BỘ CÔNG THƯƠNG
VIỆN HÓA HỌC CÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHCN
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ CHIẾT XUẤT
HYPERICIN VÀ CÁC HỢP CHẤT FLAVONOID TỪ
CÁC LOÀI BAN - HYPERICUM CỦA VIỆT NAM
LÀM THUỐC CHỐNG VIRUS CÚM TYP A CHO GIA CẦM
Đề tài nghiên cứu KHCN cấp Bộ
TS. Trần Bạch Dương
TS. Ngô Thị Hải Yến
Ths. Nguyễn Thị Hiền Anh
CN. Nguyễn Quốc Đạt
CN. Lại Thị Bảo Hiền
CN. Phạm Thị Thanh Hiếu
<Công ty cổ phần Y Dược phẩm Vimedimex>
Ths. Vương Chí Hùng
Hà Nội, 1 - 2010
MỤC LỤC Trang
LỜI MỞ ĐẦU VÀ NHIỆM VỤ CỦA ĐỀ TÀI
1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
3
1.1 Giới thiệu chung về hypericin và các dẫn xuất
3
1.1.1 Vài nét về hypericin
3
1.1.2 Tính chất hóa học và hoạt tính sinh học của hypericin 4
1.1.3 Một số ứng dụng của các sản phẩm chứa hypericin
6
1.2 Các phương pháp công nghệ sản xuất hypericin 7
1.2.1 Công nghệ tổng hợp hypericin
7
1.2.2 Công nghệ chiết xuất hypericin từ các loài Hypericum 9
1.3 Một số loài Ban - Hypericum ở Việt Nam 11
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
13
mọc hoang và cũng được trồng làm cảnh, phân bố rộng rãi ở khắp các nước ôn đới,
cận nhiệt đới và ở các vùng lãnh thổ có độ cao từ 500 - 1500 m. Ở Việt Nam, các
loài này mọc hoang dại và được trồng làm thuốc ở vùng núi và cao nguyên phía Tây
Bắc, từ lâu trong dân gian đã sử dụng nước sắc từ lá và hoa của các loài này để chữa
sốt phát ban - Tên gọi Ban rỗ, Nọ
c sởi của các loài Hypericum xuất phát chính từ
công dụng này. Nhưng có lẽ nổi tiếng nhất và được thương mại hóa là Cỏ Thánh
John - Hypericum perforatum, cao chiết (St John’s wort extract) và một số hoạt chất
chính của cây này đã được sử dụng từ thế kỷ 17 ở châu Âu và sau đó là Bắc Mỹ làm
thuốc chữa sốt, chống virus và chống suy nhược. Năm 1942 cấu trúc của hypericin,
hoạt tính quang hóa ứng dụng trong chẩn đoán X-quang và hoạt tính ứ
c chế quá
trình tổng hợp 5-hydroxytryptamin ứng dụng trong điều trị chống suy nhược đã
được công bố [1].
