Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực tập tại Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Đà Nẵng em đã
được các anh chị hướng dẫn, chỉ bảo tận tình giúp chúng em hoàn thành nhiệm vụ nhà
trường giao cho. Em xin chân thành cảm ơn trung tâm rất nhiều, đặc biệt là chị Nguyễn
Thị Minh Quyên (người hướng dẫn trực tiếp) và anh Võ Quốc Bảo – Trưởng phòng Công
nghệ tế bào thực vật, cùng với tất cả các anh chị trong Trung tâm.
Trung tâm Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho chúng em có cơ hội làm việc
thực tế qua đó cũng cố lại những kiến thức lý thuyết đã học giúp chúng em hiểu thêm về
ngành học của mình. Trong một tháng thực tập, em không tránh khỏi những sai lầm và
thiếu sót mong các anh chị thông cảm và bỏ qua cho em. Em xin chân thành cảm ơn.

Đà Nẵng, ngày 10 tháng 1 năm 2012.
Sv: Nguyễn Lương Bằng
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 1
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
1.1. Lịch sử, bộ phận chức năng và tình hình hoạt động của Trung tâm
Công nghệ Sinh học Đà Nẵng: 5
1.2. Chức năng, nhiệm vụ phòng Công nghệ Tế bào Thực vật: 5
1.3. Bố trí tổng mặt bằng trung tâm 6
1.3.1. Phòng rửa, sản xuất nước khử ion, hấp môi trường: 6
1.3.2. Phòng chuẩn bị môi trường: 7
1.3.3. Phòng nuôi mẫu cấy: 9
2.1. Thành phần chính của môi trường 10
2.1.1. Đường 10
2.1.2. Các muối khoáng đa lượng 10
2.1.3. Các muối khoáng vi lượng: 11
2.1.4. Các vitamin 12
2.1.5. Các chất điều khiển sinh trưởng: 12
2.1.6. Các chất hữu cơ khác 13
2.2. Vấn đề lựa chọn môi trường 14

nghiệp hóa phẩm 13,53 tỷ đồng, axit amin 4,5 tỷ đồng, sản phẩm phục vụ nông nghiệp
218,7 tỷ đồng. Các sản phẩm phục vụ riêng cho tạo giống cây trồng, vật nuôi là 210 tỷ
đồng, các cây cố định đạm 8,7 tỷ đồng, dịch đường Fructose thay saccharose 5,4 tỷ
đồng [1]
Một trong những thành tựu nổi bật của công nghệ sinh học là lĩnh vực nhân giống và
phục tráng giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, tạo ra công
nghệ nhân nhanh các giống cây lương thực, rau quả, cây hoa cảnh, cây công nghiệp và
cây rừng có năng suất chất lượng tốt và tính chống chịu cao đối với các điều kiện ngoại
cảnh bất lợi cũng như sâu bệnh, phục vụ phát triển nông – lâm nghiệp và phủ xanh đất
trống đồi núi trọc.
Đối với một nước đang phát triển như nước ta hiện nay thì công nghệ sinh học
chỉ bước đầu hình thành và phát triển thì việc đi sâu vào nghiên cứu cũng như ứng dụng
những nghiên cứu đó vào thực tế sản xuất để nâng cao năng suất cây trồng, vật nuôi là
việc làm cần thiết. Vì thế là sinh viên ngành công nghệ sinh học thì việc thực tập thực tế
để hiểu về quá trình sản xuất thực tế ngành nuôi cấy mô và qua đó cũng cố lại những
kiến thức lý thuyết đã học là việc không thể thiếu. Đó cũng là mục đích của việc thực tập
tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng lần này.
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 4
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
II. TỔNG QUAN VỀ TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐÀ NẴNG
1.1. Lịch sử, bộ phận chức năng và tình hình hoạt động của Trung tâm
Công nghệ Sinh học Đà Nẵng:
- Lịch sử Trung tâm:
Được tách ra từ Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học và Ứng Dụng Khoa Học Công
Nghệ Đà Nẵng theo quyết định số 8725/QD-UBND ngày 12 tháng 11 năm 2010 và
chính thức trở thành Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng ngày 01.01.2011.
- Các bộ phận chức năng:
+ Ban giám đốc
+ Phòng Tổng hợp Hành chính
+ Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật

