BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CÔNG TY CỔ PHẦN BIA VÀ NGK HẠ LONG

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ ĐỔI MỚI CÔNG NGHỆ
DO DOANH NGHIỆP THỰC HIỆN THEO NGHỊ ĐỊNH 119/1999/NĐ-CP BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỦNG NẤM MEN BIA MỚI VÀ CẢI TIẾN
QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ ĐỂ SẢN XUẤT MỘT SỐ SẢN PHẨM BIA
MỚI CHẤT LƯỢNG CAO
(MÃ SỐ ĐỀ TÀI: 04/2009)
Cơ quan chủ trì đề tài/dự án:
Công ty cổ phần Bia và nước giải khát Hạ Long
Chủ nhiệm đề tài/dự án:
KS. Vũ Thị Minh Châu 9188

Thực phẩm là đơn vị có đủ năng lực chuyên môn hỗ trợ cho Công ty về mặt khoa học
công nghệ để xây dựng đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men bia mới
và cải tiến quy trình công nghệ để sản xuất một số sản phẩm bia mới chất lượng cao” với
mong muốn là nhanh chóng tạo ra đượ
c các sản phẩm bia mới có chất lượng cao hơn sản
phẩm hiện có để có thể sản xuất đưa vào thị trường một sản phẩm mới đáp ứng nhu cầu
người tiêu dùng khi mà đòi hỏi về chất lượng sản phẩm ngày càng nâng cao.
Chất lượng bia chịu ảnh hưởng rất lớn của từng bước trong quy trình công nghệ
trong đó những ảnh hưởng sâu sắc nhất là ch
ủng giống nấm men dùng cho lên men bia,

ảnh hướng của thành phần dịch đường do công thức nguyên liệu và quy trình nấu quyết
định, ảnh hưởng của quá trình lên men và tàng trữ Thực tế sản xuất bia tại Việt Nam có
những đặc thù riêng do tỷ lệ nguyên liệu thay thế sử dụng thường cao, thời gian lên men
và tàng trữ ngắn Do vậy để nâng cao chất lượng bia thì chúng tôi tập trung vào việc lựa
chọn được chủng nấm men bia mới có các đặc tính công nghệ phù hợp, xác lập
được công
thức nguyên liệu và quy trình nấu phù hợp với sản phẩm bia mới, xác định được các điều
kiện phù hợp nhất cho quá trình lên men và tàng trữ, đây là yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất
đến chất lượng bia do vậy để xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất sản phẩm bia
mới thì nhất thiết phải xác lập được các thông số công nghệ này.
Để giải quyết được vấ
n đề đặt ra trong đề tài thì một số nội dung nghiên cứu chính
sau đã được thực hiện:
- Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men bia mới phù hợp cho sản xuất bia chất lượng
cao.
- Xác định công thức nguyên liệu và quy trình nấu phù hợp cho sản xuất bia chất lượng
cao.
- Xác định các điều kiện phù hợp nhất cho quá trình lên men và tàng trữ cho chất lượng
bia tốt nhất.

Mặc dù có rất nhiều khái niệ
m khác nhau về nấm men cùng tồn tại, nhưng định
nghĩa “nấm men là loại nấm đơn bào thuộc loài vi sinh vật có nhân điển hình (Eucaryote),
sinh sản bằng phương thức nảy chồi là chủ yếu” được mọi người xem là có tính thuyết
phục nhất hiện nay.
Nấm men thuộc nhóm vi sinh vật quan trọng được sử dụng rộng rãi với số lượng
lớn phục vụ các mục đích kinh tế và thươ
ng mại. Theo ước tính thì tổng sản lượng nấm
men được sản xuất hàng năm gần một triệu tấn, kể cả lượng sinh khối tạo thành trong quá
trình sản xuất bia , rượu và các sản phẩm chưng cất khác Một số nhà vi sinh vật học và
công nghệ lên men đã sử dụng thuật ngữ “nấm men” có khả năng lên men rượu thuộc chi
Sacharomyces và loài S. cerevisiae. Mặc dù các giống nấm men này có vai trò quan trọng
trong lĩnh v
ực kinh tế, hoá sinh và đã thu hút được phần lớn sự quan tâm của các nhà
nghiên cứu khoa học đi thế nào đi chăng nữa thì hiện nay đã xuất hiện nhiều giống nấm
men lai tạo có những tính chất tốt hơn cho các nghiên cứu thực nghiệm. Chính vì thế mà,
nấm men thuộc chi Sacharomyces được biết đến như một quần thể tế bào sống được con
người sử dụng và lưu truyề
n từ cổ xưa nhất. Thật vậy, quá trình phất triển của ngành sản
xuất rượu, bia, bánh mỳ đã gắn liền với hoạt động cuả nấm men này một cách ngẫu nhiên
từ thời tiền sử xa xưa. Nhiều loài Saccharomyces đã được thừa nhận là an toàn và được sử
dụng trong quá trình trao đổi chất để tạo ra hai loại sản phẩm chính là rượu etylic và khí
CO
2 Nấm men là loài vi sinh vật có khả năng sử dụng nhiều loại hydratcacbon và
đường khác nhau.Tuy thế , hiện nay trong số các loài nấm men đã phân lập được từ môi
trường tự nhiên vẫn chưa có loài nấm men nào được chứng minh là có khả năng hấp thụ
được tất cả các loại đường. Loài nấm men S.cerevisiae có thể hấp thụ một số loại đường

