BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
ĐINH PHƯƠNG LIÊN
NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT CITROFLAVONOID

VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CHẾ
PHẨM CHIẾT XUẤT

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC
Hà Nội 2012
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
ĐINH PHƯƠNG LIÊN
NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT CITROFLAVONOID

VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CHẾ
PHẨM CHIẾT XUẤT

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC CỔ TRUYỀN
MÃ SỐ: 60 73 10
Nơi thực hiện đề tài:
1. Khoa Hoá Thực vật - Viện Dược liệu
2. Bộ môn Dược lý - Trường ĐH Y Hà Nội
Thời gian thực hiện: Từ 08/2010 đến 01/2012
HÀ NỘI 2012
LỜI CẢM ƠN

2
Lời đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn trân trọng và sâu sắc nhất tới TS. Trịnh

3
: Chloroform
CF : Citroflavonoid
DL : Dược liệu
ĐMC : Động mạch chủ
EtOAc : Ethyl acetat
EtOH : Ethanol
HDL : High density lipoprotein
HES : Hesperidin
HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao
LDL : Low density lipoprotein
MeOH : Methanol
NAR : Naringin
SP : Sản phẩm
TB : Trung bình
TLC : Sắc ký lớp mỏng
TT : Thứ tự
TTC : Thể trọng chuột
T
0

P
: Nhiệt độ phòng
tt/kl : Thể tích/ khối lượng
tt/tt : Thể tích/ thể tích
5
MỤC LỤC
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

2.2.3. Động vật nghiên cứu 26
2.3. Phương pháp nghiên cứu 26
2.3.1. Phương pháp xác định độ ẩm của dược liệu 26
2.3.2. Phương pháp định tính citroflavonoid trong dược liệu và trong sản
phẩm chiết xuất bằng sắc ký lớp mỏng 27
2.3.3. Phương pháp định lượng citroflavonoid bằng quang phổ tử ngoại. .27
2.3.4. Phương pháp định lượng citroflavonoid trong dược liệu và sản phẩm
chiết xuất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao 30
Định lượng hàm lượng citroflavonoid trong dược liệu và trong sản phẩm
chiết xuất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao được tiến hành theo
phương pháp từ nghiên cứu “ Xây dựng phương pháp định tính, định
lượng đồng thời naringin và hesperidin trong vỏ quả các loài thuộc
chi Citrus bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao“ (Pphụ lục 8) 30
2.3.5. Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất
citroflavonoid 32
2.3.6. Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn của nguyên liệu và sản phẩm chiết
xuất citroflavonoid 33
2.3.7. Phương pháp thử độc tính cấp 34
2.3.8. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm chiết xuất
citroflavonoid lên chỉ số lipid máu 35
7
2.4. Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu 36
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 37
3.1. Xây dựng quy trình chiết xuất Citroflavonoid 37
3.1.1. Khảo sát hàm lượng citroflavonoid trong vỏ quả một số loài thuộc chi
Citrus 37
3.1.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất citroflavonoid 38
3.1.2.1. Khảo sát dung môi 38
3.1.2.2. Khảo sát nhiệt độ chiết xuất citroflavonoid 41
3.1.2.3. Khảo sát thời gian chiết xuất 42

Đề xuất 73
22
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
9
ĐẶT VẤN ĐỀ
Các cây thuộc chi Citrus được trồng rất rộng rãi ở nước ta với mục đích
chính là lấy quả và làm cảnh. Hiện nay ở Việt nam cũng sử dụng quả hoặc vỏ
quả của một số loài để làm thuốc theo Y học cổ truyền, y học dân gian [12],
[14] tuy nhiên số lượng sử dụng là không nhiều do nhu cầu thấp.
Qua các công trình nghiên cứu của các tác giả trên thế giới và ở Việt
Nam thấy rằng flavonoid chiết xuất từ vỏ quả của các loài thuộc chi Citrus có
nhiều tác dụng sinh học tốt [6],[13], [2637]. Các tác dụng đáng chú ý là tăng
trương lực tĩnh mạch, bảo vệ thành mạch, chống vữa xơ động mạch, chống
ung thư [7]. Các công ty dược phẩm có uy tín trên thế giới đã nghiên cứu và bào
chế thành công sản phẩm thuốc dùng để chữa các bệnh về rối loạn mạch máu từ
nguồn dược liệu này.
Có thể dễ dàng nhận thấy ở các gia đình, hàng quán, khách sạn, các
công ty chế biến thực phẩm một điều là sau khi sử dụng quả của các loài
thuộc chi Citrus, vỏ quả giữa (còn gọi là cùi) được đem vứt đi mà không được
sử dụng. Rõ ràng chúng ta đang lãng phí một nguồn nguyên liệu sản xuất
thuốc rất dồi dào, sẵn có quanh năm, là phế phẩm của một ngành khác (thực
phẩm). Tuy có một số nghiên cứu ở Việt Nam về việc ứng dụng các flavonoid
để làm thuốc chữa bệnh, nhưng chưa có nghiên cứu cho quy mô công nghiệp và
do đó chưa thể triển khai được trong công nghiệp. Trong khi đó, ngành công
nghiệp dược phẩm của nước Pháp đã tận dụng vỏ quả (sau khi sử dụng cho công
nghiệp thực phẩm) để chiết xuất citroflavonoid, sản xuất các thuốc điều trị bệnh
rối loạn thành mạch rất hiệu quả, đem nhiều lợi nhuận về kinh tế.
Công nghệ hóa dược và sản xuất dược phẩm ở nước ta đã có những phát
triển vượt bậc trong những năm qua. Chúng ta có thể triển khai những quy