o
C.
- Áp suất: max = 4 kpa
- Dung tích 110 lít.
1.3.2. Phòng chuẩn bị môi trường:
Gồm có tủ đựng hoá chất và các máy sau:
pH meter
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 7
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
Cân kỹ thuật Cân phân tích
- Độ chính xác 10
-3
g. - Độ chính xác 10
- 4
g.
- max = 320 g. - max = 210 g.
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 8
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
Phòng cấy vô trùng:
Phòng cấy vô trùng, sàn được lát gạch men, tường được sơn, trên tường có gắn đèn UV
để khử trùng phòng. Cửa phòng cấy là cửa kính. Trong phòng cấy có các kệ thép được
sơn trắng để đựng bình môi trường. Có 2 loại tủ cấy : tủ cấy đơn và tủ cấy đôi. Trong tủ
cấy có đèn trắng để dễ làm việc và đèn UV để khử trùng trước khi làm việc. Ngoài ra,
trong phòng cấy còn có bình chữa lửa để có thể dập tắt lửa kịp thời khi gặp sự cố như
cháy đèn cồn
Tủ cấy đơn
1.3.3. Phòng nuôi mẫu cấy:
- Có 2 phòng nuôi có diện tích 4 x 5 m.
- Tường phòng nuôi được sơn màu trắng. Các giá đèn được lắp đèn huỳnh
quang để chiếu sáng.

2.1.2. Các muối khoáng đa lượng
Nhu cầu muối khoáng của mô và tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với
cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là: N, P,
K, Ca, Mg và S (Bảng 2.1).
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 10
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
Bảng 2.1. Các muối khoáng đa lượng dùng trong nuôi cấy mô [2]
Stt
Nguyên tố
đa lượng
Dạng sử dụng
Nồng độ
(mm)
1
N Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O, KNO
3
, NaNO
3
,
NH
4
NO
3
,

2
PO
4
khoảng 1
3 K KNO
3
, KCl.6H
2
O, KH
2
PO
4
khoảng 10
4
Ca Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O, CaCl
2
.2H
2
O
hoặc
khoảng 2
CaCl
2
.6H

2 B H
3
BO
3
6-100
3 Zn ZnSO
4
.7H
2
O 15-30
4 Cu CuSO
4
.5H
2
O 0,01-0,08
5 Mo Na
2
MoO
4
.2H
2
O 0,007-1
6 Co CoCl
2
.6H
2
O 0,1-0,4
7 I KI 2,5-20
8 Fe FeSO
4

7 Biotin 0,1-1
8 Folic acid 0,1-1
2.1.5. Các chất điều khiển sinh trưởng:
Một số chất sinh trưởng không tan trong nước, do đó khi pha dung dịch mẹ chất
sinh trưởng cần chú ý:
- Đối với BAP (hay BA): trước hết thêm 2-3 giọt nước cất và vài giọt HCl 1 N,
lắc cho tan sau đó thêm nước cất đến thể tích cần pha.
- Đối với KIN: thêm 2-3 giọt NaOH 1 N trước khi pha đến thể tích cần thiết.
Bảo quản dung dịch mẹ chất sinh trưởng trong lọ kín (riêng IAA bảo quản trong
lọ màu nâu), cất giữ tủ lạnh. 2,4-D, NAA tương đối bền có thể bảo quản như vậy trong
một năm. BAP, IBA, KIN, và GA
3
bảo quản được từ 2 đến 3 tháng. IAA cần pha lại hàng
tháng để đảm bảo hoạt tính.
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 12
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
Bảng 2.4. Chữ viết tắt của một số chất kích thích sinh trưởng
Chữ
viết
tắt
Chất kích thích sinh
trưởng
Chữ
viết
tắt
Chất kích thích sinh
trưởng
BA Benzyladenin KIN Kinetin
BAP Benzyladeninpurine NAA Naphthaleneacetic acid
GA

Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
bảo quản trong lạnh sâu cho đến khi dùng. Thời gian bảo quản không quá vài tháng. Tốt
nhất là nên sử dụng tươi.
2.1.6.2. Dịch chiết nấm men và dịch thủy phân casein
Đây là các chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô và tế bào động
vật đã được tiêu chuẩn hóa và bán dưới dạn thương phẩm, thành phần hóa học không rõ.
Dung dịch thủy phân casein cung cấp một số amino acid, lượng thường dùng là 1g/1 L
môi trường.
2.2. Vấn đề lựa chọn môi trường
Khi khởi sự nuôi cấy mô và tế bào một số đối tượng nhất định, vấn đề đặt ra là
chọn môi trường nào và trên cơ sở nào để phối hợp tỷ lệ các chất dinh dưỡng. Cách
thường làm là qua các tài liệu đã xuất bản, xem các tác giả nuôi cấy mô trên cùng đối
tượng ấy hoặc các đối tượng gần gũi về mặt phân loại đã dùng loại môi trường gì. Bước
đầu có thể giữ nguyên môi trường của các tác giả đó hoặc trên cơ sở đó mà cải tiến cho
phù hợp qua một số thí nghiệm thăm dò.
Trong hàng trăm môi trường do rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khác
nhau, nhiều mục đích nuôi cấy khác nhau, có thể chia ra làm ba loại:
- Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: điển hình là môi trường White, Knop và
Knudson C.
- Môi trường trung bình: điển hình là môi trường B5 của Gamborg.
- Môi trường giàu chất dinh dưỡng: Điển hình là môi trường Murashige-Skoog và
Linsmaier-Skoog.
Vì vậy, khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một số đối tượng mới, chưa có tài
liệu trước thì nên thăm dò so sánh ba loại môi trường trên xem đối tượng nghiên cứu
thích hợp với loại môi trường nào nhất. Sau đó, cần tìm tỷ lệ NO
3
-
/NH
4
+