2
và tiếp theo hai chất này lại được bài tiết ra khỏi tế
bào nấm men, và kết quả của chuỗi phản ứng này là NADH được tạo thành trong quá
trình Glycolytic lại bị oxyhoá thành NAD
+
, và chất này sau đó lại xuất hiện trong quá
trình chuyển hoá glucoza tiếp theo. Bằng cách này mà nấm men có thể liên tục phát triển
và chuyển hoá đường và phản ứng tạo etylic có thể được viết như sau:
(dehydrozenaza) (Alcoholdehydrozenaza)
CH
3
COCOOH – > CO
2
+ CH
3
CHO > C
2
H
5
OH

Nấm men thuộc các loài khác nhau thường có hình dạng không giống nhau. Trong
cùng một loài, tế bào cũng thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện nuôi cấy và tuổi của nó.
Trong môi trường đặc hiệu thì nấm men có hình thái rất ổn định. Đa số nấm men thường
có hình ovan, hình bầu dục (Saccharomyces cerevisiae ), hình cầu ( Torulopsis utilis).

Ngoài ra nấm men còn tồn tại dưới nhiều hình dạng khác: hình tam giác, hình ống dài,
hình bình
Một số loài nấm men có tế bào nối tiếp nhau thành dạng sợi gọi là khuẩn ty
(Mycelium), hoặc khuẩn ty giả (Pseudomycelium). Ở khuẩn ty giả tế bào không nối liền

2
. Năng lượng nay sẽ chuyển thành
dạng khử (nicotinamide adenin dinucleotide phosphat, NADPH) cho quá trình tổng hợp
các chất mới cho nấm men. Các chất dinh dưỡng được đồng hoá trực tiếp để tạo thành các
hợp chất mới cho tế bào nấm men và thường tạo thành các hợp chất trung gian cho quá
trình này. Sự tạo thành và sử dụng năng lượng có liên quan tới nhau mật thiết. Hơn nữa
chúng sẽ dẫn đến sự tổng hợp và tiết vào dịch lên men m
ột số lượng lớn các sản phẩm
trao đổi chất phụ, rất nhiều trong số này tạo ra hương vị đặc trưng cho bia.
Trong quá trình sinh sản và phát triển, nấm men đòi hỏi được cung cấp nguồn dinh
dưỡng khá phong phú như nitơ, cacbon, vitamin và các chất khoáng để xây dựng tế bào.
Môi trường đầy đủ chất dinh dưỡng là một trong những yếu tố thuận lợi giúp cho nấm
men giữ được độ thuần khi
ết ổn định cao, giảm khả năng thoái hoá và đột biến, đồng thời
nâng cao chất lượng sản phẩm.
1.1.2.1.Nguồn Nitơ

Nấm men có thể sử dụng nguồn nitơ vô cơ như (NH
4
)
2
SO
4
, urê và nitơ hữu cơ.
Trong dịch malt nitơ là nguồn dinh dưỡng quan trọng không thể thiếu được trong hoạt
đống sống của tế bào nấm men. Dịch đường chứa từ 65 ÷ 100 mg nitơ trong 100 ml.
Khoảng 30% trong số đó là các nitơ axit amin, khoảng 20% là các protein phân tử cao,
40% là các polypeptid, 10% còn lại là purin và các hợp chất chứa nitơ khác. Do hoạt tính
proteaza ở nấm men rất thấp nên các axit amin trong dịch đường hoá là nguồn nitơ chủ
yếu để nấm men hấ

được lên men. Một vài chủng nấ
m men khác có khả năng lên men isomaltoza,
isomaltotrioza và panoza nhưng với tốc độ rất chậm so với các loại đường có liên kết
α−1,4glucozit.