thủ); gia vị (chanh, quất) [3], [12].
Vị trí chi Citrus trong hệ thống phân loại của Takhtajan 1987 [3] được
trình bày ở hình 1.1
Hình 1.1.Vị trí chi Citrus trong hệ thống phân loại của Takhtajan 1987
3
Phân lớp Hoa hồng
(Rosidae)
Liên bộ Cam
(Rutanae)
Chi Citrus
Họ Cam
(Rutaceae)
Bộ Cam
(Rutales)
Lớp Ngọc lan
(Magnoliopsida)
Ngành Ngọc lan
(Magnoliophyta)
4
Hình 1.1.Vị trí chi Citrus trong hệ thống phân loại của Takhtajan 1987
1.1.2. Đặc điểm thực vật chi Citrus
Các cây thuộc chi Citrus thường là cây gỗ nhỏ hoặc cây bụi [12]. Các
cây này thường có gai ở nách lá; các cành già thường không có gai. Tất cả các
bộ phận thường có mùi thơm khi vò hoặc nghiền nát. Lá đơn mọc cách, cuống
lá thường có cánh, phiến lá nguyên hoặc có răng cưa với một ít gân phụ, có
nhiều túi tiết tinh dầu kiểu dung sinh. Hoa mọc đơn hoặc mọc thành chùm ở
nách lá. Quả mọng loại cam. Vỏ quả ngoài chứa nhiều túi tiết tinh dầu,
thường có màu vàng hoặc cam khi chín; vỏ quả giữa trắng, xốp; vỏ quả trong
mỏng và dai, làm thành màng bao bọc các múi (mỗi múi tương ứng với một lá noãn);
phần ăn được là những lông đơn bào mọng nước được mọc ra từ vỏ quả trong,

Việt Nam đạt 8000- 10000kg/ha [1],[7] .
- Chanh:
Tên khoa học : Citrus limonia Osbeck (chanh kiên) được trồng nhiều ở
miền Bắc và C. aurantifolia Swingle (chanh ta) được trồng nhiều ở miền Nam.
Cây nhỡ, lá mọc so le, mép có khía răng cưa. Hoa trắng mọc riêng lẻ
hoặc thành chùm 2-3 hoa. Quả hình cầu, vỏ quả mỏng, khi chín có màu vàng
nhạt, vị chua [7]. Mùa hoa: tháng 3-5, mùa quả: tháng 6-9, nhưng còn một vụ
chanh chiêm vào các tháng 1-2 [14].
Hiện nay chanh được trồng ở nhiều nơi trên thế giới thuộc khu vực
nhiệt đới và cận nhiệt đới. Theo thống kê của tổ chức FAO, năm 1988, sản
lượng chanh trên toàn thế giới khoảng 6 triệu tấn/năm, trong đó Việt Nam ước
tính vài chục ngàn tấn [12].
- Quýt:
Tên khoa học : Citrus reticulataBlanco
Tên đồng danh : C. nobilis Lour. , C. chrysocarpa Lush.
Citrus reticulata Blanco, có nguồn gốc Philipin, cây có gai nhỏ, quả
mọng hình cầu, đáy lõm, vỏ quả xốp, khi chín có màu vàng cam hoặc đỏ tươi,
loài này phát triển tốt ở vùng nhiệt đới.
Sản lượng quýt hàng năm trên thế giới đạt khoảng 8 triệu tấn, đứng đầu
là Nhật Bản (48%). Ở Việt Nam có nhiều giống quýt nổi tiếng như : quýt Bắc Sơn
(Lạng Sơn), quýt Hương Cần (Huế), quýt Xiêm… [7].
6
- Quất:
Tên khoa học : Citrus japonica Thunb.
Tên đồng danh : Fortunella spp.
Cây có nguồn gốc từ Trung Quốc, ngày nay được trồng nhiều tại các
nước nhiệt đới và bán nhiệt đới. Ở Việt Nam, quất được trồng rất nhiều ở Hà
Nội và các tỉnh lân cận với mục đích làm cây cảnh, trang trí cho ngày Tết là
chính. Vùng trồng quất nổi tiếng là Quảng Bá, Quảng An, Tứ Liên. Ngày nay
thì các tỉnh lân cận Hà Nội cũng trồng nhiều, và quất đã được di thực vào