: KNO
3
1900 19
KH
2
PO
4
170
(× 10) 1,7
20 mL
NH
4
NO
3
1650 16,5
MgSO
4
.7H
2
0 370 3,7
MS
2
: CaCl
2
.2H
2
O 440
(× 20) 8,8
10 mL
MS

MoO
4
.2H
2
O 0,25 5 mg
KI 0,83 16,6 mg
MS
4
: FeSO
4
.7H
2
O 27, 85
(× 20) 0,556
10 mL
Na
2
-EDTA 37,25 0,746
MS
5
: myo-inositol 100 2
Thiamine.HCl 0,1 2 mg
Pyridoxine.HCl 0,5
(× 20) 10 mg
10 mL
Nicotinic acid 0,5 10 mg
Glycine 2 40 mg
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 16
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
Chuẩn bị môi trường Nitsch (Nt, 1956). Chia làm 5 phần:

2
0 185 1,85
Nt
2
: CaCl
2
.2H
2
O 166
(× 20) 1,66
10 mL
Nt
3
: H
3
BO
3
10 0,2
MnSO
4
.4H
2
O 25 0,5
CuSO
4
.5H
2
O 0,0025
(× 20) 0,05 mg
10 mL

(× 20) 100 mg
10 mL
Glycine 0,05 40 mg
Biotin 2 1 mg
Acid folic 0,5 10 mg
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 17
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy protoplast
- Môi trường phân lập (Protoplast Isolation medium –PI)
Bảng 2.7. Thành phần môi trường phân lập PI [2]
Stt Thành phần
Nồng độ
(mg/L)
1 CaCl
2
.H
2
O 1480
2 KH
2
PO
4
27,2
3 KNO
3
101
4 MgSO
4
.7H
2

.2H
2
O 100
(× 20) 2
10 mL
CaCl
2
.2H
2
O 450 9
PC
2
: KNO
3
2500 50
NaH
2
PO
4
.2H
2
O
170
(× 20) 3,4
10 mL
(NH
4
)
2
SO

(× 20)0,5 mg
10 mL
ZnSO
4
.7H
2
O 2 40 mg
Na
2
MoO
4
.2H
2
O 0,25 5 mg
KI 0,75 15 mg
PC
4
:
myo-inositol
100
(× 20) 2
10 mL
Nicotinic acid 1 20 mg
Lấy mỗi loại stock PC (PC
1
, PC
2
, PC
3
và PC

+ Họ phụ : Epidendroideae
+ Tông : Epidendreae
+ Giống : Dendrobium
3.3. Đặc điểm hình thái
Dendrobium có số lượng khá lớn, phân bố rộng rãi nên đặc điểm hình thái đa
dạng, do đó không có một hình dạng chung nhất định nào về hoa và dạng cây.
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 20
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
Ở Việt Nam còn gọi là Hoàng Lan hoặc Đăng Lan.Tên Dendrobium có nguồn gốc từ Hi
Lạp “Dendro” có nghĩa là gỗ, còn “bio” có nghĩa là sự sống.
- Rễ: Rễ mập, không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài sẽ chết.
- Thân: Thuộc nhóm đa thân.
- Giả hành: Là những đoạn phình to, bên trong có các mô mềm chứa dịch nhầy
nhằm làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cây trong điều kiện khô
hạn.
- Lá hình kim, mềm mỏng, mọng nước.
- Hoa: Thuộc nhóm phụ ra hoa ở nách lá.
Nhìn chung, lan thuộc giống này đều có các bộ phận sinh dưỡng như rễ, thân, giả
hành, lá và cơ quan sinh sản như hoa, trái. Dendrobium thuộc nhóm đa thân (còn gọi là
nhóm hợp trục), giả hành chứa diệp lục tố nên có thể quang hợp được, rễ của lan
Dendrobium không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài, rễ cây sẽ bị mục nát
và cây bị chết. Hạt chín và phát tán nhờ gió khi gặp nấm cộng sinh tương thích trong
điều kiện phù hợp, hạt sẽ nảy mầm. [4]
3.4. Một số tác động ảnh hưởng đến Dendrobium.
+ Ánh sáng: Rất cần thiết cho sự tăng trưởng và ra hoa. Lượng ánh sáng cần
thiết bằng khoảng 50% ánh sáng mặt trời. Nếu dùng ánh sáng nhân tạo thì cần 4 đèn
neon 40w và 2 đèn tròn 40w chiếu sáng trực tiếp lên phía cây.
+ Nhiệt độ: Dendrobium ưa thích những vùng đất thấp và ấm áp như vùng
khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát triển của
Dendrobium là:

