VIỆN CƠ ĐIỆN NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHỆ STH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI:

HOÀN THIỆN CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYM PHYTAZA
ĐỂ BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN CHĂN NUÔI VÀ PHỤC VỤ
MỘT SỐ NGÀNH CÔNG NGHIỆP CNĐT: NGUYỄN THÙY CHÂU 8115

photphat photphohydrolaza) là một enzym có khả năng xúc tác phản ứng thủy
phân axit phytic (và các muối của axit này), giải phóng ra một hoặc nhiều gốc
photphat vô cơ tự do và myo - inositol phân tử thấp, là các dạng chất dễ tiêu hóa
hơn các hợp chất ban đầu. Phytaza cũng như tất cả các enzym khác đều có sẵn
trong mô, cơ quan của động, thự
c vật và tế bào vi sinh vật[29, 38, 39]. Tuy nhiên
khi nghiên cứu để tách và sản xuất phytaza, đặc biệt là sản xuất với quy mô công
nghiệp thì nguồn vi sinh vật là nguồn để sản xuất enzym có ưu thế hơn cả. Có
nhiều loài có khả năng sinh tổng hợp phytaza như Aspegillus niger, Aspegillus
ficcum, Aerobacter aerogenes, Bacillus subtilis, Escherrichia coli, Rhizopus
microsporus, Saccharomyces serevisie…[15, 37]
Phytaza được phát hiện đầu tiên vào năm 1907, đến năm 1994 thì những
ứng dụng của phytaza bắt đầu được đẩy mạ
nh. Người ta đã sản xuất enzym

2
phytaza dưới dạng các chế phẩm dạng bột, hoặc dạng nước dùng bổ sung vào
thức ăn gia súc và gia cầm, nhằm tăng hệ số sử dụng thức ăn của vật nuôi. khi
thêm phytaza vào thức ăn chăn nuôi từ 250IU/kg đến 1000IU/kg có thể thay thế
hoàn toàn việc bổ sung photpho. Hiệu quả của việc ứng dụng này đã được kiểm
định. Tại Mỹ, người ta dự tính rằng nếu phytaza đượ
c sử dụng trong thức ăn cho
tất cả các loài động vật dạ dày đơn thì sẽ giải phóng được một lượng photpho
tương ứng với giá trị 168 triệu USD và loại trừ được 8,23x10
4
tấn photphat thải
ra môi trường hàng năm. Ở Hà Lan, phytaza của nấm mốc A. niger được bổ sung
vào thức ăn chăn nuôi đã làm giảm ô nhiễm photphat từ 30 đến 40%. Vì những
tính chất rất ưu việt của phytaza, nên số công trình nghiên cứu về enzym này
hàng năm tăng lên rõ rệt. Trong những năm gần đây việc phân lập và tuyển chọn

hành nghiên cứu đề tài nhánh: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzym phytaza
từ nấm mốc”. Hội đồng nghiệm thu đề tài cấp Nhà nước đã có biên bản đề nghị
đề tài nhánh này được chuyển thành dự án sản xuất thử nghiệm.
Kết quả của đề tài là đã tuy
ển chọn được các chủng A. niger có hoạt lực
phytaza cao, hoạt lực của các chủng phân lập dao động từ 9 đến 13IU/ml. Chúng
tôi cũng đã tiến hành nghiên cứu công nghệ sản xuất phytaza theo phương pháp
lên men chìm sục khí. Kết quả cho thấy phương pháp nuôi cấy lên men chìm sục
khí đã cho hoạt lực phytaza là 13,5IU/ml. Chế phẩm đã được đánh giá trên lợn,
gà, và bước đầu đã cho những kết quả tốt.
Xuất phát từ
những vấn đề nêu trên, trong hai năm 2007-2009 Bộ môn
Nghiên cứu công nghệ sinh học sau thu hoạch, Viện Cơ điện Nông nghiệp và
Công nghệ Sau thu hoạch đã được Bộ khoa học công nghệ và môi trường hỗ trợ
dự án: “Hoàn thiện công nghệ sản xuất enzym phytaza để bổ sung vào thức ăn
chăn nuôi và phục vụ một số ngành công nghiệp”
1.2 Xuất xứ của dự án
Là kết quả củ
a đề tài cấp Nhà nước KC-04-20: “Nghiên cứu áp dụng công
nghệ vi sinh hiện đại để sản xuất chế phẩm giàu axit amin và enzim từ nguồn thứ
phẩm nông nghiệp và thủy hải sản ở quy mô bán công nghiệp” được nghiệm thu
cấp Nhà nước ngày 18/4/2006. Hội đồng nghiệm thu đề tài đã đề nghị xây dựng
đề tài nhánh “Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzym phytaza” thành dự án sản
xuất thử nghiệm.
1.3 Mục tiêu của dự
án
 Có được dây chuyền công nghệ và thiết bị sản xuất chế phẩm phytaza qui mô
50 tấn/năm. Hoạt tính phytaza thô hoạt tính đạt 2500IU/g
 Phát triển sản xuất enzym phytaza dùng trong chăn nuôi và một số ngành
công nghiệp khác.