Hypericin thuộc lớp chất biflavon là hoạt chất chính của các loài Ban, chiếm
tới 0,05 % hàm lượng khô trong lá và hoa của các loài này. Từ các thập niên 1980
trở về trước, mặc dù các hoạt tính khác của hypericin còn chưa được đánh giá rõ
ràng trên các thử nghiệm in vitro và in vivo, nhưng các bác sỹ trong các bệnh viện ở
châu Âu và Mỹ vẫn sử dụng rộng rãi thuốc ch
ứa cao chiết Cỏ Thánh John và
hypericin trong các điều trị chống suy nhược và trong chẩn đoán X-quang, ở Đức,
một năm sử dụng tới hơn 100 triệu liều (~ 4 µg/kg thể trọng/ngày đêm). Đến năm
1992, sau các nghiên cứu của Meruelo và các cộng sự, thông qua tác dụng ức chế
enzym kinaza C, hoạt tính của hypericin làm nhiễu và ức chế quá trình tập hợp -
phân chia nhân virus mới được khẳng định. Thêm vào đó, hypericin có tác dụng
ngăn cản rấ
t mạnh quá trình thâm nhập màng tế bào của các virus, một loạt các
nghiên cứu đã được thực hiện và công bố về hoạt tính của hypericin như chống HIV-
1, virus viêm gan C và chống ung thư. US-FDA, JECFA và Hội đồng châu Âu đều
đã công bố các tiêu chuẩn về các sản phẩm thuốc và thực phẩm chức năng chứa
xuất hypericin và các hợp chất flavonoid từ các loài Ban - Hypericum của Việt Nam
làm thuốc chống virus cúm Typ A cho gia cầm” theo các nhiệm vụ cụ thể dưới đây:
1. Khảo sát nguyên liệu vùng Tây Bắc và cao nguyên miền Trung;
2. Phân lập và xác định hàm lượng hypericin và các hợ
p chất naphthodianthron
trong các loài Ban - Hypericum của Việt Nam, trên cơ sở đó xác định loài
Ban đặc hữu làm nguyên liệu chiết xuất hypericin;
3. Nghiên cứu xác định công nghệ chiết xuất cao chiết flavonoid giàu hypericin
và thành phần naphthodianthron;
4. Điều chế chế phẩm chống virus cúm Typ A cho gia cầm và thử nghiệm in
vitro, từ đó xây dựng cơ sở cho thử nghiệm in vivo.
3
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về hypericin và các dẫn xuất
1.1.1 Vài nét về hypericin
Hypericin là chất sắc tố đỏ, thuộc lớp chất naphthodianthron có ở các cây Ban
Hypericum, trong đó nổi tiếng nhất phải kể đến Cỏ Thánh John (Hypericum
perforatum L.) [1, 2, 3]. Hypericin cũng được tìm thấy trong da của một số loài côn
trùng ăn lá Ban như Crisolina hyperici và trong loài nấm Dermocyte austrovenete.
Các hợp chất naphthodianthrone khác, được tìm thấy trong tự nhiên bao gồm
fagopyrin, được phân lập từ kiều mạch, stentorin t
ừ nhiễm sắc thể của động vật
nguyên sinh có tiên mao Stentor coeruleus, và blepharismin từ Blepharisma. Các
hợp chất naphodianthron brôm hóa được tìm thấy ở các loài san hô và các sắc tố hóa
thạch ở các Crinoid kỉ Jura [7].
Hàm lượng của hypericin trong cây tập trung chủ yếu ở lá (tới 0,466 %), ở
Hypericin không tan trong nước, dầu, diclometan và các dung môi ít phân cực
khác. Hypericin tan trong các dung dịch kiềm, các bazơ hữu cơ như pyridine và các
dung môi hữu cơ phân cực như axeton, etanol, metanol, etyl axetat, etyl metyl xeton.
Khi tan trong các dung dịch này, hypericin tạo ra các dung dịch màu đỏ có bước
sóng phát xạ là 600 mm. Hypericin cũng tan trong các môi trường sinh học bằng
cách tạo phức với các phân tử sinh học như ADN, albumin huyết thanh người
(HSA), các lipoprotein màng tế bào LDL và HDL, màng tế bào và các chất của tế
bào trong khi nó không liên kết với các phân tử IgG [7, 8, 9].
Hypericin thể hiện tính axít carboxylic mạnh với hai giá trị pK
a
là 1,7 và 12
trong etanol, trong DMSO hypericin có pK
a
1,2. Hypericin tạo thành các muối mono
bazơ với các bazơ vô cơ trong khoảng pH từ 4 - 11, các muối này tan trong nước và
các dung môi phân cực, khác với hypericin tự do chỉ tan rất ít trong nước. Trong
thực vật, hypericin tồn tại ở dạng muối với kali. Các muối mono của hypericin với
natri được ứng dụng trong bệnh viện và các phép thử hoạt tính sinh học [7, 9].
