TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC
LỚP CSK31
BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN ĐỀ
SẢN XUẤT SINH KHỐI
LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS
ĐỂ BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN CHO
TÔM VÀ XỬ LÝ MÔI TRƯỜNG AO
NUÔI
Nhóm thực hiện: Nhóm 3
1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC
LỚP CSK31
SẢN XUẤT SINH KHỐI
LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS ĐỂ
BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN CHO TÔM
VÀ XỬ LÝ MÔI TRƯỜNG AO NUÔI
GVHD: CN. NGUYỄN VĂN GIANG
SVTH: PHẠM NGỌC CHÚC
LÊ ĐOÀN VY HẠ
NGUYỄN THỊ KHÁNH LY
NGUYỄN THỊ THỦY NGÂN
ĐẶNG VĂN NGHỊ
NGUYỄN XUÂN TOÀN
ĐÀM HUYỀN TRANG
TRẦN THỊ QUỲNH TRANG
2
TRẦN THỊ THÙY TRANG
3
LỜI CẢM ƠN

1.2.3 Đặc điểm sinh lý- sinh hóa…………………………………….8
1.2.3.1 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic……………………8
1.2.3.2 Quá trình trao đổi chất ……………………………………10
1.2.4 Những ứng dụng của vi khuẩn lactic…………………………10
1.2.4.1 Những ứng dụng trong công nghệ thực phẩm………………10
1.2.4.2 Chế biến các sản phẩm sữa…………………………………10
1.2.4.3 Sản xuất bánh mỳ đen………………………………………11
1.2.4.4 Ủ thức ăn gia súc…………………………………………….11
1.2.4.5 Muối chua rau quả…………………………………………11
1.2.4.6 Sản xuất acid lactic và muối lactat………………………….11
1.2.4.7 Sản xuất men tiêu hóa cho người và động vật………………11
1.2.4.8 Một số ứng dụng khác của vi khuẩn lactic…………………12
1.3 Lactobacillus acidophilus 12
1.3.1 Phân loại……………………………………………………….12
1.3.2 Đặc điểm hình thái……………………………………………13
6
1.3.3 Đặc tính nuôi cấy……………………………………………13
1.3.4 Tác dụng của Lactobacillus acidophilus ……………………13
Phần II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Thời gian, địa điểm nghiên cứu………………………………14
2.2. Đối tượng, dụng cụ, thiết bị……………………………………14
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu………………………………………14
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị……………………………………………14
2.2.3. Môi trường nuôi cấy ………………………………………….14
2.2.4. Khử trùng thiết bị, dụng cụ…………………………………15
2.3. Phương pháp nghiên cứu……………………………………….15
2.3.1. Phương pháp phục hồi chủng……………………………….15
2.3.2. Phương pháp phân tách khuẩn lạc………………………… 15
2.3.3. Phương pháp nhân giống……………………………………15
2.3.4. Phương pháp lên men…………………………………………15

trường nước ao nuôi, dịch bệnh và hệ thống sinh thái bị phá hủy. Vấn đề ô
nhiễm nước ao nuôi là do lượng thức ăn thừa tôm không sử dụng được lớn,
tôm bài tiết, lột xác nhiều và xác của những động vật thủy sinh phù du trong
môi trường nhiều. Khi ao nuôi bị ô nhiễm là cơ hội cho những nhóm vi sinh
vật có hại phát triển mạnh mẽ, không kiểm soát được và hậu quả là vật nuôi
bị bệnh. Vì vậy, việc xử lý môi trường trong quá trình nuôi nhằm cải thiện
môi trường nước và phòng bệnh là cấp thiết.
Trước đây, người nuôi thường sử dụng hóa chất, kháng sinh để xử lý
môi trường ao nuôi và phòng bệnh. Nhưng dùng nhiều hóa chất và kháng
sinh gây ảnh hưởng lớn đến môi trường và con người. Ngoài ra, việc lạm
dụng thuốc kháng sinh còn gây ra vấn đề về dư lượng kháng sinh trong vật
nuôi vi phạm vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm. Do đó, cần chọn một giải
pháp thích hợp để giải quyết vấn đề này là rất quan trọng. Phương pháp sử
dụng chế phẩm sinh học có chứa những vi sinh vật mang những đặc tính có
lợi – Probiotic : phân hủy các chất hữu cơ thừa, đối kháng với vi khuẩn gây
bệnh…đã được áp dụng. Một trong những loài vi khuẩn có những đặc tính
này là vi khuẩn lactic.
Vi khuẩn lactic mang nhiều những đặc tính có lợi cho người và vật nuôi:
hỗ trợ tiêu hoá, tăng cường khả năng miễn dịch, kích thích sự phát triển của
vật nuôi…Ngoài ra chúng còn giúp điều trị các bệnh về đường tiêu hoá như:
tiêu chảy, táo bón, loạn khuẩn…Bên cạnh đó, vi khuẩn lactic còn có khả
8
năng kìm hãm, ức chế các vi sinh vật gây bệnh: Candida albicans, Bacillus
cereus, Staphylococcus aureus…do chúng sinh các chất: bacteriocin, acid
lactic….
Với nhiều những đặc tính có lợi như vậy chúng tôi đưa vi khuẩn lactic
vào ứng dụng làm chế phẩm cho NTTS. Trong sản xuất công nghiệp với
mục tiêu thu sinh khối lớn chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Sản xuất sinh
khối Lactobacillus acidophilus để bổ sung vào thức ăn cho tôm và xử lý
môi trường ao nuôi”

