BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHƯƠNG TRÌNH KH&CN TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC KC10/06-10

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT
CHẾ PHẨM ENZYME TÁI TỔ HỢP STREPTOKINASE VÀ YẾU TỐ HOẠT
HÓA PLASMINOGEN MÔ (tPA) SỬ DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ
Mã số K10.28/06-10

Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ sinh học
Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Quyền Đình Thi

PGS. TS. Quyền Đình Thi

Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ
Hà nội, 2010 LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành nghiên cứu này, chủ nhiệm đề tài xin chân thành cảm ơn:
9 Bộ Khoa học và Công nghệ, Ban chủ nhiệm chương trình KC.10/06-10, Văn
phòng các chương trình trọng điểm cấp Nhà nước đã cấp kinh phí.
9 Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt để đề tài
thực hiện đúng tiến độ.
9 Các đơn v
ị phối hợp: Viện Kiểm định Quốc gia Vaccine và sản phẩm y tế;
Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương; Trung tâm phòng chống độc – Học viện
Quân y; Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gene và Phòng Hóa sinh
protein – Viện Công nghệ sinh học
9 Các cán bộ tham gia đề tài và một số cộng sự khác.

DANH SÁCH CÁN BỘ THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
TT Họ và tên Cơ quan Trách nhiệm trong đề tài

1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1 Bệnh nghẽn mạch và hướng điều trị 2
1.1.1 Bệnh nghẽn mạch 2
1.1.2 Điều trị bệnh nghẽn mạch 3
Các thuốc điều trị thế hệ 1 3
Các thuốc điều trị thế hệ 2 4
Các thuốc điều trị thế hệ 3 4
1.2 Thuốc điều trị bệnh nghẽn mạch có bản chất enzyme 6
1.3 Tình hình nghiên cứu SK 9
1.3.1 Giới thiệu chung về SK 9
1.3.2 Tình hình nghiên cứu SK tái tổ hợp trên thế giới 12
Nhân dòng và biểu hiện trong E. coli 12
Nhân dòng và biểu hiện trong Pichia pastoris 14
Nhân dòng và biểu hiện trong Bacillus 15
Nhân dòng và biểu hiện trong các tế bào chủ khác 15
1.3.3 Tình hình nghiên cứu trong nước 16
1.4 Tình hình nghiên cứu biểu hiện tPA 17
1.4.1 Chất hoạt hóa plasminogen mô người 18
1.4.2 Vai trò của tPA trong quá trình làm tan máu đông 20
1.4.3 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 21
1.4.4 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 22
1.5 Mục đích và sản phẩm cần đạt của đề tài 22
2 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24
2.1 Vật liệu và hóa chất 24
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24
Các chủng liên cầu khuẩn 24
Các chủng vi sinh vật chủ, vector nhân dòng và biểu hiện 24
Mẫu mô và máu 24
Các dòng tế bào động vật chủ, vector biểu hiện 24
2.1.2 Hóa chất và thiết bị 25

Tách chiết RNA tổng số 38
RT-PCR để nhân cDNA 38
Tạo dòng và xác định trình tự gene 39
Thiết kế plasmid biểu hiện 39
Tinh chế vector biểu hiện (Kit Qiagen for maxi-prep) 40
Phần mềm phân tích DNA 40
Nuôi cấy tế bào CHO-S 41
Biểu hiện tPA ở tế bào CHO-S 41
Tinh sạch sơ bộ tPA từ E. coli 42
Xác định hoạt tính tPA 42
Sơ chế tPA 42
Tinh chế tPA 43
2.2.6 Mô hình đột quỵ não thực nghiệm và so sánh tác dụng của tPA 44
2.2.7 Đánh giá các ảnh hưởng của tPA tới một số chỉ tiêu huyết học, chức năng gan thận và
các tác dụng phụ 47

3 NỘI DUNG KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 48
A. NỘI DUNG (1+3+4): NGHIÊN CỨU QTCN SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SK TÁI TỔ HỢP 48
3.1 Phân lập chủng gây tan huyết 48
3.2 Nhân dòng, phân tích gene sk từ S. pyogenes và S. equisimilis 52
3.3 Thiết kế, biểu hiện gene sk từ S. pyogenes DT17 ở E. coli 55
3.3.1 Thiết kế, biểu hiện gene sk trong pET22b
+
55
Biểu hiện SK ở E. coli BL21 55
Biểu hiện SK ở E. coli BL21 (DE3) plysE và plysS 56
3.3.2 Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp SK 58
Nhiệt độ sinh trưởng 59
Nhiệt độ sinh tổng hợp SK tối ưu 59
pH môi trường ban đầu tối ưu 60