Như đã đề cập, các muối của hypericin trong các dung môi hữu cơ có màu đỏ
với cường độ h
ấp thụ cao (trong EtOH, λ
1
= 545 và λ
2
= 590 nm, ε = 52.000 với λ2)
và phát quang màu đỏ. Các muối đơn trong nước ngưng tụ và tạo thành phân tử
lượng cao không phát quang. Hypericin kết tủa trong đệm muối phốtphát (PBS)
nhưng trong các dung môi hữu cơ phân cực liên kết giữa các phân tử bị phá vỡ và
tạo thành các monome. Ở nồng độ thấp hypericin liên kết với các chất hoạt động bề
mặt như nhưng ở nồng độ cao nó lại bị ngưng tụ [7].
chiết thô của các loài Hypericum spp. có ái lực yếu với các thụ thể của MAO-A và
MAO-B. Tuy nhiên hypericin tinh khiế
t lại không có tính chất này mà lại có ái lực
với các thụ thể NMDA [9]. Hypericin cũng ức chế protein kinaza C là một enzym
điều hòa quan trọng khác của các C virus (HVC).
Hoạt tính chống virus
Hypericin thể hiện khả năng chống virus rất hiệu quả. Chất này gây thụ động
hóa một loạt các virus và retrovirus có lớp vỏ lipid như HIV, viêm gan B, cúm Typ
A, Cytomegalovirus (CMV), Herpes simplex 1 và 2 (HSV-1 và HSV-2), Epstein-
Barr virus (EBV) [1 - 22]. Các virus không có vỏ lipid như adenovirus và
poliovirus không bị thụ động. Hypericin làm rối loạn nhiều giai đo
ạn khác nhau
trong quá trình nhân bản của virus như lắp ghép, mọc chồi, tạo vỏ và cả quá trình
6
tổng hợp protein tùy thuộc tính chất của màng virus. Hypericin có chức năng như là
một chất nhận điện tử từ các phản ứng vận chuyển điện tử sinh lý và đồng thời cho
đi các điện tử và sinh ra các ôxi hoạt động [7]. Khả năng liên kết với các màng tế
bào cũng đóng góp vào hoạt tính chống virus của hypericin. Bên cạnh sự thụ động
hóa các virion, tương tác của hypericin với các màng t
ế bào cũng ảnh hưởng đến các
pha khác của quá trình nhân bản và lây nhiễm của retrovirus.
Hoạt tính tiềm năng chống sự hình thành các khối u của hypericin
Vì hypericin ức chế hoạt tính enzym succioxidaza trong dịch huyền phù ti thể
nên hợp chất này có thể cản trở sự hình thành các khối u. Thêm vào đó, phản ứng
phân hủy quang hóa của hypericin cũng làm các khối u dưới da bị thoái hóa. Đây là
hoạt chất duy nhất thể hiện hoạt tính tiêu diệt các kh
ối u bề mặt phụ thuộc ánh sáng
[3, 7, 9].
Một chức năng tế bào khác bị ức chế bởi hypericin là pha tan của phản ứng
gây độc tế bào của các tế bào lympho CD8 (CTL). Các tế bào CTL là một phần quan
bào chế thành công làm thuốc chống virus H5N1. Phòng thí nghiệm công trình trọng
điểm thuốc thú y và gia cầm thuộc Viện khoa học nông nghiệp Trung Quốc đã hoàn
thành thí nghiệm lâm sàng chữa trị virus cúm gia cầm týp A H5N1 tại Phòng thí
nghiệm P3 của trường Đại học nông nghiệp Hoa Nam: 12 giờ sau khi bị cấy vi-rút
cúm týp A H5N1 bằng nhân công, 16 con gà thí nghiệm được dùng thuốc Hypericin
0,0108 g và 0,0216 g liên tục trong 3 ngày liền và đều còn sống. Sau 15 ngày thí
nghiệm, nhóm Nghiên cứu đ
ã giải phẫu các nhóm gà thí nghiệm, họ đã dùng phương
pháp tiêm chủng phôi gà để phân tích vi-rút và phương pháp RT-PCR để kiểm tra sự
phân li của vi-rút, mọi kết quả kiểm tra đều âm tính, tỷ lệ diệt vi-rút cúm týp A
H5N1 và H9N2 đạt tới 100 % và 99,9 %. Kết quả thử nghiệm cho thấy hypericin có
thể chữa khỏi 100 % gia cầm nuôi bị cấy virus H5N1 và cũng có tác dụng phòng
chống đối với virus cúm gia cầm týp A H9N2 [5, 7, 25].