Đường glucoza và fructoza được nấm men đồng hoá theo cùng một chu trình. Cơ
chế nấm men đồng hoá maltoza còn chưa được hiểu rõ. Một số ý kiến cho rằng maltoza đi
vào trong tế bào nhờ enzym permeasa xúc tác và sau đó bị thuỷ phân bởi enzym maltaza
trong tế bào. Quá trình lên men maltoza bị hạn chế có thể là do nồng độ enzym maltaza
trong tế bào thấp. Tuy nhiên ở một vài chủng nấm men bia người ta nhận thấy tốc độ lên
men maltoza xảy ra vẫn chậm mặc dù lượng maltaza trong tế bào dư
thừa. Vì lý do đó
người ta cho rằng quá trình đường hoá maltoza không phụ thuộc vào hàm lượng maltaza
trong tế bào.
Quá trình lên men maltotrioza được thực hiện sau maltoza. Một vài chủng nấm
men hoàn toàn không lên men maltotrioza. Loài nấm men nổi thể hiện khả năng lên men
maltotrioza yếu hơn so với nấm men chìm.
1.1.2.3. Vitamin và các chất khoáng
Các loài nấm men khác nhau có nhu cầu về vitamin hết sức khác nhau. Ngay trong
cùng một loài, nhu cầu này cũng thay đổi rất nhiều giữa giai đoạn phát triển và giai đoạn
lên men. Đa số các ch
ủng nấm men đang ở giai đoạn sinh sản đều cần inositol, canxi
pantothenat, thiamin, đặc biệt là biotin.
Trong môi trường tổng hợp, các chủng nấm men đang ở pha cân bằng không có
nhu cầu biotin, axit pantothenic hoặc inositol. Tuy nhiên đối với loài nấm men
Saccharomyces carlsbergensis, hiện tượng thiếu inositol luôn luôn ức chế cả quá trình
phát triển và quá trình lên men.
Trong môi trường thiếu axit pantothenic, một vài chủng nấm men bia có khả năng
tạo một khối lượng đáng kể H
2

nấm men cũng là chỉ số quan trọng khi xem xét chát lượng nấm men bia. Nấm men có tỷ
lệ tế bào sống cao, hàm lượng glycogen lớn và chỉ số AP cao là nấm men có tình trạ
ng
sinh lý tốt. Ngược lại, khi hàm lượng glycogen trong tế bào thấp, tỷ lệ tế bào chất cao và
chỉ số AP thấp là nấm me trong tình trạng sinh lý kém. Trong quá trình lên men, tình
trạng sinh lý của nấm men bị thay đổi qua từng thế hệ và nó phụ thuộc vào điều kiện và
quá trình xử lý nấm men và thời gian bảo quản nấm men trong quá trình sản xuất.
Trong quá trình bảo quản nấm men để sử dụng cho tái sản xuất, thì nhiệt độ và thời
gian b
ảo quản là hai yếu tố có ảnh hưởng đặc biệt quan trọng đến đặc tính sinh lý và khả
năng lên men của nấm men.
1.1.4. Các sản phẩm trao đổi chất của nấm men trong quá tình lên men bia
Các quá trình trao đổi chất là một loạt các chu trình hoá sinh. Tuy nhiên, sự tiếp
nối của các chu trình này lại rất quan trọng. Một vài các chu trình được tách từ những chu
trình khác. Một chu trình hóa sinh được biết đến là một loạt các phản ứng, mỗi phản ứng
trung gian đượ
c xúc tác bởi một enzym mà qua đó sản phẩm của phản ứng này là cơ chất
của phản ứng sau. Những chu trình này có mục đích chủ yếu là tạo ra năng lượng bởi sự
oxy hoá hoá học của các cơ chất. Quá trình oxy hoá thường được thực hiện bởi sự chuyển
một ion H
+
thành một đồng nhân tố enzym (NAD
+
nicotinamide adenin dinucleotide). Vì

vậy NAD
+
, dạng đã oxy hoá của đồng nhân tố, được tạo thành NADH, dạng khử. Các
phản ứng oxy hoá khử này được thực hiện bởi các enzym dehydrogenaza. Quá trình này
giải phóng ra năng lượng (một mẫu không có enzym được gia nhiệt mà lượng nhiệt này