* Ứng dụng của enzim phytaza trong chăn nuôi
Những điều tra đầu tiên về ứng dụng enzim trong dinh dưỡng động vật đã
được thực hiện từ những năm 1920. Tuy nhiên đến năm 1950, ngành công
nghiệp sản xuất enzim mới thực sự được bắt đầu. Tác giả Cromwell G.L.[ 9]
cho rằng trước đây enzim không được sử dụng trong khẩu phần thức ăn gia súc
mà ch
ỉ sử dụng trong thực phẩm cho người nhưng từ giữa thập niên 1990, sản
phẩm enzime sử dụng trong công nghiệp chế biến thức ăn gia súc của thế giới đã
phát triển mạnh. Chúng được sử dụng khá phổ biến ở các nước tiên tiến và được
xem như là một chuẩn mực về dinh dưỡng trong khẩu phần ăn gia súc. Người ta
nhận thấy rằng việc bổ
sung enzim vào thức ăn chăn nuôi làm tăng khả năng hấp
thụ dinh dưỡng từ thức ăn và làm giảm lượng muối khoáng thừa thải ra trong quá
trình chăn nuôi [32]. Để có thể thu được những kết quả tốt như vậy, có một số lý
do chính để giải thích như sau:
+ Enzim có khả năng cắt một số liên kết đặc hiệu trong thức ăn chăn nuôi
để giải phóng các muối khoáng và axit amin. Việc bổ sung m
ột lượng enzim
thích hợp vào thức ăn hàng ngày cho gia súc, gia cầm đã tạo ra các chất dễ tiêu
hóa như là glucoza từ các polysacharit.

5
+ Enzim ngoại bào có thể giúp cho các động vật non tiêu hóa tốt hơn. Bởi
vì cơ thể chúng sản xuất ra một lượng enzim không đáp ứng đủ nhu cầu của bản
thân. Chính vì vậy việc bổ sung thêm các enzim đã giúp cho động vật dễ tiêu hóa
và hấp thu được một lượng lớn dinh dưỡng từ thức ăn.
+ Một số enzim được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi đã phân hủy các tác
nhân kháng dinh dưỡng trong thức ăn và làm tă
ng giá trị dinh dưỡng của thức ăn.
Tóm lại, enzim thức ăn đã làm tăng tỷ lệ tiêu hóa thức ăn và năng suất