pH môi trường nuôi cấy tối ưu 81
Nồng độ chất cảm ứng tối ưu 81 3.6.5 Tinh sạch SK từ P. pastoris 81
3.6.6 Đánh giá tính chất của SK tái tổ hợp từ P. pastoris 83
Độ bền nhiệt độ 83
Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền 83
Ảnh hưởng của chất tẩy rửa 84
Ảnh hưởng của ion kim loại 85
3.7 Sản xuất chế phẩm SK 85
3.7.1 Lên men chủng E. coli BL21 tái tổ hợp BLSK.2 85
3.7.2 Sản xuất SK-his
+
tái tổ hợp sạch 85
Thu dịch SK và loại bỏ nội độc tố 85
Tinh sạch SK 87
3.8 So sánh một số tính chất hóa lý của SK tái tổ hợp với SK thương phẩm 89
So sánh hoạt tính riêng 89
So sánh độ bền nhiệt 89
B. NỘI DUNG 2+3+4: NGHIÊN CỨU QTCN SẢN XUẤT CHẾ PHẨM TPA TÁI TỔ HỢP 91
3.9 Nhân dòng và xác định trình tự gene mã hóa tPA người 91
3.9.1 Nhân dòng và phân tích trình tự gene mã hóa tPA người 91
RNA tổng số 91
cDNA mã hóa tPA 91
Tạo plasmid nhân dòng 91
Phân tích trình tự tPA 92
3.9.2 Sản xuất chế phẩm tPA tái tổ hợp 95
Chọn vector và dòng tế bào thích hợp 95
Quy trình nuôi cấy tế bào 96

APS Ammonium persulphate
B. subtilis Bacillus subtilis
DNA Deoxyribonucleic acid
E. coli Escherichia coli
IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
IU International unit
kb Kilobase
kDa KiloDalton
LB Luria and Bertani
OD Optical density
P. pastoris Pichia pastoris
PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis
sak
Gene mã hóa staphylokinase
SDS Sodium dodecyl sulfate
sk
Gene mã hóa streptokinase
SK Streptokinase
SOC Super Optimal broth with Catabolite repression
Taq
Thermus aquaticus polymerase
rpm Round per minute
v/v Volume/volume
w/v Weight/volume

1

BÁO CÁO TỔNG HỢP
MỞ ĐẦU
Hiện nay, bệnh tim mạch là nguyên nhân số một gây tử vong tại nhiều quốc gia

Viện Công nghệ sinh học với sự hỗ trợ kinh phí nghiên cứu của Bộ KH&CN, chương
trình KH&CN trọng điểm cấp Nhà nướ
c KC10-06/10 đã tiến hành nghiên cứu đề tài:
Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme tái tổ hợp
streptokinase và yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (tPA) sử dụng trong điều trị.
2

1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Bệnh nghẽn mạch và hướng điều trị
1.1.1

Bệnh nghẽn mạch
Bệnh nghẽn mạch xảy ra khi huyết khối làm tắc tĩnh mạch hoặc động mạch. Tùy
thuộc vị trí nghẽn mạch, bệnh được chia thành hai thể là tắc động mạch và tắc tĩnh
mạch.
Bệnh tắc tĩnh mạch do yếu tố V: Yếu tố nguy cơ thông thường của tắc nghẽn tĩnh
mạch là xuất hiện yếu tố V Leiden, một biến thể củ
a yếu tố V của quá trình đông máu.
Biến thể này bị bất hoạt rất chậm, giảm 10 lần so với nguyên thể. Điều này làm cho nó
tồn tại lâu hơn trong máu và làm cho máu ở tình trạng quá đông. Một copy của gene
mã hóa yếu tố V Leiden sẽ làm tăng nguy cơ nghẽn mạch lên 4-8 lần, trong khi đó với
2 copy của gene này nguy cơ sẽ tăng tới 80 lần. Tỷ lệ đột biến gene của yếu tố V
Leiden chiếm 20-40% các bệnh nghẽn mạch và tần suất bệnh là 5% trong quần thể dân
cư [2].
Bệnh nghẽn mạch do thiếu antithrombin: Antithrombin có chức năng ức chế hoạt
động của một số các yếu tố đông máu như thrombin, các yếu tố IXa, Xa thông qua
hình thành phức hợp bền vững với rất nhiều yếu tố khác nhau. Heparin và heparan
sulfat làm tăng hoạt tính của antithrombin lên gấp 1000 lần.
Sự thiếu hụt antithrombin là một trong nh
ững nguyên nhân gây nên bệnh tắc