Hiện tại hypericin đang được tập trung nghiên cứu dùng trong trị li
ệu quang
hóa chữa các bệnh do các loại virus có vỏ lipid gây ra như HIV, MCMV murine
CMV, SV (sindbis virus), H1N1 và biến thể H9N1, FV, HSV-1, HSV-2, EIAV
(enemia virus) và ung thư [1-25].
1.2 Các phương pháp công nghệ sản xuất hypericin
1.2.1 Công nghệ tổng hợp hypericin [26, 27]
Hypericin thương mại được sản xuất từ emodin. Emodin được chuyển hóa
thành protohypericin, chất này khi được chiếu sáng sẽ được chuyển hóa thành
hypericin. Bước chuyển hóa đầu tiên cần xử lý emodin trong dung dịch kiềm khi có
mặt hydroquinon trong một ampule hàn kín trong thời gian 3 tuần ở 120°
C. Hiệu
suất chuyển hóa protohypericin rất thấp, nhỏ hơn 29 %. Ngoài hiệu suất phản ứng
thấp, một khó khăn khác của quy trình này là không khả thi ở qui mô lớn do cần một
lượng lớn dung môi và quá trình phân tách sắc ký phức tạp.
Theo các cách khác, emodin được khử thành emodin anthron, sau đó ôxi hóa
Hòa tan emodin anthron trong hỗn hợp pyridin và piperidin, thêm vào hỗn
hợp pyridin N-oxid và FeSO
4
, đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng trong 1 giờ ở 100°C.
Hỗn hợp sản phẩm được cô kiệt trong chân không, sau đó trộn với dung dịch axít
clohyđric 3 % theo tỉ lệ 1 : 20 (v/v) để kết tủa protohypericin màu tối. Kết tủa này
được lọc và rửa với nước cho đến khi dịch rửa đạt pH trung tính. Hòa tan
9
protohypericin trong axeton và chiếu sáng bằng đèn halogen công suất 500 W qua
đêm. Dung dịch axeton sau đó được cô trong chân không và trộn với hexan theo tỉ lệ
1 : 10 (v/v). Lọc thu kết tủa hypericin, hiệu suất phản ứng là 63 %. Hypericin được
tinh chế bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp điều chế và kết tinh [26].
1.2.2 Công nghệ chiết xuất hypericin từ các loài Hypericum [28 - 32]
Như đã nêu trong mục 1.2.1, hypericin tổng hợp từ emodin anthron đã bắt đầu
được sử dụ
ng trong dược phẩm từ những năm 1990, tuy vậy giá thành của hypericin
tổng hợp vẫn còn cao so với chiết xuất từ thiên nhiên. Thêm vào đó, nồng độ của
hypericin trong thuốc uống (dạng capsual) và tiêm truyền thường rất thấp: ~ 0,3 %
theo tổng khối lượng đóng thuốc, liều dùng điều trị cũng chỉ ở mức thấp khoảng 15
µg/kg thể trọng một ngày. Do đó, các phác đồ điều trị
ở Mỹ và châu Âu vẫn sử dụng
cả cao chiết Hypericum perforatum L. (thường chứa khoảng 3 ‰ hypericin, được
đóng thuốc dạng capsual), các bác sỹ Âu - Mỹ cũng vẫn ưa thích sử dụng St. John’s
Wort Extract 0,3 % hypericin trong các đơn thuốc [8]. Chính vì vậy, ngay tại Bắc
Mỹ và châu Âu, Cỏ Thánh Giôn vẫn được phát triển mạnh làm nguyên liệu chính
khi sản xuất dược phẩm chứa 0,3 % hypericin. Bảng 1.1 dưới đây nêu tiêu chuẩn
chất lượng của bột cao chiế
t St. John’s Wort Extract theo Dược điển Mỹ USP/NF và
chiết Hypericum perforatum L Cành, lá và hoa được sấy khô, nghiền thành bột mịn
tới cỡ hạt dưới rây 0,3 mm. Bột nguyên liệu được chiết hồi lưu trên hệ thiết bị
Soxhlet công nghiệp lần lượt bằng n-hexan (quá trình loại chất béo - defatted) rồi
sau đó bằng metanol. Dịch chiết metanol được cô lo
ại kiệt dung môi dưới áp suất
thấp. Sản phẩm bột cao chiết được chế tạo bằng phương pháp đông khô hoặc sấy
phun. Với phương pháp công nghệ này, từ nguyên liệu H. perforatum L. loại tốt
(chứa từ 0,1 - 0,2 % hypericin) sẽ thu được ~ 25 % bột cao chiết có hàm lượng
hypericin cao (từ 0,3 - 0,4 %), hiệu suất thu nhận hypericin từ nguyên liệu đạt gần
toàn lượng [28, 31, 32].