6
chất. Theo tác giả Vũ Duy Giảng [2] để phân giải được protein trong lớp tế bào
chất và axit phytic thì cần phải thêm cả phytaza và xellulaza và pentosanaza.
Một số chế phẩm thương mại gồm hỗn hợp các enzim được sử dụng trong
chăn nuôi nhằm giúp cho gia súc, gia cầm tăng tỷ lệ tăng trọng đang có mặt trên
thị trường như: RONOZYME VP, RONOZYME B, RONOZYME A và chế
phẩm AQUAZYME, Allzym SSF của Mỹ. Các chế phẩm này ngoài thành phần
chính là phytaza còn có các enzym khác như amylaza, pectinaza…
đã giúp tăng
cường khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng, khoáng chất và vitamin trong thức
ăn gia cầm, gia súc… Trong đó, chế phẩm Allzym SSF của công ty Altech được
tạo ra khi lên men chủng nấm mốc A. niger tự nhiên ở cơ chất rắn trên môi
trường cám mỳ ngoài enzim phytaza chủ yếu ra còn có 6 enzim khác như:
amylaza, xelulaza, xylanaza, β-glucanaza, pectinaza và proteaza cũng được tạo
ra từ chính chủng nấm mốc trên. Điều đó sẽ tiết kiệ
m được chi phí sản xuất.
Vào cuối thế kỷ XX ngành chế biến đậu tương đã mở rộng thành công trên
thị trường. Theo tác giả O’Quinn [23] đậu tương và các loại ngũ cốc đã được
tăng cường sử dụng làm thức ăn cho động vật nhằm mục đích giảm giá thành
bằng cách thay thế một phần protein động vật trong thức ăn bằng protein thực
vật. Nhưng trong đậ
u tương có chứa một lượng lớn các axit phytic và các chất
kháng dinh dưỡng do đó đã gây hạn chế khi sử dụng chúng làm thức ăn chăn
nuôi.
Đối với động vật nhai lại, sự có mặt phytaza trong hệ enzim tiêu hoá do
các vi sinh vật trong dạ cỏ và ruột kết của chúng sinh ra có khả năng giải phóng
photpho vô cơ từ axit phytic. Tuy nhiên, đối với các loài động vật có dạ dày đơn
như gia cầm, lợn và cá sản xuất rất ít hoặ
c không có mặt phytaza trong hệ tiêu
hoá thì chúng không có khả năng chuyển hoá axit phytic. Vì vậy, photphat vô cơ

phải chịu được nhiệt độ cao, bởi vì thức ăn cho gia cầm và lợn hầu hết ở dạng
viên để đảm bảo rằng động vật có một khẩu phần ăn cân b
ằng và thuận lợi cho
quá trình bảo quản các sản phẩm có chứa enzim trong công nghiệp thức ăn chăn
nuôi. Theo Wyss [43], trong suốt quá trình chế biến viên nhiệt độ có thể lên đến
90
0
C và đó là nguyên nhân giảm hoạt tính của enzim trong quá trình bảo quản.
Chi phí sử dụng phytaza bổ sung vào thức ăn chăn nuôi sẽ giảm đi nếu như tính
chịu nhiệt của enzim tăng lên trong quá trình chế biến thức ăn từ thực vật
Để ứng dụng phytaza vào chăn nuôi ở mức độ công nghiệp, đặc tính quan
trọng nhất của phytaza cần được quan tâm là khả năng hoạt động của nó ở ph
ạm
vi pH thường thấy trong hệ tiêu hoá. Đột biến trực tiếp vị trí đã xác nhận rằng
việc thay đổi Gly-277 và Tyr 282 của phytaza tự nhiên từ chủng nấm mốc A.
fumigatus bằng gốc Lys và His đúng với phytaza của nấm A. niger đã làm tăng
pH hoạt động của nó từ 2,8 lên 3,4. Hơn thế nữa đột biến gốc Arg-274 thành
Gln và Gln 27 thành Leu/Thr/Ile của phytaza A. niger T213 và A. fumigatus đã
lần lượt làm tăng tính đặ
c hiệu của chúng lên nhiều lần.[27]

8
Việc sử dụng chế phẩm enzim phytaza bổ sung vào thức ăn cho chăn
nuôi ngày càng được tăng cường, bởi vì qua các nghiên cứu đã cho thấy rằng
việc bổ sung chế phẩm sinh học nói chung và chế phẩm enzim nói riêng vào thức
ăn cho gia súc, gia cầm đã đưa sản lượng lên rất cao với giá thành hạ. Những
nghiên cứu cho thấy bổ sung tối ưu 227 đơn vị phytaza trên pound thức ăn (1
pound = 0,454 kg) đã thay thế khoảng 0,1% lượng photpho trong b
ột ngô, đậu
tương. Ronozym P = 2500 FYT/g và cho vào 0,4 lb/tấn thức ăn (225 g/tấn thức