là nguyên nhân gây tử vong ở lứa tuổi trung niên và tuổi già.
Khi nhận ra rằng sự phân giải fibrin có thể được thực hiện trong cơ thể sống bởi
một quá trình bao gồm s
ự chuyển hóa plasminogen không hoạt động thành plasmin,
một enzyme hoạt động, người ta đã nghĩ đến cách điều trị mới là sử dụng các chất hoạt
hóa plasminogen (PA). Các nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra rằng cách tiếp cận tốt nhất
để điều trị chứng nghẽn mạch (hòa tan huyết khối) là tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch một
enzyme có khả năng chuyển hóa plasminogen thành plasmin. Các enzyme thường
được sử dụng nhất trong cách
điều trị này là streptokinase từ vi khuẩn và urokinase
(uPA) từ nước tiểu của người. Trong 20 năm gần đây, người ta còn sử dụng 3 enzyme
phân giải cục nghẽn mới trong một số trường hợp là arvin (từ một loài rắn độc ở Mã
Lai), reptilase (từ một loài rắn ở Nam Mỹ) và brinase (từ một loài nấm mốc
Aspergillus oryzae) [4].
Việc sử dụng và nghiên cứu thuốc làm tan huyết khối để điề
u trị các rối loạn huyết
khối gây tắc mạch bắt đầu vào nǎm 1933. Các nghiên cứu tập trung vào tác dụng phân
hủy fibrin của các chất phân lập từ cầu khuẩn tan huyết beta. Tuy nhiên do số liệu về
hiệu quả sử dụng thuốc thời gian đó không đầy đủ, nên việc dùng thuốc làm tan huyết
khối bị hạn chế. Dẫn liệu đầu tiên sử dụng trị liệu làm tan huyết kh
ối để điều trị nhồi
máu cơ tim (AMI) bắt đầu vào nǎm 1958 khi Fletcher sử dụng trị liệu streptokinase
liều cao, kéo dài [5]. Việc sử dụng các chất có bản chất protein để điều trị AMI có thể
được phân thành 3 giai đoạn theo Bachmann [6] như sau:
Các thuốc điều trị thế hệ 1
Việc thử nghiệm điều trị AMI bằng SK lần đầu tiên được nhóm nghiên cứu của
tr
ường đại học St. Louis, Mỹ thực hiện vào những năm cuối của thập kỷ 60 [5, 7, 8].
Một vài năm sau, UK được phát hiện là một chất gây tan huyết và được chính Fletcher
và sau đó là Sasahara et al. (1967) dùng điều trị tắc mạch phổi [9]. Mối quan tâm về sử

đường tĩnh mạch và bằng
placebo. Tỷ lệ tử vong giảm đáng kể ở những bệnh nhân được điều trị bằng
streptokinase trong vòng 6 giờ đầu. Đặc biệt, ghi nhận tỷ lệ tử vong giảm tới 50% đối
với bệnh nhận được điều trị trong vòng 1 giờ từ lúc bắt đầu triệu chứng [20].
Các thuốc điều trị thế hệ 3
Sau khi ch
ứng minh nút huyết khối là trung gian xẩy ra nhồi máu cơ tim cấp
(AMI), tính khả thi của việc dùng khẩn cấp streptokinase trong động mạch vành được
chứng minh và mang lại tác dụng có lợi cho cơ tim bệnh nhân. Thử nghiệm SK trong
mạch vành ở Western Washington, đã chứng minh giá trị của việc trị liệu này [21, 22].
5

Vào những năm 1990, qui mô điều trị được mở rộng với các thuốc gây tan huyết
khác nhau như thử nghiệm GUSTO (ứng dụng toàn cầu chất hoạt hóa plasminogen của
mô và streptokinase để điều trị nghẽn mạch vành) hay GISSI-2, ISIS-3 so sánh SK và
tPA [23, 24]. Đây là thời kỳ của những sáng tạo to lớn của loài người. Hàng trăm thể
đột biến của tPA và UK, các thể lai có chứa các tiểu phần của tPA, UK và
plasminogen đã được tạ
o ra và thử nghiệm [25, 26]. Trong khi tìm kiếm các chất có
khả năng liên kết với fibrin tốt hơn, một hợp chất hai chức năng được tạo ra gồm có
PA liên kết antifibrin hoặc kháng thể kháng tiểu cầu và các chất đặc hiệu cao với fibrin
như staphylokinase và PA từ loài dơi quỷ đã được nhân dòng và thử nghiệm trên động
vật, sau đó là trên người. Những thể đột biến của tPA có thời gian bán phân hủy dài
hơn như
reteplase và tenectaplase (TNK-tPA) được tạo ra. Những thử nghiệm lâm
sàng tiếp theo sau đó với những thuốc làm tan huyết khối gồm có streptokinase (SK),
activase (tPA), retavase (r-PA) và TNK-tPA ghi nhận có sự cải thiện về tỷ lệ sống sót
ở các bệnh nhân bị nhồi máu cơ tim cấp tính được điều trị tan huyết khối [24].
Cuối những nǎm 1980, các nhà khoa học đã sử dụng công nghệ sinh học và công
nghệ tái tổ hợp DNA để tạo ra nhiều thu