Chủng loại và nồng độ nhiều sản phẩm bài tiết khác do nấm men tạo ra trong lên men
nước dịch đường hoá đứng ở vị trí đầu tiên trong việc xác định hương của bia thành phẩm.
Sự hình thành nên những sản phẩm này phụ thuộc vào sự cân bằ
ng trao đổi chất tổng thể
của dịch men, và có nhiều yếu tố làm thay đổi nó và ảnh hưởng tới hương bia. Những yếu
tố đó là: chủng nấm men, nhiệt độ lên men, loại và mức độ các chất thay thế, thiết kế

thùng lên men, pH nước dịch đường hoá, khả năng đệm của nước dịch đường hoá, tỉ trọng
nước dịch đường hoá .v.v
Một số hợp chất bay hơi cực kì quan trọng và tham gia tích cực vào sự hình thành
nên hương bia, ngược lại một số khác lại quan trọng về phương diện tạo hương vị nền.
Người ta tìm thấy trong bia các nhóm chất sau: Amin và axit hữu cơ, este, cacbonyl, hợp
chất sunphua, amin, phenol và một số hợ
p chất hỗn hợp khác.
1.1.4.1. Axit béo và axit hữu cơ
Trong bia có 110 axit, cả axit hữu cơ lẫn axit béo mạch ngắn và trung bình. Các
axit hữu cơ có tác dụng làm cho pH môi trường giảm trong lúc lên men và nhiều axit có
vai trò tích cực trong việc tạo nên hương bia. Một phần các axit này sẵn có trong malt và
các nguyên liệu thay thế malt, nhưng một phần khác thì sinh ra và tăng lên trong lên men
nhờ kết quả của quá trình trao đổi chất của nấm men.
Các axit hữu cơ được tạo nên trong quá trình trao đổi chất là: pyruvat, succinat,
xitrat và axetat. Người ta dự
đoán rằng phần lớn các axit này tăng lên là do chu trình
tricacboxylic hoạt động không hoàn chỉnh dưới điều kiện yếm khí . Người ta đã quan sát
thấy pyruvat được bài tiết vào môi trường trong pha lên men tích cực đầu tiên và đến giai
đoạn sau, khi mà nấm men đã ngừng sinh trưởng thì pyruvat lại bị tiêu hao và xuất hiện
sự tích luỹ axetat. Do đó, trong điều kiện có nhiều sản phẩm glycolytic tạo ra thì sự tiêu
hao pyruvat sẽ xác định tốc độ của con đườ
ng. Các axit béo mạch trung bình ( C
6

2
và tạo ra andehyd rồi bị khử tiếp thành rượu nhờ sự xúc tác của enzim
NAD-dehydrogenaza. Theo cách này các loại rượu sau đây cũng được hình thành:
Isobutanol từ valin
3- metyl-1-butanol từ leucin
2-metyl-1-butanol từ iso leucin
Con đường đồng hoá (là quá trình sinh hóa bao gồm việc tổng hợp các hợp chất
hữu cơ, thường là quá trình tiêu hao năng lượng ) sử dụng cùng con đường tổng hợp các
axit amin. Tương tự như ở con đường dị hoá, chất trao đổi trung gian keto-axit bị loại
CO
2
biến thành andehyd rồi bị khử tiếp thành rượu.
Hai con đường nói trên đã tạo ra các loại rượu bậc cao đặc trưng. Vì không có axit
amin tương ứng nên dị hoá được coi là con đường duy nhất có thể tạo ra n-propanol. Nói
chung con đường dị hoá cơ bản diễn ra trong giai đoạn đầu của pha sinh trưởng khi mà
hàm lượng axit amin ngoại bào còn nhiều. Trong giai đoạn sau khi mà nước mu trở nên
nghèo nitơ có thể đồng hoá được, con đường dị hoá là con đường chủ yế
u tạo ra các rượu
bậc cao.
Tổng nồng độ cồn bậc cao tạo nên trong khi lên men tỷ lệ thuận với mức độ sinh
trưởng của nấm men. Do vậy, những điều kiện kích thích sinh trưởng như tăng nồng độ
oxy sẽ làm tăng sản sinh cồn bậc cao. Tương tự như vậy, bổ sung axit amin cho nước mu
để tăng sinh trưởng nấm men làm tăng việc tích luỹ cồn bậc cao. Trong tr
ường hợp này,
bản chất các axit amin trong nước mu sẽ được phản ánh trong thành phần cồn bậc cao của
bia thành phẩm. Lên men dưới áp suất có tác dụng hạn chế sự thải CO
2
làm ức chế sự sinh
sản của nấm men sẽ làm giảm mức độ tạo thành các loại rượu bậc cao.
Mối quan hệ giữa đồng hoá axit amin và cồn bậc cao:

(CH
3
)
2
CHCH
2
CHNH
2
COOH + H
2
O (CH
3
)
2
CHCH
2
CHOHCOOH + NH
3

L- Lơxin Axit α-hydroxyisocaproic
- CO
2

(CH
3
)
2
CHCH
2
- CH

R.CO - COOH R.CHO + CO
2
R.CHO + 2H R.CH
2
OH

Họ không thấy xuất hiện sản phẩm trung gian các axit α-hydroxyl. Điều này khẳng
định việc khử amin của các axit amin không theo con đường thuỷ phân như Ehrlich đã đề
xuất.
Đã khám phá ra enzim caboxylaza và cho rằng enzim này đã xúc tác phản ứng loại
CO
2
của các axit-keto mà ngày nay chúng ta đã biết khá tường tận.
Họ cho rằng trong lúc sinh trưởng trên môi trường chứa các axit amin, nấm men
khử amin của các axit này, sử dụng NH
3
tự do cho sinh trưởng và để lại gốc cacbon, gốc
cacbon bị loại CO
2
, rồi bị khử tiếp thành cồn bậc cao.
Trước hết Thorne (1937) dùng nấm men nổi S.cerevisiae lên men trong môi trường
tổng hợp dưới điều kiện gần với điều kiện lên men bia hơn là điều kiện mà Ehrlich đã sử
dụng và dùng từng loại axit amin như tyrosin, tryptophan, phenylalanin hoặc valin làm
nguồn cung cấp nitơ cho nấm men, tách được rượu bậc cao tương ứng tyrosol, tryptophan,
β-phennylethanol, isobutanol với hiệu suất 80%, 78%, 67% và 60% so vớ
i lý thuyết.
Tác giả cũng tiến hành thí nghiệm với cặp axit amin (glutamic và arginin) và nhận
thấy sản phẩm cuối cùng không phải cồn bậc cao tương ứng theo cơ chế Ehrlich mà là
axit sucinic. Lượng axit này sinh ra từ axit glutamic xấp xỉ bằng giá trị lý thuyết. Ở đây
Thorne cho rằng hai bước phản ứng đầu tiên ( tạo ra axit α-oxo-glutamic và khử CO

.COOH
(Axit γ - aldehid-butyric) axit sucinic
Đối với arginin phản ứng diễn ra cũng không theo cơ chế Ehrlich. Trong đó xuất
hiện hai sản phẩm cuối cùng là axit succinic và γ-butylen glycol với hiệu suất chuyển hoá
tương ứng 60% và 19%. Để giải thích hiện tượng này Thorne đề xuất các con đường sau:

Sau thí nghiệm của Thorne, ít ai nghiên cứu tiếp sự trao đổi chất argine ở nấm men.
Nhưng dưới ánh sáng của một số công trình nghiên cứu gầ
n đây thì dường như axit
succinic đã có thể tăng lên do axit glutamic, một axit thường hình thành từ arginin trong
nhiều hệ thống sinh học.
Sau Erhlich rất ít tác giả tiến hành nghiên cứu cơ chế trao đổi chất arginin.Nhưng
dưới ánh sáng của một số công tình nghiên cứu mới đây, hình như axit succinic đã tăng
lên từ axit glutamic, một loại axit thường sinh ra trong trao đổi chất arginin ở nhiều hệ
thống sinh hoá. Thực ra con đường phân giải arginin không có enzim arginaza như sơ
đồ
của Thorne, mà hơn thế arginin đã bị chuyển hoá thành ornithin nhờ enzim arginin
deiminaza vốn có ở nấm men (Roche và Lacombe, 1952; Korzenovsky, 1955);