Fe
2+
, ngoài ra nó còn kìm hãm protein cũng như các enzim tiêu hoá.
Đứng trước một thực tế như vậy, việc nghiên cứu và ứng dụng phytaza vào
thức ăn cho người nhằm trợ giúp bộ máy tiêu hoá của con người trong quá trình
đồng hoá các thức ăn chứa nhiều phytat cũng đã được đề cập đến. Bên cạnh đó
việc bổ sung phytaza vào thức ăn đã làm tăng giá trị dinh dưỡng của thực phẩm

9
có nguồn gốc từ thực vật bằng cách làm tăng sự tiêu hoá của protein và khả năng
hấp thụ các vitamin trong quá trình thuỷ phân phytat khi tiêu thụ hoặc chế biến
thức ăn [35].
Ngoài những ứng dụng đã nêu trên, công nghiệp thực phẩm cũng quan tâm
đến việc sử dụng phytaza một mặt để thúc đẩy sự hấp thu muối khoáng hoặc
bằng việc làm giảm phytat có trong thành phần thực phẩm, mặt khác để s
ản xuất
thức ăn chức năng. Theo tác giả Sandberg [36] các nấm mốc sử dụng trong lên
men sản phẩm truyền thống có khả năng sinh phytaza. Tempeh là thức ăn lên
men truyền thống bằng cách nuôi cấy nấm Rhizopus oligosporus trên đậu tương
và chính bản thân chủng nấm mốc này đã sinh phytaza và làm cho sản phẩm đậu
tương lên men trở nên dễ tiêu hoá hơn. Anno và đtg [3] đã loại bỏ phytat trong
sữa đậu nành trước khi sử dụ
ng bằng việc bổ sung phytaza của lúa mỳ của hãng
Sigma. Phytaza Finase S đã được sử dụng để sản xuất sữa đậu nành không có
phytat. Phytat trong sữa đậu nành đã được thủy phân thành công bằng việc sử
dụng phytaza của lúa mỳ được cố định.
Khi sử dụng phytaza ngoại bào từ nấm A. ficuum NRRL 3135 cũng đã
tạo ra các sản phẩm không có phytat từ các loại đậu. Theo tác giả Han thì 78%
phytat trong bột đậu tương b
ị mất đi khi cho phytaza của nấm A. niger vào sản

bị
thải ra ngoài theo phân. Hơn nữa đây là những loài động vật sống dưới nước
vì vậy lượng photpho thải vào trong nước sẽ làm ô nhiễm nguồn nước gây hậu
quả rất nghiêm trọng. Bởi vậy việc thêm phytaza vào thức ăn cho cá đã làm giảm
lượng phytat thải vào trong nước tới mức cho phép đồng thời đảm bảo giá thành
thấp trong ngành công nghiệp nuôi trồng thuỷ sản. Đã có một số nghiên cứu về
ảnh hưởng của phytaza trong thức ăn cho cá có nguồn gốc từ thực vật [33]
Chamberlain [7] đã nghiên cứu và cho rằng việc tiêu thụ hải sản toàn
cầu sẽ tăng 35% vào năm 2025. Ngành công nghiệp nuôi trồng thuỷ sản sẽ ngày
càng phát triển để đáp ứng nhu cầu về hải sản của toàn thế giới. Điều này cho
thấy một tiềm năng lớn để mở rộng thị trườ
ng phytaza vào sản xuất thức ăn sử
dụng cho nuôi trồng thuỷ sản. Trong khi hiện nay thị trường chủ yếu của
phytaza là sử dụng như chất phụ gia thực phẩm để bổ sung cho thức ăn gia cầm
và lợn.
1.4.1.6 Tình hình nghiên cứu, sản xuất phytaza và ứng dụng ở Việt Nam
Ở Việt Nam, cho đến nay chưa có nơi nào sản xuất enzim phytaza. Hàng
năm nước ta vẫn phải nhập mộ
t lượng lớn phytaza từ các công ty nước ngoài như
Novo của Đan Mạch, Roche của Thụy Sĩ. Nguồn phế phụ phẩm nông sản của
nước ta rất dồi dào là cơ sở thuận lợi cho việc sản xuất enzym này ở trong nước.
Việc nghiên cứu sản xuất phytaza ở Việt Nam là rất cần thiết nhằm giảm giá
thành enzim này.