trị. Một trong các giải pháp hữ
u hiệu được áp dụng là anisoyl hóa phức hợp chất hoạt
hóa plasmin streptokinase (APSAC) với tên thương mại là Eminase của Tập đoàn
thương mại Beecham. Trong đó, gốc serine của plasmin, một vị trí quan trọng đối với
phản ứng xúc tác, bị acyl hóa thuận nghịch. Kết quả điều trị bằng APSAC là sự hoạt
hóa plasminogen diễn ra chậm hơn do việc khử acyl cho serine trong phức hợp xảy ra
rất chậm trong hệ th
ống mạch máu [15]. Điều này cũng dẫn tới việc giảm lượng
plasmin tự do trong hệ tuần hoàn và kết quả là quá trình thủy phân fibrin trở nên hiệu
quả hơn với các liều điều trị thấp hơn.
Rõ ràng, hiểu biết và chuyên môn trong dùng thuốc đã được mở ra trong giai đoạn
chừng 15 nǎm và có thay đổi đáng kể trong điều trị và tiên lượng AMI.
1.2 Thuốc điều tr
ị bệnh nghẽn mạch có bản chất enzyme
Có 5 thuốc tan huyết khối được phép dùng ở Mỹ: alteplase (tPA tái tổ hợp);
streptokinase (SK), tách chiết từ cầu khuẩn tan máu beta; urokinase (UK), có nguồn
gốc từ chất chiết tế bào thận người; phức chất hoạt hóa streptokinase plasminogen
anisoylat hóa (APSAC); và tenecteplase, một dạng biến đổi của chất hoạt hóa
plasminogen của mô người (tPA) gắn với fibrin và làm biến đổi plasminogen thành
plasmin.
Streptokinase (SK) là một loại thuốc rất hi
ệu quả và rẻ, do nó là một sản phẩm
của vi khuẩn. SK bám vào plasminogen tạo nên phức enzyme. Phức này xúc tác
chuyển hóa plasminogen thành dạng hoạt động là plasmin có khả năng phân hủy fibrin
làm tan huyết khối trong lòng mạch. Nghiên cứu trên các bệnh nhân tình nguyện chỉ ra
rằng, huyết khối tĩnh mạch bị hòa tan khi được tiêm streptokinase vào tĩnh mạch. Do
đó, enzyme này được lựa chọn sử dụng trong điều trị bệnh tắc nghẽn tĩnh mạch sâu và
t
ắc mạch phổi [29].
tPA, yếu tố hoạt hóa của tổ chức, được sản xuất bằng con đường tái tổ hợp cũng

liều APSAC cần thi
ết để làm tan huyết khối gây tình trạng phân hủy toàn thân [15].
Tenecteplase là chất hoạt hóa plasminogen dạng mô TNK tái tổ hợp đặc hiệu tiêu
fibrin, chúng có tác dụng tiêu huyết khối trên hệ thống phân hủy fibrin nội sinh để biến
plasminogen thành plasmin. Không giống streptokinase hoặc urokinase, phần lớn tác
dụng của alteplase hoặc tenecteplase phụ thuộc vào sự có mặt fibrin. Chúng chỉ
chuyển hóa một lượng tối thiểu plasminogen thành plasmin khi không có fibrin.
Tenecteplase làm tǎng tính đặc hiệu fibrin so với alteplase, tuy nhiên ý nghĩa lâm sàng
của đặc hi
ệu fibrin vẫn chưa được xác định [31].
Ngoài 5 thuốc như kể trên, hiện nay nattokinase cũng được ứng dụng rộng rãi để
điều trị các trường hợp có trạng thái đông máu cao. Nattokinase có các tác dụng hòa
tan trực tiếp fibrin, ngăn cản sự đông máu và sự tạo thành huyết khối bằng cách làm
tăng quá trình sản xuất plasmin và các yếu tố hòa tan cục nghẽn khác của cơ thể, bao
8