geranial, limonene (chiếm hơn 80%), α-pinen, β-pinen, sabinen, terpinen,
terpinolen… Vỏ quả của các loài Citrus thu hái tại nhiều nơi ở Việt Nam cũng
được xác định có chứa hàm lượng lớn về tinh dầu [30],[41]. Tinh dầu Citrus
có tác dụng chống oxy hóa, chống ung thư, kháng khuẩn, kháng virus, kháng
nấm [17]. Tinh dầu được sử dụng trong công nghiệp mỹ phẩm và làm gia vị
[20].
1.2.3. Limonoid
Là thành phần đặc trưng và có hàm lượng lớn của các cây thuộc họ
Rutaceae nói chung, chi Citrus nói riêng. Về cấu trúc hóa học, limonoid là các
dẫn chất của triterpen có chứa nhiều oxy trong phân tử và có một vòng furan
ở vị trí C-17, tồn tại cảở dạng aglycon tự do và dạng glycosid. Một số
limonoid có vị đắng và đây chính là nguyên nhân gây ra vị đắng trong vỏ quả
và dịch quả của các loài Citrus. Các limonoid có tác dụng chống ung thư, giảm
cholesterol trong máu, có tác dụng diệt côn trùng và ký sinh trùng sốt rét, kháng
virus, kháng khuẩn, kháng nấm, và tác dụng chống HIV [2233], [2440].
1.2.4. Coumarin
Các coumarin có nhiều trong các cây thuộc họ Rutaceae [25],[28],[44],
[46]. Hàm lượng coumarin trong vỏ quả thấp hơn trong rễ, thân, cành [25]. Vì
coumarin là các chất ít phân cực nên có thể tìm thấy trong tinh dầu của vỏ
8
quả, nhưng cũng có thể tìm thấy trong vỏ quả trong. Một số coumarin hay gặp
trong các loài Citrus là bergamottin, bergapten, imperatorin, isoimperatorin,
osthol, psoralen Coumarin có các tác dụng chống ung thư [25],[28] , chống
oxy hóa, kháng virus, kháng khuẩn, kháng nấm [20]20].
1.2.5. Alcaloid
Thành phần alcaloid Ccó nhiều trong họ Rutaceae [34],[38],[46] [25].
Thông thường các loài Citrus có chứa alcaloid có cấu trúc protoalcaloid là
dẫn xuất của tyramin. Các alcaloid này có tác dụng diệt côn trùng.
1.2.6. Flavonoid
Flavonoid là thành phần chính và quan trọng trong các loài Citrus, phân

O
O
2
4
5
7
1'
3'
4'
Khung flavanon
Khung flavon
Khung flavonol
OH
O
O
+
2
4
5
7
1'
3'
4'
Khung anthocyanin
OH
OH
HO
Hình 1.2. Cấu trúc cơ bản của các flavonoid trong vỏ quả của các loài
thuộc chi Citrus.
Thành phần flavonoid chính có trong tất cả vỏ quả của các loài Citrus là

O
O
HO
OH
OH
OH
2
4
5
7
1'
3'
4'
O
O
HO
OH
OH
2
4
5
7
1'
2'
4'
O
O
HO
OH
OCH

OCH
3
OH
2
4
5
7
1'
3'
4'
O
HO
HO
OH
O
O
HO
H
3
C
Hesperidin
O
O
O
OH
OH
2
4
5
7

O
O
O
OH
OCH
3
OH
2
4
5
7
1'
3'
4'
O
HO
HO
O
Neohesperidin
OH
O
OH
HO
HO
H
3
C
O
OH
HO

C
Eriocitrin
O
O
O
OH
OCH
3
OH
2
4
5
7
1'
3'
4'
O
HO
HO
O
Neoeriocitrin
OH
O
OH
HO
HO
H
3
C
HO