11
Việc sử dụng enzym chăn nuôi ở nước ta mới chỉ được ứng dụng trong
một vài năm gần đây với việc sử dụng các chế phẩm enzim của nước ngoài ở các
đơn vị sản xuất lớn như công ty Liên doanh thức ăn gia súc Mỹ, Công ty thức ăn
gia súc con cò.
Năm 1998, Khoa Chăn nuôi, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí


12
bằng phương pháp lên men bề mặt là rất cần thiết trong khuôn khổ của dự án sản
xuất thử nghiệm này.
1.4.1.7 Những xu hướng mới trong lên men cơ chất rắn
Các tác giả Ashok Pandey[ 4], Author B. Bogar [ 5] đã nghiên cứu và kết
luận rằng lên men cơ chất rắn có thể tiến hành trực tiếp với các nguyên liệu rẻ
tiền như tinh bột, cellulose, lignin, hemicellulose và chitin đã xử lý hoặc tiền xử
lý. Quá trình lên men cơ chất rắn là t
ương đối đơn giản, ít sử dụng năng lượng và
nó có thể cung cấp vi môi trường đồng nhất thuận lợi cho sự phát triển của vi
sinh vật và các hoạt tính trao đổi chất. Hiện nay lên men cơ chất rắn đang được
các nhà khoa học hết sức quan tâm và xem như là một sự đổi mới trong nghiên
cứu các quá trình lên men sinh học, trước tiên là do lên men cơ chất rắn có nhiều
thuận lợi.
Các công trình nghiên cứu của các tác giả
Ashok Pandey[4], Author B.
Bogar [ 5] đã có bài viết tổng quan về lên men cơ chất rắn cho sản xuất các
enzym công nghiệp. Các tác giả này đã kết luận rằng lên men cơ chất rắn giữ vị
trí quan trọng trong việc sản xuất các enzym ở qui mô công nghiệp. Điều đặc
biệt quan tâm trong quá trình này là các sản phẩm lên men thô có thể sử dụng
trực tiếp như các nguồn enzym .
Author B. Bogar B. et al [5] đã nghiên cứu sản xuất phytaza bởi 3 loại nấm
bất toàn (A. ficuum NRRL 3135, Mucor racemosus NRRL 1994 và Rhizopus
oligosporus NRRL 5905) trên 4 thành phần thức ăn gia súc tự nhiên (bột hạt cải,
bột ngô, bột đậu tương, cám mì) đã được lên men bằng phương pháp lên men cơ
chất rắn (solid state fermentation-SSF) làm thức ăn gia súc. Chủng A. ficuum có
sản lượng cao nhất (15 IU phytaza/g chất khô trên môi trường cám mì. Ngoài ra,
việc kết hợp giữa cám gạo và tinh bột với (NH
4

0
C hơn 2 phytaza thương mại.
Chủng A. niger chịu nhiệt được sử dụng cho sản xuất phytaza ngoại bào
trên các phế phụ phẩm nông nghiệp: cám mì, khô đậu tương, khô dừa, khô bông,
bột đậu đen bằng công nghệ lên men cơ chất rắn (solid state fermentation
phytaza). Hoạt tính cực đại đạt 108IU/g cám mốc khô khi lên men trên khô đậu
đũa [16] Trong quá trình lên men, axit phytic được thuỷ phân hoàn toàn đi kèm
với sự tăng sinh khối và hoạt tính phytaza trong 7 ngày. Trong các hoạt tính bề
mặt bổ sung, Trixton X-100
ở liều 0,5% đã làm tăng hoạt tính phytaza 30%.
KH
2
PO
4
(10 mg/100g môi trường phế phụ phẩm nông sản) đã làm tăng hoạt tính
phytaza. pH và nhiệt độ tối ưu của enzym thô là 5,0 ở nhiệt độ 50
0
C. Hoạt tính
phytaza (86%) còn lại trong dung dịch đệm ở pH 3,5 trong 24 giờ. Enzym còn lại
75% hoạt tính của nó khi ủ ở 55
0
C trong 1 giờ. Trong sự có mặt của 1 mM K
+
và
Zn
2+
hoạt tính của enzym còn lại 95% và 55% theo thứ tự. Ngoài việc lên men cơ
chất rắn không đòi hỏi yêu cầu trang thiết bị đắt tiền và có thể tận dụng được các
phế phụ phẩm nông nghiệp, thì các tác giả Park, J.S , Lachman M.D., Carter SD
[28] còn thấy rằng phytaza được sản xuất bằng lên men cơ chất rắn đã nâng cao