gồm urokinase nội sinh; kìm hãm ACE, enzyme chuyển hóa angiotensin, vì vậy làm
giảm áp lực của máu. Enzyme tự nhiên này có nhiều hứa hẹn trong việc điều trị các
bệnh tim mạch. Nattokinase được dùng như một chế độ bổ sung dinh dưỡng giúp duy
trì và tăng cường khả năng phân hủy fibrin bình thường của cơ thể nhằm hỗ trợ điều trị
và phòng ngừa các bệnh lý có liên quan tới huyết khối như viêm động-tĩnh mạ
ch, bệnh
tim thiếu máu, đau thắt ngực, suy giảm trí nhớ ở người già, đột quỵ… [32, 33].
Ngoài ra, một số thuốc khác đang trong giai đoạn thử nghiệm như arvin, brinase,
reptilase v.v. Arvin, brinase và reptilase được sử dụng kém thường xuyên hơn nhưng
có khả năng thay thế cho heparin như là chất kháng đông. Tuy nhiên chúng chưa được
chấp nhận rộng rãi do các nghiên cứu lâm sàng của chúng còn hạn chế.
Reptilase, một enzyme có khả năng cắt chuỗi peptit A trên fibrinogen,
được tách
chiết từ nọc rắn Nam Mỹ Bothrops atrox. Các nghiên cứu chỉ ra rằng việc sử dụng

Lumbrokinase là bột giun đất Lumbricus rubellus, enzyme thủy phân fibrin. Do có ái
lực cao với fibrin nên Lumbrokinase khắc phục được những ảnh hưởng bất l
ợi gây
chảy máu. Chế phẩm này có thể có một ảnh hưởng đáng kể trong việc ngăn ngừa và
điều trị bệnh thiếu máu não cục bộ. Bolouke có thể được áp dụng rộng rãi trong việc
điều trị bệnh nhồi máu cơ tim, nhồi máu phổi, điếc và mù lòa do tắc mạch. Boluoke rất
dễ sử dụng có thể được sử dụng trường diễn làm một tác nhân chống đ
ông. Boluoke
không phản ứng ở trong dạ dày, ruột, nó có thể được sử dụng như là một chất thay thế
đối với bệnh nhân không thể dùng aspirin. Boluoke cũng có thể được sử dụng trong
việc ngăn ngừa và điều trị tình trạng đông máu cao ở bệnh nhân mắc các bệnh mạn
tính như bệnh tiểu đường, bệnh tim phổi, u ác tính, bệnh lupus ban đỏ, bệnh tăng hồng
cầu, nghẽn m
ạch, viêm thận tiểu cầu, bệnh thiếu máu do chảy máu và bệnh gan. Là
thuốc chống đông máu và nghẽn mạch duy nhất dưới dạng thuốc uống mà có hoạt tính
như urokinase và tPA, Boluoke có thể được áp dụng trong điều trị bệnh nghẽn mạch
phối hợp với các thuốc chống đông máu khác. Từ năm 1990, bệnh viện Xuanwu của
trường y Jiangxi Medical College đã nghiên cứu phản ứng lâm sàng và đặc tính đông
máu của 453 b
ệnh nhân bị bệnh thiếu máu não. Kết quả chỉ ra rằng thuốc có hiệu quả
với 93% bệnh nhân, trong đó, đáp ứng tốt đạt tỷ lệ 73% [35].
1.3 Tình hình nghiên cứu SK
1.3.1

Giới thiệu chung về SK
Streptokinase (SK) (EC 3.4.99.22) là một protein ngoại bào do SK do các chủng
Streptococcus nhóm A, C và G sinh ra. SK được coi là độc tố nguy hiểm của
Streptococcus do nó tạo ra plasmin, một chất làm lan truyền vi khuẩn từ nơi tập trung
ban đầu thành tình trạng nhiễm trùng bởi hiện tượng tiêu sợi huyết và thoái hóa dịch
ngoại bào và các cấu thành của màng cơ sở.

giữa amino acid 144 và 218 tạo thành vòng thứ hai (vòng 170) lại thể hiện s
ự không
đồng nhất trong trình tự. Nghiên cứu của Sergio và Kenneth (2005) chỉ ra rằng các
chuỗi bên của các amino acid không bảo thủ nằm trong vòng 170 được định vị trên bề
mặt, nằm cách xa nửa tiếp xúc với plasmin của SK, không có ảnh hưởng đến hoạt hóa
plasminogen. Điều này cho thấy rằng tính đa hình của SK không liên quan trực tiếp
đến liên kết và hoạt hóa plasminogen, song thay vào đó, có thể quyết định đặc điểm
sinh học liên quan đến bệnh lý củ
a chủng vi sinh vật [39]. Có thể khẳng định rằng,
vùng cấu trúc β của phân tử streptokinase (SK) rất cần thiết cho việc hoạt hóa
plasminogen và là một vùng có trình tự đa dạng liên quan đến sự viêm nhiễm và bệnh
11