Với sự phát triển của kỹ thuật hiệ
n đại, một số công nghệ chiết mới đã được
nghiên cứu để đưa vào áp dụng trong sản xuất cao chiết Hypericum. Trong đó đáng
chú ý là các công nghệ sử dụng kỹ thuật chiết siêu âm (USE) và công nghệ chiết
dưới áp suất cao ~ 100 atm (PSE) để hỗ trợ nâng cao năng suất và rút ngắn thời gian
chiết. Để lấy làm ví dụ, bảng 1.2 dưới đây nêu kết quả nghiên cứu so sánh hiệu quả
chiế
t của công nghệ truyền thống và công nghệ có hỗ trợ của phương pháp kỹ thuật
mới [28, 29].
Bảng 1.2: Hàm lượng Hypericin trong cao chiết H. perforatum L.
Hàm lượng Hypericin (%)
Kỹ thuật chiết
Lượng mẫu khô
(g)
Cao chiết
Khối lượng (g) và (%)
so với nguyên liệu
Trong cao chiết Trong Dược liệu
Chiết Soxhlet 50 g 12,4 g (24,8 %) 0,390 % 0,097 %
Chiết ngâm USE 20 g 1,95 g (8,25 %) 0,180 % 0,250 %
cao áp điều chế. Cột tách ID 400 x L 350 mm, pha tĩnh RP-C8 hoặc RP-C18, hệ
dung môi sử dụng làm pha động rửa giải sắc ký thông thường là Metanol/Etyl
axetat/đệm photphat (pH 2,5), với kỹ thuật tách này, năng su
ất đạt tới 200 g
hypericin 98 % một lượt tách [28 - 34].
1.3 Một số loài Ban - Hypericum ở Việt Nam
Trong Y học cổ truyền của Việt Nam trước đây, các thầy lang đều đã sử dụng
cỏ Ban, Ban rỗ, Nọc sởi là các loài Ban của Việt Nam để sắc nước làm thuốc uống
trị cảm cúm, sởi và sốt phát ban; tên gọi cỏ Ban cũng xuất phát từ chính công dụng
của loài cây này. Nhưng trải qua nhiều thế
hệ, với nhiều biến động xã hội lớn, ngày
nay ít người còn biết đến các bài thuốc dân gian có sử dụng cỏ Ban [35]. Theo các
tác giả Võ Văn Chi và Phạm Hoàng Hộ, ở Việt Nam còn lại một số loài Hypericum
là Ban rỗ, Ban Nepan, Ban lá dính [35, 36]. Tác giả Nguyễn Quốc Thức, Viện Dược
liệu cũng đã công bố một số thành phần flavon (quercetin, quercitrin và astilbin) từ
một số loài Ban H. japonicum và H. patulum của Việt Nam [38, 39, 40].
