. coli
DH5α/pPICZ-
GCSF

cấp độ nhẹ thường ít nguy hiểm và không có dấu hiệu lâm sàng quan trọng.
Neutropenia cấp độ nặng có khả năng đe dọa tính mạng người bệnh nên cần
phải có các liệu pháp điều trị và các biện pháp hỗ trợ y tế.
2

Trong nhiều nguyên nhân gây neutropenia việc sử dụng thuốc có tác
động đến sự phân hủy bạch cầu trung tính sự sản xuất bạch cầu trung tính ở
tuỷ xương là một trong các nguyên nhân phổ biến nhất. Có nhiều loại thuốc
gây tác động trên như: antithyroid, macrolide, procainamide, clozapine…;
trong số này thuốc dùng trong hóa trị ung thư là loại gây neuropenia phổ biến
và nghiêm trọng nhất. Các bệnh nhân ung thư được chỉ định hóa trị có kết hợp
hay không kết hợp với xạ trị đều có nguy cơ bị neutropenia cao.
Hiện nay, tình hình ung thư trên thế giới đang có xu hướng gia tăng và là
một trong những nguyên nhân gây chết hàng đầu. Theo Tổ chức Y tế thế giới
WHO, trong năm 2005, cả thế giới có khoảng 7,6 triệu người chết vì ung thư
(chiếm khoảng 13% tổng số người chết toàn cầu); dự đoán vào năm 2015 là 9
triệu người và 2030 là 11,4 triệu người [19]. Các phương pháp điều trị ung thư
chủ yếu hiện nay là phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, miễn dịch trị liệu và kết hợp các
phương pháp. Trong đó hóa trị là phương pháp thường được sử dụng phổ biến
sau phẫu thuật và xạ trị. Ảnh hưởng rõ nhất của hóa trị ung thư là sự suy giảm
hệ miễn dịch và tình trạng tủy xương bị mất chức năng tạm thời, được biểu
hiện lâm sàng dưới dạng neutropenia. Các nghiên cứu đã cho thấy khoảng 40 -
80% các bệnh nhân ung thư được chỉ định hóa trị bị mắc neutropenia cấp độ
nặng [14]. Bệnh lý neutropenia mắc phải này đã gây nhiều khó khăn cho kế
hoạch hóa trị ung thư: khoảng 50% các bệnh nhân chỉ thực hiện được 80% kế
hoạch hóa trị do ảnh hưởng của neutropenia [10]. Nhiều trường hợp, nguy cơ
do neutropenia là nguyên nhân dẫn đến việc phải giảm liều hóa trị, làm kéo
dài thời gian điều trị hoặc làm gián đoạn kế hoạch hóa trị để hệ miễn dịch của
bệnh nhân phục hồi. Neutropenia còn làm tăng nguy cơ tử vong của người
bệnh: khoảng 5 - 7% trường hợp bị tử vong do neutropenia trong quá trình hóa