tật của các chủng Streptococcus nhóm A. Quá trình sinh đột biến của vùng đa hình này
không làm biến đổi khả năng hoạt hóa plasminogen của protein này mà có thể coi như
biến đổi chức năng đối với bệnh do Streptococcus gây nên [41].
Streptokinase có khả năng liên kết và hoạt hóa plasminogne người và có thể đóng
vai trò quan trọng trong độc tính của Streptococcus do tạo ra hoạt tính phân giải
protein trên bề mặt tế bào vi khuẩn và làm cho việc xâm nhập các tổ chức củ
a vật chủ
được dễ dàng hơn [37].
Từ những năm 1933, Tillet và Garner đã khám phá khả năng phân hủy huyết
khối của SK và cho rằng nó có hoạt tính enzyme trực tiếp đối với fibrin và gọi là
fibrinolysin [42]. Song cho đến năm 1941, Milestone đã chứng minh được tác động
gián tiếp của SK đối với fibrin thông qua việc hoạt hóa plasminogen - một chất ức chế
quá trình đông máu [43]. Năm 1945, Christensen sau khi nghiên cứu SK từ các dịch
chiết vi khuẩn Streptococcus đã chính th
ức đặt tên cho nó như được gọi ngày nay [44].
Cơ chế hoạt hóa và ức chế plasminogen trong quá trình phân hủy fibrin được mô
tả trong hình 1.2 [45, 46]. Theo đó, các chất hoạt hóa (CHH) kết hợp với plasminogen


Tình hình nghiên cứu SK tái tổ hợp trên thế giới
SK được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh nghẽn mạch. Tuy nhiên SK được
tách chiết từ những chủng tự nhiên gây bệnh cho con người và năng suất thấp là những
lý do chính để tiến hành nghiên cứu sản xuất SK tái tổ hợp. Có 3 loài được sử dụng
phổ biến trong việc nhân dòng và biểu hiện gene là Streptococcus pyogenes,
S. equisimilis và S. uberis. Hiện có 142 trình tự gene mã hóa SK (sk) được đăng ký
trong GenBank, trong đó có 115 gene từ các chủng
Streptococcus pyogenes, 23 gene
từ các chủng S. equisimilis và 4 gene mã hóa SK từ các chủng S. uberis.
Nhân dòng và biểu hiện trong E. coli
Năm 1984, Malke et al. đã nhân dòng thành công gene mã hóa SK từ chủng
S. equisimilis H46A, biểu hiện trong E. coli và S. sanguis thu được SK có đặc tính sinh
học như chủng tự nhiên. Để biểu hiện trong E. coli, tác giả đã sử dụng vector
pACYC184 và pBR322. Kết quả nghiên cứu cho thấy SK có mặt cả ngoại bào 17%,
nội bào 52% và thể vùi 30% với hoạt tính thu được dao động từ 8 đến 100 U/ml d
ịch
nổi môi trường.
Năm 1989, Walter et al. đã nhân dòng gene mã hóa SK từ chủng S. pyogenes type
1 và được Estrada et al. (1992) biểu hiện trong E. coli W3110 cho SK có hoạt tính như
SK tự nhiên. Hiệu suất biểu hiện đạt 25% protein tổng số [51].
Ko et al. (1995) đã nhân dòng sk từ chủng S. equisimilis và biểu hiện trong
E. coli. Họ đã thay thế trình tự peptide tín hiệu của SK bằng peptide tín hiệu ompA, sử
dụng vector biểu hiện pKK223-3 dưới sự kiểm soát củ
a tac promoter làm vector biểu
hiện trong E. coli JM109. Chủng tái tổ hợp được nuôi biểu hiện trong môi trường LB
thông thường ở 30°C. Hoạt tính của dịch nuôi cấy đạt 5.000 U/ml sau 12 giờ cảm ứng
bằng IPTG, trong đó, 95% SK biểu hiện được tiết ra ngoại bào và thể nội màng. Đặc
biệt, hoạt tính SK trong dịch nổi môi trường tăng mạnh sau 4 giờ cảm ứng và đạt cực
đại sau 10 giờ cảm ứng [52]. Cũng vào năm này, Kubo

có sự khác biệt như vậy, nhưng các SK này cùng có một cách thức tương tác với
plasminogen như nhau và các plasminogen của người, ngựa, lợn đều bị cắt cùng tại
một vị trí bảo thủ cao.
Năm 2007, Reza et al. đã sử dụng vector pGEX-4T-2 để biểu hiệ
n SK trong
E. coli với mức biểu hiện 50% protein tổng số. Đây là vector sử dụng tac promoter và
mang gene mã hóa glutatione S transferase (GST). GST kết hợp với SK được cho là
làm tăng độ bền của SK. Nhóm nghiên cứu đã biểu hiện trong 3 dòng tế bào E. coli
BL21 là E. coli BL21 (DE3); E. coli BL21 (DE3) plysS và E. coli BL21 (DE3)
CodonPlus. Các dòng tế bào E. coli BL21 này thiếu hụt các sản phẩm gene protease
trong bào tương như Lon, OmpT, DegP và HtpR với mục đích tạo năng suất biểu hiện
cao cho protein hội nhập. K
ết quả nghiên cứu cho thấy tế bào E. coli BL21 (DE3)
plysS cho năng suất cao nhất tới 15000 U/ml dịch nuôi cấy [58].
Để nâng cao năng suất biểu hiện của chủng E. coli tái tổ hợp, nhiều tác giả đã cải
tiến điều kiện nuôi cấy. Năm 1999, Zhang et al. sử dụng nuôi lắc bổ sung dưỡng chất
để tăng năng suất biểu hiện SK trong E. coli. Năng suất biểu hiệ
n đạt
14