thủy sản
Sau khi được sử dụng trên diện tích NTTS, probiotic sẽ phát huy công
dụng theo những quá trình sau: khống chế sinh học (những nhóm vi sinh vật
có ích tác động đối kháng lên nhóm vi sinh vật gây bệnh) và xử lý sinh học
(phân hủy các chất hữu cơ trong nước bằng sản phẩm tổng hợp của chúng)
Probitic được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi cho động vật trên cạn từ
những năm 1970, cho thấy hiệu quả rõ rệt trong tăng trưởng và hệ miễn dịch
của vật nuôi
Tuy nhiên, việc sử dụng probitic trong NTTS chỉ mới được đề cập đến
trong những năm gần đây
Yasudo và Taga (1980) đã chỉ ra rằng một loài vài vi khuẩn có ích
không chỉ là thức ăn mà còn là yếu tố kiểm soát các dịch bệnh trên cá và
11
hoạt động tích cực tái tạo các chất dinh dưỡng trong môi trường. Những
nghiên cứu sau đó tiếp tục gia tăng
Kennedy (1998) sử dụng probiotic đối với ấu trùng cá đã nhận thấy có
sự gia tăng sức sống, tính đồng nhất và tỉ lệ tăng trưởng
Trong 1 báo cáo của Rengpipat (2003) ghi nhận sự tăng trưởng và khả
năng chống lại Vibrio của tôm sú đen khi sử dụng probiotic trong quá trình
nuôi
Trong báo cáo CHIẾN LƯỢC QUẢN LÝ VÀ DINH DƯỠNG LÀM
TĂNG SỨC KHỎE CON TÔM – công ty TNHH công nghệ sinh học ATC
đề cập những cơ chế ghi nhận hiệu quả của chế phẩn sinh học đối với sức
khỏe tôm bao gồm: (1) loại bỏ vi khuẩn mang bệnh trong ruột non; (2) thành
phần màng tế bào của các vi khuẩn trong chế phẩm sinh học kích thích hệ
miễn dịch bẩm sinh của tôm; (3) các enzym và các thành phần kháng khuẩn
tạo ra từ chế phẩm sinh học sẽ triệt hại các vi khuẩn truyền bệnh.
Douilett (1998) sử dụng probiotic trong môi trường nước nuôi cá và
động vật giáp xác đã nhận xét probiotic làm sạch môi trường nước bằng cách
giảm nồng độ các chất hữu cơ (organic materials – OM) và amoniac.