NH:C. NH
2

NH
2
Urê ornithin

NH
2
(CH
2
)
3
. CHNH
2
.COOH CH
2
OH. CH
2
. CH
2
. CH
2
OH + CH
2
= COOH
Ornithin γ - butylen glycol axit succinic
CH
2
- COOH

NH.(CH
2

Trong đó phải có mặt glucoza, có lẽ là để cung cấp năng lượng cho sự chuy
ển dịch
tyrosin vào trong tế bào;
2. Chất chiết tế bào nấm men tạo nên glutamat, p-hydroxy-phenyl-axetaldehyd
(PHPA) và CO
2
từ 2-oxoglutarat và tyrosin dưới xúc tác của pyridoxalphosphat. Điều này
chứng tỏ trong quá trình biến đổi tyrosin thành tyrosol có vấn đề chuyển amin;
3. Chất chiết tế bào nấm men khử CO
2
của p-hydroxy phenylpiruvat ;
4. Chất chiết tế bào khử NAD khi có mặt của PHPA.

Những điều trên hoàn toàn có thể giải thích được bằng các phản ứng tổng quát nhờ xúc
tác của enzim transaminaza và alcoholdehydrogenaza.

Tyrosin + axit 2-oxoglutaric +NADH
2
tysosol + L-glutamic + CO
2
+ NAD
Các phản ứng riêng rẽ có thể như sau:
C
6
H
4
OH + CH
2
- CH
2

C
6
H
4
-OH + NADH
2

CH
2
- CHO - NAD C
6
H
4
OH
CH
2
-CH
2P-hydroxy P-hydroxy - phenyl
phennyl axetaldehyd ethanol (tyrosol) Các tác giả đã tinh chế enzim tyrosin-2-oxoglutarat transferata của nấm men và chỉ
rõ enzim này cần piridoxal-phosphat như là một co-enzim với tính đặc hiệu rất cao. Họ
phát hiện thấy các enzim-transferaza của aspartat, leucin, isoleucin, valin, norvalin,
methionin, phenyl-alamin và tyrosin trong các loại nấm men mà chất chiết của nó xúc tác
việc chuyển nhóm amin từ các axit amin vừa nói sang axit 2-oxoglutaric. Các phản ứng
với axit aspastic, leucin, phenylalanin, tyrosin và valin được kích thích bởi pividoxal

2
-COOH +
CH
2
-CH
2
-COOH
L-leucin Axit 2-oxoglutaric CHNH
2
-COOH
(CH
3
)
2
- CHCH
2
-CO-COOH +
axit 2-oxoisocaproic CH
2
-CH
2
-COOH
Axit L-glutamic
Cacboxylaza
- CO
2


dùng làm nguồn
nitơ duy nhất.
Người ta cũng đã chú ý tới tầm quan trọng của việc chuyển amin trong trao đổi
chất nitơ. Họ chỉ rõ nếu nấm men bia sinh trưởng trên môi trường dùng axit L-glutamic
làm nguồn nitơ duy nhất thì tiết ra khá nhiều 2-oxoglutarat tương ứng với lượng glutanic
đã hấp thụ; Tuy vậy rất ít 2-oxoglutarat được giải phóng nếu thay L-glutamic bằng các
loại axit amin khác thậm chí không tiết chút nào nếu thay bằng NH
3
hoặc methionin; Sự
tích luỹ L-glutarnat bị ức chế mạnh mẽ khi bổ sung L-aspartat hoặc NH
3
vào môi trường.
Những thí nghiệm này chứng tỏ tầm quan trọng của hệ thống chuyển amin glutamic-2-
oxoglutarat trong trao đổi chất nấm men và 2-oxoglutarat tạo nên từ L-glutamat được
dùng nhanh chóng vào phản ứng chuyển amin với các axit amin khác hoặc vào phản ứng
amin hoá cùng NH
3
nếu NH
3
được dùng làm nguồn nitơ duy nhất.
Công trình của Ayrapa
Ayrapaa có đóng góp quan trọng vào việc nghiên cứu sự hình thành cồn, trước hết
là β-phenylethanol. Năm 1961, ông tách loại cồn này từ bia bằng methanol-chloroform,