Vì vậy, theo tính toán của chúng tôi enzim phytaza thô dùng trong chăn nuôi do
dự án sản xuất s
ẽ có giá khoảng 60.000 đồng/kg, trong khi đó giá phytaza
Ronozym của hãng Novozymes hiện bán trên thị trường Việt nam có giá
72000đ vì vậy giá enzim phytaza thô của dự án có khả năng cạnh tranh với
enzim phytaza dùng trong chăn nuôi ngoại nhập.
Những điều kiện trên đây là cơ sở quan trọng cho việc triển khai sản xuất
thử và tiến tới sản xuất qui mô công nghiệp enzim phytaza để cung cấp cho chăn
nuôi và các ngành công nghiệp khác và dự án là hoàn toàn có tính khả thi.
Ở nước ta nhu cầu th
ức ăn gia súc trong những năm qua là 8 triệu tấn/năm,
vậy lượng chế phẩm enzim cần bổ sung vào thức ăn chăn nuôi là 160 nghìn
tấn/năm (với liều là 200g/ 1tấn thức ăn). Riêng nhu cầu sử dụng enzim phytaza
trong thức ăn chăn nuôi ước khoảng 500 tấn mỗi năm nhưng enzim này đang
phải nhập toàn bộ từ nước ngoài. Chính vì vậy, để đáp ứng được nhu cầu phytaza
bổ sung vào th
ức ăn chăn nuôi nói trên thì dự án cần được mở rộng ra gấp nhiều
lần. 15
* Chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm phytaza nước ngoài
- Tên sản phẩm: Ronozym của hãng Novozymes hiện bán trên thị trường Việt
nam
Chỉ tiêu Yêu cầu Kết quả
Dạng bột đạt
Màu sắc màu be đạt
Độ ẩm (%) Không quá 10,0 9,5
Hoạt tính, FTU/g không thấp hơn 2500 2950
Các chỉ tiêu vi sinh

- Xác định tính chất của phytaza từ chủng Aspergillus ficcuum NRRL 3135 (pH
tối ưu, khả năng chịu nhiệt, khả năng thủy phân bằng pepsin, trypsin)

16
- Xác định tính chất của phytaza từ chủng Aspergillus niger MP2 (pH tối ưu, khả
năng chịu nhiệt, khả năng thủy phân bằng pepsin, trypsin)
- Xác định tính chất của phytaza từ chủng Aspergillus niger NCIM 563 (pH tối
ưu, khả năng chịu nhiệt, khả năng thủy phân bằng pepsin, trypsin)
- Xác định tính chất của phytaza từ chủng Rhizopus microsporus (pH tối ưu, khả
năng chịu nhiệt, khả năng thủy phân bằng pepsin, trypsin)
2. Hoàn thiện qui trình nhân giống cho sản xuất phytaza qui mô 1000l/mẻ.
3. Hoàn thiện qui trình lên men cơ chất rắn sản xuất phytaza qui mô 1,4 tấn/mẻ
(50 tấn/năm).
- Kỹ thuật khử trùng phòng nuôi cấy bề mặt bằng hóa chất.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của pH dịch khoáng đến khả năng sinh phytaza
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất cảm ứng đến khả năng sinh phytaza
- Nghiên cứu ảnh hưởng của m
ột số nguồn cơ chất khác nhau đến quá trình lên
men cơ chất rắn thu nhận phytaza
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh phytaza
- Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh phytaza
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến khả năng sinh phytaza
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh phytaza
- Tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp phytaza bằng phương pháp lên men cơ chất
rắn
4. Hoàn thiện qui trình công nghệ tách chiết phytaza dạng thô 1,4 tấn/mẻ (50
tấn/năm)
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các dung dịch đệm đến khả năng chiết enzym
- Xây dựng quy trình tách chiết phytaza từ cơ chất lên men
5. Hoàn thiện qui trình công nghệ tạo chế phẩm phytaza dạng bột