Trong quá trình nghiên cứu thực
địa tìm nguồn nguyên liệu cho đề tài này,
phối hợp với Trung tâm Nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt, chúng tôi
đã khảo sát và tìm lại được ở Đà Lạt hai loài Ban rỗ (Hypericum ascyron L.) và cây
Nọc sởi (chưa được khẳng định chính xác - tạm gọi là Hypericum spp.). Loài
Hypericum perforatum L., nhân dân và các nhà vườn gọi là Hoa Chuỗi ngọc, được
nhập khẩu và nhân giống ở Đà Lạt đã bị lai tạo với mục
đích trồng làm cảnh, không
còn là loài thuần chủng làm dược liệu như St. John’s Wort ở Bắc Mỹ và châu Âu.
12
Cây Ban rỗ: Cây Ban rỗ, Hồ nam liên kiều, còn có
tên thuốc là Hồng hán liên - Hypericum ascyron L., thuộc
Đại học Dược Hà Nội - Tạp chí Cây thuốc quý, 13 - 2006]; Hiện nay, chúng tôi vẫn
tiếp tục nhân giống để theo dõi và nghiên cứu, từ đó sẽ có kết quả phân loại chính
xác h
ơn. Trong khuôn khổ đề tài này mẫu cây Nọc sởi tạm được gọi là cây
Hypericum spp
12
CHƯƠNG II
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là hai loài Ban của Việt Nam được thu thập
tại Đà Lạt vào tháng 6 năm 2009. Mẫu sử dụng toàn cây, được phơi khô trong bóng
râm rồi nghiền thành bột mịn dưới rây 0,3 mm. Kết quả như sau:
+ Ban rỗ - Hypericum ascyron L.: Đã thu thập 35 kg mẫu cây tươi, sau khi xử
lý thu được 6,5 kg bột nguyên liệu;
+ Nọc sởi - Hypericum spp.: Đã thu thập 15 kg mẫu cây tươi, sau khi x
ử
lý thu được 2,5 kg bột nguyên liệu.
2.2 Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
2.2.1 Chiết xuất cao tổng số giàu các thành phần naphthodianthron
Qua tham khảo tài liệu và các thí nghiệm khảo sát sơ bộ, chúng tôi lựa chọn
phương án chiết Soxhlet truyền thống đã cải tiến theo Ghosal [32] để nghiên cứu
hoàn thiện quy trình công nghệ chiết cây Hypericum của Việt Nam. Hình 2.1 dưới
đây mô tả hệ thiết bị chiết Soxhlet.
Nguyên liệu được nạp vào túi chi
ết đặt trong bầu
chiết. Đun chiết với dung môi n-hexan trong 1 giờ, điều
Hình 2.2: Thiết bị tách sắc ký MPLC
Sản phẩm giàu thành phần hypericin được phân lập từ cao chiết Hypericum
của Việt Nam trên thiết bị tách sắc ký trung áp điều chế MPLC của Trung tâm Hóa
Dược, Viện Hóa học công nghiệp Việt Nam (Hình 2.2).
Thiết bị sử dụng một bơm định lượng trung áp MD80/100 nén dung môi đi
qua cột tách (tốc độ dòng 0 - ~ 30 ml/phút, áp lực nén 0,5 - 20 bar).
Cột tách sắc ký kích thước ID 50 x L 350 mm được nhồi pha đảo Merck
LichroPrep RP-C18 (40 - 63 µm) và nén chặt bằng thiết bị chuyên dùng.
Điều kiện phân tách sắc ký điều chế được xây dựng và nghiên cứu hoàn thiện
dựa theo điều kiện tách sắc ký St. John’s wort Extract trên cột Silica gel RP-C18 của
các tác giả Anand và cộng sự - Ấn Độ [28].
14
2.2.3 Phân tích các sản phẩm
a/ Phổ hấp thụ phân tử - Phổ tử ngoại:
Sản phẩm Hypericin của đề tài được ghi và phân tích phổ hấp thụ phân tử
(UV-Vis) trên máy UV-Vis 3101 PC Shimadzu tại Trung tâm Nghiên cứu Công
nghệ Môi trường và Phát triển bền vững, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại
học Quốc gia Hà Nội.
b/ Sắc ký lỏng cao áp kết nối khối phổ:
Các sản phẩm phân lập t
ừ Hypericum Việt Nam được phân tích định tính và
khuẩn lạc của các virus Influenza A/Port-Chalmers/73 và Herpes simplex dòng KOS
(HSV-1). Kết quả được ghi lại bằng phép đo phóng xạ của
3
H-uridin có trong ARN
của các tế bào bị gây nhiễm; đo trên phiến thử 96 giếng (8 × 12).