tinh chế bằng sắc ký cột và xác định các tính chất của nó bằng sắc ký khí , quang phổ tử
ngoại và điểm nóng chảy 3,5-dinitrobenzoate. Trong bia loại rượu này có nồng độ 10-
40µg/ml và thơm tương tự hoa hồng, góp phần vào sự hình thành nên hương và mùi của
bia. Năm 1962, Ayrapaa đã trình bày một phương pháp so màu tương đối đơn giản để xác
định β-phenylethanol sau khi chiết tách từ bia, phân tách trên máy sắc ký dùng nhôm-axit
silic làm pha tĩnh và diethyl ether làm pha động.

quan hệ tới sự khử amin và ý kiến này trùng với ý kiến của nhiều tác giả đã cho rằng
rượu bậc cao được tạo thành trong suốt quá trình lên men , thậm chí ngay ở giai đoạn đầu
tiên trong lên men dịch đường trước khi các axit amin bị hấp thụ hết. Điều này kết hợp
với thực tế là rượu bậc cao vẫn được tạo ra trong môi trường lên men chỉ
có NH
3
là nguồn
nitơ duy nhất cho thấy có lẽ các thành phần của rượu bậc cao phải sinh ra do khử amin

của các axit amin mà tế bào đã tổng hợp được từ kho các axit oxo hoặc trực tiếp loại CO
2

rồi khử các axit oxo này.
Ayrapaa cho rằng sự hình thành β-phenylethanol diễn ra tương tự như sự tạo thành
rượu bậc cao cácbon mạch thẳng và có quan hệ đặc biệt với mức dinh dưỡng nitơ trong
môi trường, với các yếu tố chi phối việc tạo nên kho axit oxo và ngược lại. Mối quan hệ
mô tả ở trên phụ thuộc vào hai yếu tố :
Thứ nhất, lượng nitơ sẵn có cho quá trình chuyển amin và amin hoá. Các axit oxo
tạo nên trong hoàn c
ảnh thiếu nitơ sẽ bị biến đổi thành rượu tương ứng. Những axit oxo
này phải bắt nguồn từ sự trao đổi hydratcacbon, và chúng cũng phải là nguồn axit oxo và
cồn bậc cao khi nấm men sinh trưởng trong môi trường chỉ có nguồn nitơ duy nhất là
(NH
4
)
2
SO
4
.
Thứ hai, sự ức chế ngược của các axit amin lên các phản ứng tổng hợp nên các

C-phenylalanin . Tại mức axit amin thấp không đủ cung cấp cho sinh trưởng mạnh thì

phần lớn phenylalanin bị chuyển hoá thành phenylethanol. Tuy nhiên một số
phenylethanol cũng được hình thành theo con đường sinh tổng hợp. Tại môi trường có
nồng độ axit amin cao với lượng nitơ đồng hoá dư thừa người ta vẫn quan sát thấy có sự
hình thành cồn theo con đường sinh tổng hợp, mặc dầu nó lại bị giảm trong cùng điều
kiện và trong một thí nghiệm khác cho thấy việc tổng hợp bị phong toả hoàn toàn bởi
nồng độ
cao của phenylalanin.
Ayrapaa chỉ rõ khi các axit amin có khả năng tạo ra rượu bậc cao theo cơ chế
Ehrlich có mặt trong hỗn hợp cung cấp cho nấm men với lượng vừa phải thì lượng rượu
bậc cao tương ứng trong hỗn hợp lên men sẽ hơi lớn hơn lượng rượu bậc cao khi thiếu
các axit amin này. Do đó tác giả cho rằng sự tạo rượu bậc cao theo con đường tổng hợp
luôn là điều quan trọng nhất. Tuy nhiên theo công trình tiế
p theo với phenylalanin của tác
giả thì có thể tồn tại sự ức chế cơ chế tổng hợp bởi sự có mặt với nồng độ cao các axit
amin tương ứng trong môi trường. Do đó tác giả đề xuất một sự thay đổi, có thể coi là giả
thuyết như sau: Sự ức chế cơ chế tổng hợp có thể được bù trừ bởi sự tạo nên cùng loại cồn
con
đường Ehrlich. Giả dụ rằng hiệu số giữa tổng lượng phenylethanol sinh ra và lượng
phenylethanol tạo ra theo con đường tổng hợp là số phenylethanol tạo ra theo cơ chế
Ehrlich. Các thí nghiệm của Ayrapaa (1965) xác nhận rằng lượng phenylethanol tạo nên
theo cơ chế Ehrlich là ít nhất tại nồng độ axit amin cao nhất ( 800µgN/ml), và nhiều nhất
nằm trong khoảng nồng độ trung gian giữa 100 và 800µgN/ml. Như vậy, khi cung cấp
hỗn hợp các axit amin với lượng dư
thừa, hình như sự chuyển amin bị giảm đáng kể.
Thực vậy, phần phenylalanin được chuyển hoá thành phenylethanol tỉ lệ ngược với hàm
lượng nitơ tổng số của môi trường, nhưng ít phụ thuộc vào giá trị của phenylalanin tham
gia vào hàm lượng nitơ tổng số.
Cơ chế hình thành rượu bậc cao từ axit piruvic