3
2
4
5
7
1'
3'
4'
O
HO
HO
O
Poncirin
OH
O
OH
HO
HO
H
3
C
HO
OH
Hình 1.3. Flavonoid nhóm flavan trong quả các loài Citrus và các glycosid
của chúng
11
O
O
O
OH

2
4
5
7
1'
3'
4'
O
HO
HO
O
OH
Neodiosmin
O
OH
HO
HO
H
3
C
O
O
HO
OH
OH
2
4
5
7
1'

Diosmetin
OH
O
O
H
3
CO
OCH
3
OCH
3
2
4
5
7
1'
3'
4'
Nobiletin
O
O
H
3
CO
OCH
3
OCH
3
2
4

3
CO
OCH
3
O
O
HO
OH
OH
2
4
5
7
1'
3'
4'
Quercetin
OH
O
O
HO
OH
OH
2
4
5
7
1'
3'
4'

một nhóm OH ở vị trí số 3 và số 5 (Hình 1.5) sẽ cho tác dụng chống oxy hóa
mạnh [37],[39]. Các nhóm này có tác dụng loại bỏ các gốc tự do trong của cơ
thể, như các gốc tự do superoxid (O
2
-●
), hydroxy (OH
●
), lipid peroxyl (LOO
●
),
lipid alkoxyl (LO
●
), oxyd nitric (NO
●
). Các gốc tự do là nguyên nhân gây ra
quá trình oxy hóa trong cơ thể, chúng có thể gây ra sự oxy hóa lipid, protein
và kể cả DNA [27]. Khi các quá trình oxy hóa xảy ra nhiều trong cơ thể,
chúng sẽ gây ra sự phá hủy các tế bào và do đó dẫn đến bệnh tật [26].
Hình 1.5. Các nhóm chức đem lại tác dụng chống oxy hóa mạnh cho
flavonoid
Vì vậy, các flavonoid có tác dụng chống oxy hóa mạnh [18],[45]. Thông
thường thì các aglycon flavonoid có tác dụng mạnh hơn các glycosid của chúng
[39]. Chúng giúp cơ thể chống lại sự oxy hóa lipid, protein và DNA gây ra bởi các
gốc tự do [19].
14
O
O
OH
OH
OH

ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư và ức chế sự phát triển của khối u,
vì vậy nó có tác dụng phòng ngừa và làm chậm quá trình sinh ung thư [19].
1.4. Các nghiên cứu trong nước về chi Citrus
Các nghiên cứu trong nước về chi Citrus chủ yếu là về tinh dầu, dinh
dưỡng và trồng trọt để thu hái quả và cất tinh dầu. Các nghiên cứu về tinh dầu
cho thấy các loài Citrus ở Việt Nam có chứa hàm lượng lớn các chất tinh dầu
[3]. Trong phần này chúng tôi đi sâu đề cập tới các nghiên cứu về các
citroflavonoid.
Nghiên cứu về thành phần flavonoid của các loài Citrus ở Việt Nam có
không nhiều.
Năm 1990, tác giả Nguyễn Thị Chung thực hiện luận án “Nghiên cứu
chiết xuất và dạng bào chế của các flavonoid từ vỏ quả một số loài thuộc chi
Citrus Việt Nam”[6]. Trong luận án này, tác giả đã công bố một số kết quả:
(1) Khảo sát nguồn nguyên liệu để chiết xuất citroflavonoid trong vỏ quả một
số loài thuộc chi Citrus; (2) Áp dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm để
xác định các điều kiện tối ưu khi chiết xuất hesperidin và naringin ; (3) Tiến
hành phân lập hai citroflavonoid là hesperidin và naringin từ vỏ quả một số
loài thuộc chi Citrus ; (4) Xây dựng công thức bào chế viên nén chứa
citroflavonoidd [6].
Tác giả Nguyễn Văn Chính công bố quy trình tách chiết hesperidin từ
vỏ cam phế thải đạt hiệu suất 1,83% [5].
Gần đây, tác giả Võ Văn Lẹo đã thực hiện luận án nghiên cứu về các loài
Citrus thu hái ở miền Nam [13]. Đây là nghiên cứu sâu nhất và toàn diện nhất
về thành phần citroflavonoid. Trong luận án tiến sĩ của mình, tác giả công bố
một số kết quả chính thu được sau đây: (1) Phân lập được từ vỏ bưởi hai
flavonoid glycosid hesperidin và naringin. Các aglycon của chúng là
hesperidin và naringin thu được bằng cách thủy phân hai glycosid tương ứng.
16