Chủng A. niger giữ giống trên ống
thạch nghiêng
Nhân giống trên bình tam giác nuôi cấy lắc
ở vận tốc 200 v/phút trong 20 giờ trên môi
trường PDA, nhiệt độ 30

Giống A. niger đã được nhân giống trên
hệ thống lên men chìm sục khí 1000
lit/mẻ trong 48 giờ
Lọc thu dịch nổi chứa hỗn hợp enzym
Cô đặc enzym bằng thiết bị lọc luân
hồi qui mô 1000 l/ mẻ

Phối trộn để ổn định và bảo
quản hỗn hợp enzym

xuất phytaza ở qui mô 1000 lít/ mẻ. Nhưng qui mô này còn nhỏ, giá thành sản
phẩm còn cao và công nghệ tạo chế phẩm phytaza ở dạng bột mới chỉ giữ được
hoạt tính enzim trong thời gian từ 3 đến 6 tháng cho nên chưa đáp ứng được nhu
c
ầu sử dụng phytaza trong chăn nuôi của nước ta.
Để có thể tận dụng được nguồn nguyên liệu là phế phụ phẩm nông nghiệp
như là cám gạo, bột ngô… phương pháp lên men bề mặt (lên men cơ chất rắn)
sản xuất phytaza được sử dụng trong dự án này.
* Những vấn đề cần hoàn thiện trong khuôn khổ của dự án sản xuất
thử
+Về chủng giống
Để có được b
ộ chủng giống A. niger có hoạt tính cao và ổn định phục vụ
cho sản xuất enzim phytaza ở quy mô công nghiệp, chúng tôi thấy cần tiếp tục
tuyển chọn các chủng A. niger có hoạt tính phytaza cao, có khẳ năng chịu nhiệt
cao và có độ ổn định cao để có thể sản xuất phytaza ở mức độ thương mại
+Về công nghệ lên men
Để sản xuất phytaza ở lượng lớn phục vụ s
ản xuất, chúng tôi thấy cần hoàn
thiện công nghệ lên men bề mặt (lên men cơ chất rắn) cho sản xuất phytaza thô
qui mô 120 tấn/năm.
+ Về công nghệ thu hồi và tạo chế phẩm
Để có thể sản xuất phytaza ở lượng lớn phục vụ sản xuất, chúng tôi thấy cần
nâng cao công suất của hệ thống thu hồi enzim bằng việc sử dụng thiết bị lọc
luôn hồi công suấ
t 1000l/ mẻ. Đây là thiết bị hiện đại dùng để cô đặc enzim ở qui
mô công nghiệp, vì vậy chúng tôi thấy cần phải đầu tư kinh phí và thời gian để

21
nắm vững phương pháp sử dụng và rút ra các thông số kỹ thuật cho công nghệ cô

xong thì ngắt hơi và bơm nước từ bể lạnh để làm nguộ
i môi trường, khi nhiệt độ
môi trường trong tăng giảm xuống còn 30
0
C thì tiến hành tiếp giống.
¾ Quá trình tiếp giống
Chủng A.niger DL1 nghiên cứu được nhân giống trên máy lắc trên môi
trường nhân giống sau 24 giờ, giống được truyền vào tăng nuôi cấy với tỷ lệ

22
7 %- 10 %.
¾ Điều khiển oxy hòa tan, nhiệt độ và pH trong quá trình nhân giống
chủng A.niger ở qui mô 3000l/mẻ
Lượng oxy hòa tan trong môi trường nuôi cấy chìm sục khí được giữ ở
nồng độ 90 - 100% tùy vào thời các điểm nuôi cấy. Nồng độ oxy hòa tan trong
tăng nuôi cấy được điều khiển bằng hệ thống điều khiển oxy hòa tan tự động.
Nhiệt độ nuôi cấy được điều khiển b
ằng hệ thống điều khiển nhiệt độ đến nhiệt
độ thích hợp cho chủng A. niger. pH của môi trường nuôi cấy được điều khiển
bằng hệ thống điều khiển pH tự động đến pH 6 thích hợp cho chủng A. niger.