CH
3
CH
3
CH
3

acetyl-CoA
C = O C(OH)COOH CH
3
C OH
Xắp xếp lại
COOH COCH
3
HC(OH)COOH

axit piruvic axit α-axetolactic axit 2,3-dihydroxy-isovaleric

- H
2
O

CH
3
CH
3
CH
3
CH
3

2- oxobutyrat thì sau một chuỗi phản ứng sẽ dẫn tới isoleucin và sau đó qua 2-oxo-3-
methylvalerat mà thành amylalcohol hoạt hóa
2-oxobutyrat 2-axetichydroxybutyrat

2,3-dihydroxy-3-methylvalerat

2,3-oxo-3-methylvalerat L-isoleucin
- CO
2

pentanol hoạt hoá Methylbutyraldehyd

2-oxobutyrat không chỉ là tiền chất của pentanol hoạt hoá và isoleucin mà còn bị
biến đổi thành n-propanol (một loại rượu vốn không có một axit amin tương ứng nào )
nhờ loại CO
2
và phản ứng khử trong theo con đường Ehrlich. Tương tự, 2-oxovalerat
thường được biến đổi thành L-valin và L-leucin như đã trình bày ở trên

CoA
2-oxoisovalerat 3-cacboxy-3-hydroxyisocaproat

2-hydroxy-3-cacboxyisocaproat - CO
2

- CO
2

- Phương pháp lên men (nổi/chìm)
- Hệ thống lên men
Theo Hough và Steven đối với bia nổi
- Giai đoạn lên men đầu tiên, rượu bậc cao tăng tỷ lệ thuận nhẹ.

- Giai đoạn tiếp theo tăng nhanh
- Lượng rượu bậc cao từ dịch đường 18
0
Bx xê dịch 51-88ppm
- Rượu bậc cao tiếp tục được tạo ra ở giai đoạn lên men thứ hai, nhưng không xuất
phát từ nấm men tự phân.
- Khi lên men nước dịch đường hoá ở 25
0
C, bia nổi cho nhiều rượu bậc cao hơn
bia chìm. Nhưng khi lên men ở 10
0
C thì hàm lượng rượu bậc cao cả hai loại bia là ngang
nhau. Trong đó bia nổi bị ức chế, bia chìm có sự kích thích tăng nhẹ.
1.1.4.3. Este
Kiểm soát sự hình thành este trong lên men
Este là những cấu tử thơm quan trọng tạo ra mùi thơm tương tự quả hoặc hoa cho
bia, vang và rượu. Khi chúng có mặt với nồng độ phù hợp là điều mong đợi nhưng nếu
với nồng độ cao thì bia không thể chấp nhận được. Điều này, xảy ra khi các
điều kiện lên
men không khống chế được. Các este quan trọng có tác dụng trong cảm quan là ethyl
axetat, isoamyl axetat, isobutylaxetat, 2-phenylethyl axetat và ethyl caproat. Trong bia có
tất cả trên 90 loại este.
Ngoài chủng loại nấm men, còn nhiều yếu tố khác ảnh hưởng tới số lượng các este
tạo thành trong khi lên men bia. Những yếu tố đó là: Nhiệt độ lên men,phương pháp lên
men, tỉ lệ giống và sự thông gió.