12,9 g cho 20 lít dịch nuôi cấy (0,65 g/L). Mới đây, Goyal et al. (2009) đã nghiên cứu
phương pháp nuôi lắc có bổ sung dưỡng chất kết hợp với tối ưu các điều kiện nuôi cấy
để biểu hiện cao sản SK tái tổ hợp trong E. coli [59]. Các tác giả đã khảo sát nồng độ
oxy hòa tan, nguồn nitơ và pH môi trường đến sinh trưởng tế bào và biểu hiện nội bào
của SK trong E. coli BL21 (DE3). Tăng nồng độ oxy hòa tan từ 30% lên 50% không
thấy có ảnh hưởng đáng kể tới nuôi lắc, song đối với nuôi lắc có bổ sung dưỡng chất
thì năng suất biểu hiện tăng vượt bậc, từ 188 mg/L lên 720 mg/L. Việc bổ sung cao
nấm men và tryptone vào môi trường nuôi cấy, đồng thời kiểm soát pH môi trường
bằng NaOH cũng làm tăng đáng kể năng suất biểu hiện (gấp tới 2 lần). Tổng hợp các
điều kiện nuôi cấy, nă

pH 7,2; nhiệt độ 30,4°C và năng suất đạt 2136 U/ml. Tuy nhiên các nghiên cứu thực tế
cho năng suất đạt 2089 U/ml, tăng 95% so với năng suất ban đầu [62].
Nhân dòng và biểu hiện trong Bacillus
Năm 1986, Klessen et al. lại tiếp tục biểu hiện gene sk trong Bacillus subtilis, tuy
nhiên hoạt tính SK lại bị giảm ở cuối pha sinh trưởng do các protease của chính
B. subtilis tiết ra làm bất hoạt [63].
Năm 1994, Wong et al. đã sử dụng gene nhân dòng sẵn có để biể
u hiện trong
chủng B. subtilis WB600 là chủng đã đột biến mất 6 protease ngoại bào. Các nhà
nghiên cứu thấy rằng trong quá trình tiết SK ra môi trường, 10-20% SK bị thoái hóa từ
dạng 47 kDa thành dạng 44 kDa. Dạng SK này có trình tự đầu N như nhau, song bị cắt
ngắn 31 hoặc 32 gốc amino acid đầu C. Điều này làm giảm hoạt tính sinh học của
protein. Nguyên nhân của sự thoái hóa được cho là do một số gốc amino acid kỵ nước
trong phân tử SK là đích của chymotrypsin-một protease được t
ế bào tiết ra. Để giải
quyết vấn đề này, nhóm nghiên cứu đã tạo chủng đột biến pSKC-27 có glutamine tại
vị trí 29 được thay bằng lysine. Kết quả thu được SK có hoạt tính tăng 2,5 lần [64].
Nhân dòng và biểu hiện trong các tế bào chủ khác
Năm 1985, Dao và Ferretti sử dụng vector pSA3 (kháng ery, chlo, tet) để biểu hiện
SK vào S. sanguis (nhóm H) thu được protein có tính chất sinh học như SK tự nhiên.
Tuy nhiên, khối lượng phân tử của protein thu được chỉ là 42 kDa, thấp hơn so v
ới
SK tự nhiên có thể là kết quả của quá trình hậu dịch mã [65].
Năm 2004, Kumar và Singh đã sử dụng một dạng nấm men Sz. Pombe bị đột biến
mất hoạt tính protese ngoại bào, một loài có nhiều tính chất như các tế bào nhân chuẩn
bậc cao để biểu hiện SK. Họ đã sử dụng promoter điều hòa bằng thiamine và peptide
tín hiệu Plus pheromone của tế bào chủ. Kết quả thu được SK hầu như không b
ị biến
đổi và được tiết ngoại bào với hiệu suất 50-100%, đạt 2450 U/ml dịch nuôi cấy. Hiệu
suất biểu hiện đạt 24,5 mg/L và hoạt tính riêng là 1581 U/mg protein có thể so sánh