2.3.2. Các phương pháp khử trùng phòng nuôi cấy bề mặt
- Xông hơi Formon nồng độ 1lít dịch trong phòng lên men bề mặt thể tích 10m
3

thời gian xông hơi 24h.
- Dùng dung dịch Javen nồng độ 8% để lau hoặc phun lên bề mặt phòng nuôi cấy
(bao gồm sàn nhà, tường nhà, bề mặt các đồ dùng và trang thiết bị, cửa, …)
- Dùng dung dịch Cloramin B nồng độ 5% (pha 5g bột cloraminB trong 1 lít
nước) để lau hoặc phun lên bề mặt bị ô nhiễm (bao gồm sàn nhà, tường nhà, bề

– 30
0
C,
với tỷ lệ tiếp giống là 8%, lên men cho sản xuất phytaza trong thời gian từ 7
ngày đến 10 ngày đến khi các bào tử của chủng A. niger xuất hiện dày trên mặt
khay lên men.
2.3.4. Xác định hoạt độ phytaza theo phương pháp của F.C. Van der Heeft
Nguyên tắc :
Phương pháp dựa trên cơ sở sự thuỷ phân phytat natri (cơ chất của
phytaza) bằng dịch chế phẩm phytaza rồi sau đó làm vô hoạt enzym và tạo phản
ứng màu bằng hỗn hợp dung dị
ch Amoni heptamolybdat tetrahydrat và amoni
monovanadat. Định lượng sản phẩm – các gốc photphat vô cơ - được tạo thành
trong phản ứng thuỷ phân bằng phản ứng tạo phức có màu vàng với thuốc thử là
hỗn hợp dung dịch trên. Cường độ màu của phức tạo thành được xác định bằng
phương pháp đo quang phổ ở bước sóng λ = 415 nm. Sau đó dựa vào đồ thị
đường cong chuẩn của natri dihydrophotphat để tính lượng sản phẩm tươ
ng ứng
do enzym xúc tác tạo nên.
Hoạt độ phytaza (tạm ký hiệu là: HđF) của chế phẩm enzym đặc trưng cho
khả năng xúc tác phân giải hợp chất phytat (myo – inositol hexakis photphat)
thành các myo – inositol photphat phân tử thấp hơn và các gốc photphat vô cơ.
Hoạt độ phytaza được biểu thị bằng số đơn vị hoạt độ trong một 1 ml (hay 1g)
chế phẩm.
Định nghĩa đơn vị hoạt độ enzym: Một đơn vị hoạt độ phytaza là l
ượng enzym
xúc tác phản ứng thuỷ phân để giải phóng ra 1µmol phosphat vô cơ trong thời
gian một phút từ dung dịch phytat – natri ở 37°C, pH = 5,5 và trong các điều
kiện của phương pháp này.
2.3.5. Phương pháp xác định tính chất của phytaza

trường lên men đến khả năng sinh phytaza của chủng A.niger DL1
Cám gạo, cám ngô, trấu được làm ẩm đến 65% bằng những dung dịch
khoáng có giá trị pH khác nhau từ 3.0 – 7.0. Sau khi thanh trùng kiểm tra lại pH
nhằm tìm ra giá trị pH thực củ
a môi trường rồi tiến hành lên men chủng A. niger
DL1 trong các khay nhựa kích thước 50cmx40cmx10cm, độ dày môi trường
khoảng 5cm , tỉ lệ tiếp giống là 8% ở 28- 30
0
C trong 7 ngày. Sau 7 ngày tiến
hành chiết cơ chất lên men rắn bằng đệm natri axetat đệm 0,1M; theo tỉ lệ 1 : 1,5.
Sau 24 giờ dùng vải màn vắt kiệt thu dịch enzym phytaza. Dịch thu được sau đó
được ly tâm 14000v/p trong 20 phút để loại xác tế bào, thu dịch nổi để xác định
hoạt độ enzym phytaza sinh tổng hợp được.
2.3.7. Phương pháp xác định ảnh hưởng của chất cảm ứng đến khả năng
sinh phytaza từ chủng A. niger DL1
Chất cảm
ứng Na- phytat được pha ở các nồng độ khác nhau từ 0 -
200µmol/l (bước nhảy 50µmol/l).