“Hypericin 90 %” và “Chế phẩm chống virus” được pha loãng bằng đệm
photphat Saline và đưa vào các giếng theo dãy các nồng độ giảm dần; dịch virus
15
được cho vào các giếng với số lượng và thể tích thống nhất. Phiến thử được ủ lắc
trong nhiều giờ ở 4°C sau đó cho lây nhiễm vào các đĩa tế bào Vero (nuôi cấy một
lớp) đường kính 60 mm bằng cách: Nhỏ hỗn hợp virus/mẫu thử lên các đĩa tế bào
nuôi cấy với thể tích 0,2 ml/ đĩa và ủ 1 giờ ở 37°C. Tạo lớp trên: FCS (huyết thanh
nhau thai bê) 2 % trong agar. Tiếp tục ủ 3 ngày trong tủ
nuôi cấy với khí quyển CO
2
.
Nhuộm màu và đếm số khuẩn lạc.
16
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá nguyên liệu hai loài Ban - Hypericum
Chúng tôi tiến hành chiết bột nguyên liệu khô từ hai loài Ban đã thu thập
được của đề tài theo quy trình chiết Soxhlet nêu ở mục 2.2.1. Cụ thể như sau:
+ Lượng mẫu sử dụng trong mỗi lượt chiết là 10 g;
+ Các soxhlet phân tích đánh giá có bầu chiết dung lượng 250 ml;
+ Điều kiện phân tích nhanh HPLC (Xem thêm mục 2.2.3b) được chuẩn từ cơ
sở dữ liệu của hãng Agilent Technology theo tác giả Robert Ricker (2002):
và bơm vào cột tách MPLC pha đảo. Từ điều kiện phân tách sắc ký St.John’s Wort
Extract trên silica gel pha đảo C18 của các tác giả Anand và cộng sự [28], chúng tôi
đã khảo sát và xây dựng điều kiện tách sắc ký điều chế MPLC như sau:
+ Cột tách: ID 50 x L 350 mml
+ Pha tĩnh: Merck LichroPrep RP-C18 (40 - 63 µm);
+ Pha động: Metanol/Etyl axetat/H
3
PO
4
(pH 2,5) tỷ lệ 4 : 1 : 1 - v/v;
+ Tốc độ dòng pha động: 10 ml/phút;
+ Lượng dung dịch mẫu đưa lên cột tách: 5 ml (~ 2,5 g bột cao chiết). Các phân
đoạn sắc ký được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng.
Kết quả từ 20 g bột cao chiết Hypericum, chúng tôi đã phân lập được 40 mg
chất H24. Phổ tử ngoại/khả kiến của H24 thể hiện hấp thụ phân tách tinh vi ở 190 -
210 nm; 290 -310 nm; 500 - 520 nm và 590 nm đặc trưng cho hệ thống liên hợp
anthraquinon của hypericin (Xem hình 3.1).
Hình 3.2: Sắc ký đồ HPLC mẫu H24
19
Phân tích phổ cộng hưởng từ
1
H NMR và
13
C NMR cũng cho thấy cấu trúc
hóa học của H24 hoàn toàn phù hợp với hypericin (Xem thêm Bảng 3.2, Phổ
1
H và
13
C NMR trên các trang 20 - 22) [37].
15, 16 - - - 121,5 s
26, 27 - - - 118,5 s
24, 25 - - - 119,8 s
23, 28 - - - 110,3 s
2CH3 2,71 brs (6H) 24,3 q
Dung môi DMSO-d
6
, nội chuẩn TMS.
20
Copyright: Tài liệu đại học ©