xương để thúc đẩy sự hồi phục số lượng neutrophil. Kể từ đó thị trường G-
4

CSF bắt đầu phát triển mở rộng và đang không ngừng tăng lên. Hiện nay trên
thế giới có trên 20 công ty sản xuất G-CSF tái tổ hợp và trong năm 2005,
lượng G-CSF tái tổ hợp tiêu thụ trên toàn thế giới đạt 4,6 tỷ đôla.
2.2. Nhu cầu sử dụng G-CSF trong điều trị bệnh tại Việt Nam
Ở Việt Nam, tình hình ung thư đang có xu hướng tăng cao, các bệnh
nhân ung thư cần điều trị ngày càng gia tăng. Theo thống kê của Bệnh viện K,
tỷ lệ người mắc bệnh ung thư trên 100.000 dân vào 2 năm 1995-1996 tại Hà
Nội là 149,8, tại TP.HCM là 127,4; số liệu năm 2000 là 141,6, không kém
nhiều so với các thành phố lớn khác trên thế giới. Theo WHO, số người chết
vì ung thư ở nước ta trong năm 2005 là 71.000 người chiếm 13% tổng số
người chết; dự đoán con số này sẽ tiếp tục tăng lên, đến năm 2030 sẽ chiếm
19,2% tổng số người chết. Do hóa trị là chỉ định cho nhiều bệnh nhân nên nhu
cầu sử dụng G-CSF để giảm nguy cơ của neutropenia là rất lớn. Thuốc G-CSF
được lưu hành tại Việt Nam hiện nay là Neupogen® (Filgrastim) do công ty
Amgen sản xuất và Hoffmann - La Roche phân phối. Theo Bệnh viện Ung
bướu TP.HCM, Neupogen đã được chỉ định để hỗ trợ điều trị ung thư bằng
hóa trị liệu tại Việt Nam. Ở bệnh nhân đã hóa trị, liều Neupogen khuyến cáo
là 0,5MUI (5mcg/kg/ngày), tiêm một lần trong ngày. Với một bệnh nhân có
thể trọng 60kg, lượng thuốc cần dùng là 1 lọ Neupogen 30MUI (300mcg hay
0,3mg). Giá thị trường của một lọ tiêm 300mcg/1ml Neupogen là 1.760.000
VND, còn rất cao so với thu nhập của người dân Việt Nam.
Vì vậy việc patent sản xuất G-CSF của công ty Amgen đã hết hạn vào
tháng 3/2006 là cơ hội cho việc sản xuất G-CSF giá thành rẻ ở Việt Nam.
Cho đến nay, việc nghiên cứu sản xuất và ứng dụng G-CSF làm thuốc hỗ
trợ điều trị giảm bạch cầu hạt do hóa trị ung thư chưa được quan tâm nghiên
cứu tại Việt Nam. Việc bản quyền sản xuất G-CSF trong E. coli của Amgen
hết liệu lực từ 03/2006 đã mở ra một cơ hội lớn cho các nước đang phát triển

thích sự tăng sinh và biệt hóa của tế bào máu tiền thân thành những dòng tế
bào khác nhau. Đến cuối những năm 1970, các nhà khoa học mới xác nhận đó
là các nhân tố kích thích CSF (colony stimulating factor) [11].
Cuộc cách mạng trong điều trị hỗ trợ cho bệnh nhân ung thư xảy ra vào
những nǎm 1990, nguyên nhân là tình trạng ức chế tủy thường xuyên xuất
hiện ở các bệnh nhân hóa trị liệu. Trước đây, tình trạng giảm bạch cầu trung
tính ở các bệnh nhân điều trị ung thư rất thường gặp khiến các bác sĩ phải
giảm hoặc ngừng liệu pháp điều trị. Nhằm hạn chế những ảnh hưởng do giảm
bạch cầu thì việc dùng các loại thuốc giúp tạo máu, tạo bạch cầu là điều cần
thiết và cấp bách.
Một trong những protein trị liệu mang tính cách mạng hóa trong điều trị
bệnh neutropenia và các bệnh nhiễm trùng có liên quan là dùng nhân tố kích
thích dòng bạch cầu (Granulocyte-Colony Stimulating Factor, G-CSF). G-
CSF có chức năng kích thích nguyên bào tủy tái sinh, phát triển và biệt hóa
theo hướng tạo bạch cầu hạt trung tính nhằm bổ sung lượng bạch cầu bị tiêu
hủy. Mặt khác, G-CSF còn thúc đẩy sự hoàn thiện chức năng của bạch cầu hạt
trung tính, sau đó huy động lượng bạch cầu này vào máu ngoại vi sẵn sàng
tham gia vào hàng rào miễn dịch cơ thể.
7

Trong ba thập niên qua, nhiều công trình nghiên cứu về cấu trúc, chức
năng cũng như phương pháp sản xuất protein G-CSF của người (G-CSF) đã và
đang được các nhà khoa học trên thế giới tiến hành. Gần đây, nhiều tác dụng
hữu ích của G-CSF cũng được khám phá như tăng khả năng thành công, giảm
sự đào thải tế bào/mô/cơ quan cấy ghép ở bệnh nhân ghép tạng, điều trị bệnh
tự miễn, bệnh AIDS… Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, các sản phẩm
protein G-CSF tái tổ hợp thương mại bao gồm Neupogen® (Filgrastim) và
Neulasta® (Pegfilgrastim) của công ty Amgen được sản xuất và nhu cầu sử
dụng các sản phẩm này không ngừng tăng cao. Năm 2005, lượng G-CSF tái tổ
hợp tiêu thụ trên toàn thế giới đạt 4,6 tỷ đôla. Tuy nhiên, giá một lọ thuốc bán