gây hại đến sức khỏe người tiêu dùng. Probiotic là các sinh vật có lợi cho cả
động vật và con người, do đó sản phẩm sau khi NTTS có sử dụng probiotic
không có hại cho người
1.2 Vi khuẩn Lactic
Một trong những nhóm vi sinh vật được sử dụng phổ biến trong
probiotic là vi khuẩn Lactic
Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacillaceae. Các chủng vi khuẩn thuộc
nhóm này có đặc điểm sinh thái khác nhau nhưng đặc tính sinh lý tương đối
giống nhau. Tất cả đều có đặc điểm có đặc điểm chung là vi khuẩn Gram
dương, không tạo bào tử, không di động, kỵ khí tùy nghi hay vi hiếu khí và
không chứa các enzyme hô hấp như citochrom và catalase
13
Chúng thu nhận năng lượng nhờ quá trình phân giải hydrat cacbon và
sinh ra axit lactic
Sinh sản bằng hình thức phân đôi tế bào.
1.2.1 Phân loại vi khuẩn Lactic
Nhóm vi khuẩn lactic bao gồm nhiều giống khác nhau: Streptococcus,
Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc. Ngày nay người ta bổ sung vào
nhóm vi khuẩn lactic những chủng vi khuẩn thuộc giống Bifidobacterium.
Trong giống Lactobacillus đã phân lập được các loài sau:
Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus brevis
Lactobacillus casei
Lactobacillus catenaforme
Lactobacillus crispatus
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus gassert
Lactobacillus iners
Lactobacillus jensenll
Lactobacillus jeichmannll

số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ…
1. nhu cầu dinh dưỡng cacbon:
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ các
monosaccarit ( glucoza, fructoza, manoza ), các disaccarit ( saccaroza,
lactoza, maltoza ) cho đến các polysaccarit ( tinh bột, dextrin )
Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu
trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ
15
2. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ
Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất
chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử
dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường.
Các nguồn ni tơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm
men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,…Hiện nay cao nấm men
là nguồn ni tơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất. tuy nhiên ở quy
mô công nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém.
3. Nhu cầu về Vitamin:
Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của
tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi
khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung
vào môi trường các loại vitamin. Các chất chứa vitamin thường sử dụng như
nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men…
4. Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác:
Ngoài các axit amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất
hữu
cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các axit hữu cơ
Một số axit hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của
vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các
muối citrat, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy,
phân lập và bảo quả các chủng vi khuẩn lactic.

Trong công nghệ thực phẩm, việc sử dụng quá trình lên men lactic
không chỉ nhằm mục đích bảo quản mà còn nhằm đưa ra thị trường các loại
thực phẩm có tính chất và hương vị mong muốn. Các ứng dụng chủ yếu
gồm:
1.2.4.2 Chế biến các sản phẩm sữa
17
Ngoài khả năng lên men làm cho sữa không bị hư hỏng, các chủng vi
khuẩn lactic còn có nhiều khả năng đặc biệt khác. Nhờ đó mà người ta đã
sản xuất hàng loạt các sản phẩm từ nguồn nguyên liệu sữa ban đầu. Như lợi
dụng khả năng làm đông tụ sữa của vi khuẩn Streptococcus lactic để sản
xuất sữa chua hay khả năng tạo ra các mùi vị, tạo các chất thơm của
chủngLeuconostoc để sản xuất bơ, phomat…
1.2.4.3 Sản xuất bánh mỳ đen
Đây là loại bánh mỳ có chất lượng cao bên cạnh quá trình lên men bởi
nấm men tạo rượu etylic và CO2. Người ta còn sử dụng quá trình lên men
của vi khuẩn lactic để tạo vị chua và hương thơm đặc trưng cho sản phẩm.
1.2.4.4 Ủ thức ăn gia súc
Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến trong các trang trại chăn
nuôi. Thức ăn khi ủ không những giảm được sự tổn thất giá trị dinh dưỡng
mà còn bổ sung nhiều loại vitamin do vi sinmh vật tổng hợp. Phương pháp
này dựa vào sự chuyển hóa đường có sẵn trong nguyên liệu của vi khuẩn
lactic.
Để khối ủ chua thức ăn gia súc có chất lượng tốt, người ta thường sử
dụng vi khuẩn lactic thuần khiết như:Lactobacillus plantarm,
Thermobacterium cerealle.
1.2.4.5 Muối chua rau quả
Cũng như ủ chua thức ăn gia súc, vấn đề muối chua rau quả cũng nhằm
thực hiện hai mục đích:
- Bảo quản nguyên liệu
- Làm tăng giá trị dinh dưỡng và giá trị cảm quan