3.5. Các giai đoạn phát triển của lan.
3.5.1. Giai đoạn nảy mầm của hạt.
Trong thiên nhiên hạt lan chỉ nảy mầm khi có nấm phù hợp do chúng không có
chất dự trữ để sử dụng nên phải lấy thức ăn có sẵn của nấm. Sau khi nảy mầm và chỉ sau
khi thành lập diệp lục tố ở lá cây con mới có khả năng tổng hợp hydratcarbon cho sự
phát triển của nó.
3.5.2. Giai đoạn cây con.
Ở giai đoạn này tất cả các nhu cầu cần thiết cho phản ứng quang hợp ở lan cần
phải được quan tâm. Nước và muối khoáng cần cung cấp trong môi trường nuôi cấy, ánh
sáng của bóng đèn để thay thế ánh sáng mặt trời nhưng không lớn hơn giai đoạn trưởng
thành.
3.5.3. Giai đoạn trưởng thành
Giai đoạn này cây lan ra rễ, nảy chồi, ra lá cho nên nhu cầu ánh sáng, nhiệt độ,
phân bón tăng cao hơn nhiều so với giai đoạn cây con. Đặc biệt giai đoạn này cây chuẩn
bị ra hoa nên phải càng khắt khe hơn.
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 22
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
3.5.4. Giai đoạn mang hoa, đậu trái, tạo hột.
Các nhu cầu ở giai đoạn này cũng khác giai đoạn trưởng thành. Ánh sáng và nhiệt độ
phải hạ thấp xuống để hoa lâu tàn. [6]
3.6. Phương pháp nhân giống lan.
3.6.1. Phương pháp nhân giống lan cổ truyền
3.6.1.1. Tách chiết
Đây là phương pháp được nhiều nghệ nhân sử dụng đối với các giống lan đa thân
như Cattleya, Dendrobium, Cymbidium,
3.6.1.2. Chiết cành
Việc chiết cành có thể thực hiện bất kỳ thời gian nào, thường là ở đầu thời kỳ phát
triển, vào cuối mùa khô- đầu mùa mưa. [6]
3.6.2. Phương pháp nuôi cấy mô.
Là phương pháp duy nhất hiện nay có thể nhân giống trên quy mô công nghiệp,

Ra vườn ưom
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Ngành: Công Nghệ Sinh Học
- Ta tiếp tục cấy chuyền nhiều lần sang môi trường tương tự để đạt được lượng
theo yêu cầu, mỗi lần cấy chuyền khoảng 20 ngày.
3.7.2.3. Hoàn chỉnh cây in vitro.
- Ta tiếp tục chuyển sang môi trường tăng trưởng, sau 4 tuần thì cây con bắt đầu
phát triển, tiếp tục nuôi dưỡng trong môi trường này them 1 đến 2 tháng thì cấy chuyền
trở lại trên môi trường tăng trưởng.
- Sau 3 –4 lần cấy chuyền khi cây đạt kích thước khoảng 1,5 cm thì cấy chuyền
sang môi trường ra rễ.
- Rễ sẽ phát triển sau 2 tuần nuôi cấy.
3.7.2.4. Huấn luyện.
-Khi cây đạt kích thước yêu cầu ( 3 cm trở lên) thì chuyển ra khỏi phòng lạnh
để cây quen dần với môi trường bên ngoài.
- Sau 1 tuần là có thể chuyển ra vườn ươm.
3.7.2.5. Vườn ươm
- Trồng chung trên giàn: Dùng kẹp gắp cây ra, rửa agar thật sạch, đặt nhẹ nhàng
lên rổ có xơ dừa đã được làm ẩm
- Cho vào chậu nhỏ: Sau 3-5 tháng khi mà cây đã bung rễ mới và mọc chồi mới
thì ta lấy vỏ dừa chặt khúc (đã được ngâm vôi) bao quanh rễ, rồi buộc lại cho vào chậu
nhỏ ( đường kính 12-13 cm). [7]
- Chuyển qua chậu lớn: Sau khi cây đã lớn, ra nhiều lá mới thì tiếp tục chuyển
qua chậu lớn (Đường kình 18 - 20 cm) thêm vỏ dừa và than, khi chuyển chậu một tuần
khi cây đã hồi phục mới tiến hành bón các chất dinh dưỡng.
3.7.3. Môi trường nuôi cấy
- Môi trường MS:
SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 25