nghị Việt Tiệp Hải Phòng đã thực hiện một nhiệm vụ nghiên cứu khoa học và phát
triển công nghệ hằng năm của Sở Khoa học, mã số 240: “Nghiên cứu ứng dụng điều trị
bệnh nhồi máu cơ tim cấp bằng streptokinase tại bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng” (Sở
khoa h
ọc và Công nghệ Hải Phòng).
Lê Văn Nam và Lê Thị Cẩm Dung (2003) đã nghiên cứu cách điều trị huyết khối
trong tai biến mạch máu não. Trong nghiên cứu này, các tác giả đã đưa ra công thức và
phác đồ điều trị huyết khối. Các thuốc làm phân hủy huyết khối đã được thành lập
trong lòng mạch máu, các thuốc này đa số tác động qua cơ chế kích hoạt plasmin và
chính plasmin sẽ làm phân giải huyết khối. Các thuốc ly giải huyết kh
ối gồm
streptokinase, urokinase, scu-PA, rTPA [69].
Năm 2004, Trần Minh Tâm et al. đã thực hiện đề tài nghiên cứu “Điều trị tiêu sợi
huyết bằng streptokinase trong nhồi máu cơ tim cấp”. Tác giả đã nêu một số nhận xét
bước đầu về việc sử dụng thuốc streptokinase để điều trị tiêu sợi huyết cho 27 ca bị
nhồi máu cơ tim ở BV đa khoa tỉnh Phú Yên từ 5/2001 đến 12/2004 [70]. Tiêu sợi
huyế
t bằng streptokinase trong nghiên cứu này có tỷ lệ thành công là 63%. Theo dõi
trong 30 ngày, bệnh nhân phục hồi tốt, ít bị biến chứng, chi phí điều trị chấp nhận
được.
Các nghiên cứu khác liên quan tới các enzyme tương tự như tPA, nattokinase,
urokinase, lumbrokinase cũng rất hạn chế. Đa số là các nghiên cứu sử dụng các
17

enzyme này như thế nào trong điều trị bệnh nhồi máu như “Áp dụng thuốc rTPA trị
liệu bốn trường hợp thiếu máu não cấp tại bệnh viện Nhân dân Gia Định” của Phan
Công Tân, Nguyễn Cảnh Nam và Nguyễn Văn Mừng.
Lê Thị Thu Hiền et al. (Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam) đã thực hiện đề tài nghiên cứu cơ bản (mã số 614206, Số: 1851/QĐ
-

subtilis WB800 với một hệ promoter mạnh (chủng đã được chấp nhận đơn đăng ký
bản quyền tại Cục sở hữu trí tuệ với mã số đơn 1-2009-00749 SC).
1.4 Tình hình nghiên cứu biểu hi
ện tPA
18

1.4.1

Chất hoạt hóa plasminogen mô người
Chất hoạt hóa plasminogen mô người là dạng chủ yếu của dạng hoạt động nội sinh
của plasminogen trong máu. Nó được tạo ra dưới dạng phân tử sợi đơn ở tế bào thành
mạch trong và được giữ trong huyết tương một cách liên tục hoặc giải thoát một cách
nhanh chóng bằng phản ứng kích thích của chất cảm ứng của tế bào thành mạch máu
[76]. Dạng hoạt động plasminogen được sử dụng làm tan huyết kh
ối về phương diện
lâm sàng cho các quá trình điều trị tắc mạch phổi và chứng nhồi máu cơ tim [77].
Không giống như nhiều protease serine khác, h-tPA hoạt động dưới dạng sợi đơn, đặc
biệt khi có mặt của fibrin hoặc fibrinogen.
Ở người, gene mã hóa h-tPA là một gene đơn bản có vị trí ở 8p12 nằm trên nhiễm
sắc thể số 8 [78]. Ở chuột, gene này cũng nằm trên nhiễm sắc thể số 8 và có vị trí
24p22. C
ấu trúc và chức năng của gene mã hóa h-tPA được xác định bằng kết hợp
nhân bản in vitro của DNA hồng cầu từ những cá thể riêng biệt và phân lập được các
dòng từ thư viện gene người. Những dòng này được xác định bằng bản đồ enzyme hạn
chế, lai Southern và giải trình tự DNA [79, 80]. Gene tPA dài 36.594 bp, bao gồm
32.720 bp từ vị trí khởi đầu đến vị trí đuôi polyadenylate, có thêm 353 và 344 bp của
hai đầu 5’ và 3’, 13 intron xen giữa 14 exon, kích thước trung bình của các exon là 914
bp, trong khi của intron từ 111 đến 14.257 bp [78, 81, 82].
Các kết quả phân tích cho thấy cấu trúc protein h-tPA bao gồm 5 vùng thuộc hai
chuỗi: chuỗi nặng của h-tPA (chuỗi A, 39 kDa) được xác định ở đầu amino, còn chuỗi