disulfide Cys36-Cys42 và Cys64-Cys74 nằm ở hai đầu đối diện nhau trong
vòng nối giữa xoắn A và xoắn B.
9 Hình 2. Cấu trúc protein G-CSF.
A. Mô hình cấu trúc phẳng B. Cấu trúc không gian
2. Nguồn gốc và cơ chế hoạt động
2.1. Nguồn gốc
G-CSF cũng như các loại nhân tố tăng trưởng (HGF) khác, được sản xuất
ở nhiều loại tế bào và mô khác nhau. G-CSF được sản sinh từ các nguyên bào
sợi, các đại thực bào và những tế bào nội mô (Hình 3) qua trung gian là các
cytokine (interleukine-1, interleukine-6 và nhân tố hoại tử khối u α (TNFα))
bằng con đường tín hiệu thông tin thứ hai (second-messenger).
Sau khi được tạo ra, G-CSF lập tức làm nhiệm vụ biệt hóa giúp cho sự
trưởng thành của bạch cầu trung tính từ những tế bào gốc tủy xương đồng thời
kích thích đưa chúng vào hệ máu ngoại vi để thực hiện chức năng sinh học.
10 Hình 3. Sự điều hòa sản xuất G-CSF.
2.2. Cơ chế hoạt động
Trong tế bào, để thực hiện chức năng của mình, bất cứ loại cytokine nào
hoạt động cũng cần phải có thụ thể. G-CSF cũng không ngoại lệ, chúng tương
tác thụ thể của mình để hoạt hóa con đường tín hiệu trong tế bào tiền thân của
bạch cầu trung tính.
Thụ thể của G-CSF (G-CSF receptor hay G-CSFR) (Hình 4) hiện diện
trên những tế bào tiền thân trong tủy xương và được kích thích bởi G-CSF. G-
CSFR gồm 3 vùng có chức năng khác nhau: vùng ngoài tế bào để tương tác
với G-CSF; vùng xuyên màng giúp định vị G-CSFR trên màng và vùng nằm

bị dimer hóa. Trong đó, STAT 3 là nhân tố quan trọng nhất, STAT3 được gắn
với tyrosine Y704 và Y744, làm nhiệm vụ truyền tín hiệu vào trong nhân để
kích thích biệt hóa tế bào (Hình 6).
Tuy nhiên yếu tố quan trọng nhất đóng vai trò “chìa khóa” trong chuỗi
tín hiệu là SOCS và Ship. SOCS gắn trực tiếp với G-CSFR và phosphoryl hóa
Y729. Ngược lại, Ship không gắn với G-CSFR nhưng tác động thông qua Shc,
Shc phosphoryl hóa Y764 và hoạt hóa protein Ras MAPK hình thành tín hiệu
hoạt hóa tăng sinh.
Ngoài ra, những thành viên của họ Src kinase (Lyn và Hck) cũng được
kích hoạt sau khi được phosphoryl hóa. Sau đó, Lyn có thể sẽ truyền tín hiệu
hoạt hóa trực tiếp Ras-MAPK hay gián tiếp thông qua P13 kinase. P13 kinase
theo đó kích thích Akt truyền tín hiệu vào nhân kích thích sự sống sót thông
qua ức chế apoptosis.
13 Hình 6. Con đường tín hiệu trong tế bào khi G-CSF gắn với G-CSFR.
Con đường tín hiệu trong tế bào kích thích bởi G-CSF là một quá trình
được điều hòa kiểm soát một cách chặt chẽ. Chính sự chặt chẽ, liên hoàn này
là yếu tố cốt lõi mà tế bào bạch cầu trung tính có thể trưởng thành, tồn tại ổn
định cũng như thực hiện chính xác vai trò sinh lý quan trọng.
3. Hoạt tính sinh học
G-CSF không chỉ là nhân tố điều hòa, cảm ứng sự tăng sinh, kích thích
biệt hóa, sống sót của dòng tế bào bạch cầu trung tính mà còn là nhân tố ổn
định và duy trì khả năng miễn dịch của cơ thể chủ. G-CSF ảnh hưởng trực tiếp
đến chức năng của bạch cầu trung tính trưởng thành qua con đường gây độc tế
bào phụ thuộc kháng thể (ADCC), thúc đẩy tiết acid arachidonic từ bạch cầu
trung tính. Ngoài ra, G-CSF còn có khả năng gắn các peptide hướng hóa
FMLP (N-formyl-methionel-leucyl-phenyl alanine) với bạch cầu trung tính
giúp quá trình thực bào qua trung gian kháng thể và điều hòa hoạt động của hệ