Có rất nhiều chủng Lactobacillus acidophilus đã được phân lập,
chúng giống nhau về đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa nhưng khác nhau
về một hay một số hoạt tính
Một số chủng Lactobacillus acidophilus
Chủng Người phát hiện
19
Lactobacillus acidophilus DDS-1 Nebraska Cultures
Lactobacillus acidophilus LA-5 Chr. Hansen
Lactobacillus acidophilus NCFM Danisco
1.3.2 Đặc điểm hình thái
Lactobacillus acidophilus là trực khuẩn gram dương, không sinh bào tử,
kỵ khí tùy nghi hay vi hiếu khí
Thường tồn tại ở trạng thái đơn bào hoặc kết thành chuỗi, kích thước nhỏ
từ 0,3 – 1 µm
Khuẩn lạc dạng R, màu trắng sữa, hình tròn có răng cưa
Tồn tại ở pH từ 5 – 8, tăng trưởng tốt tại các giá trị pH thấp, nhiệt độ tăng
trưởng tối thích 30 – 37
o
C
Thời gian giữa 2 lần phân chia tế bào từ 25 phút đến vài trăm phút
Thuộc nhóm lên men lactic đồng hình, lên men mạnh đường lactose tạo
sản phẩm chính là acid lactic
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển lactobacillus acidophilus còn
sản sinh ra các chất diệt khuẩn như lactocidin, bacterioxin
1.3.3 Đặc tính nuôi cấy
Thích hợp với môi trường giàu dinh dưỡng như môi trường MRS (De Man,
Rogosa, Sharpe), pH 7,5, nhiệt độ 37
o
C
Sau 4 – 6 giờ nuôi cấy, L acidophilus làm đục môi trường, tạo váng trên bề

cân bằng hệ vi sinh trong môi trường nước
Do vậy, L.acidophilus khi được bổ sung vào môi trường nước NTTS sẽ làm
giảm lượng bùn đáy, tồn đọng các chất thải hữu cơ, tăng lượng oxy hòa tan,
giảm COD, BOD , giảm lượng vi sinh vật gây bệnh, làm trong màu nước,
giảm mùi hôi, giảm chu kỳ thay nước của ao nuôi
21
Phần II
Đối tượng và phương pháp
nghiên cứu
22
2.1. Thời gian, địa điểm nghiên cứu:
- Thời gian nghiên cứu: từ ngày 16/07/2010 đến ngày 26/07/2010
- Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm A11.301, khoa sinh học, trường
Đại học Đà Lạt.
2.2. Đối tượng, dụng cụ, thiết bị:
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu: chủng Lactobacillus acidophilus
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị
- Bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, roux.
- Các micropipet, đèn cồn, banh khui, bơm kim tiêm tủ ấm, tủ sấy.
- Cân kỹ thuật, máy li tâm, máy đo pH, box cấy.
2.2.3. Môi trường nuôi cấy:
2.2.3.1. Môi trường MRS đặc:
- Proteose peptone 61 g
- Meat extract 30.5 g
- Yeast extract 10.5 g
- Glucose 91.5 g
- Sodium acetate 15.25 g
- Magne sulphate 0.305 g
- Mangan sulphate 0.1525 g
- Diamonium hydrogencitrate 6.1 g

cấy ria để tách khuẩn lạc từ hỗn hợp giống.?tg
2.3.3. Phương pháp nhân giống.
Nhân giống cấp 1 chủng Lactobacillus acidophilus để tạo chủng sản xuất.
2.3.4. Phương pháp lên men.
Khi lượng giống nhân lên đủ cho yêu cầu sản xuất, tiến hành lên men bề mặt
trong các roux.?
2.3.5. Phương pháp nhuộm gram.
Tiến hành nhuộm gram tế bào vi khuẩn để phân loại vi khuẩn. nó cho
phép ta phân biệt hai nhóm vi khuẩn tùy theo phản ứng với thuốc nhuộm?.
2.3.6. Phương pháp thu nhận sinh khối.
Thu nhận sinh khối từ các roux bằng nước muối sinh lí, sau đó đem li tâm ở
tốc độ 3000 vòng/ phút/ 10 phút, thu lấy phần tế bào lắng.
2.3.7. Định lượng gián tiếp vi sinh vật bằng phương pháp đếm số lượng
khuẩn lạc trên môi trường đặc.?
24
Phần III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
25

Trích đoạn Cố định sinh khối tế bào trên tá dược

---