Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT VŨ THỊ THU HIỀN ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA GÓP PHẦN
CHỈNH LÝ TÊN CHI (BAMBUSA SCHREB.) CHO BA LOÀI TRE
VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG NUCLEOTIDE CHO TÁM LOÀI TRE
CHƢA CÓ TÊN KHOA HỌC
(BAMBUSA SP.) Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

.TSGS. TS. Lê Xu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

3

MỞ ĐẦU
Chi tre (Bambusa Schreb.) phân bố rộng rãi khắp mọi nơi ở Việt Nam. Đây là
nguồn tài nguyên có giá trị trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, gia dụng, cảnh quan,
thực phẩm,… Lần đầu tiên vào cuối thế kỷ XIX, nhà thực vật học người Pháp Balansa

phân loại Họ phụ tre (Bambusoideae), trong đó có 607 trình tự nucleotide cho chi
Bambusa, trong số này rất nhiều loài cũng có ở Việt Nam [24], [25]. Đây là cơ sở cho
nghiên cứu này. Ở Việt Nam có khá nhiều công trình công bố về hiệu quả của việc giải
mã trình tự một số vùng gen giúp cho việc định loại tên loài ở nhiều đối tượng sinh vật
[1], [3], [12], nhưng đối với các loài tre mới chỉ có Nguyễn Minh Tâm (2006) đã sử dụng
một số chỉ thị isozyme để nhận dạng cho hai loài tre của Việt Nam. Mặc dù, kết quả thu
nhận chưa nhiều nhưng cũng là cơ sở để ứng dụng phương pháp phân tích DNA góp phần
cho nghiên cứu để chỉnh lý tên chi và đánh đa dạng nucleotide cho tám loài tre chưa có
tên khoa học (Bambusa Schreb.) ở Việt Nam.
Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Ứng dụng phƣơng
pháp phân tích DNA góp phần chỉnh lý tên chi (Bambusa Schreb.) cho ba loài tre và
đánh giá đa dạng nucleotide cho tám loài tre chƣa có tên khoa học (Bambusa sp.) ở
Việt Nam”, với các mục tiêu sau:
- Chỉnh lý tên chi cho ba loài tre: Dùng cầu hai [Bambusa (Lingnania) sp.],
Dùng phấn [Bambusa (Lingnania) chungii] và Lùng thanh hoá [Bambusa
(Lingnania) longissima] thuộc chi Bambusa hay Lingnania.
- Đánh giá mức độ đa dạng nucleotide cho 08 loài tre chưa có tên khoa học
(Bambusa sp.): Bạc mày, Mét ba vì, Mạy cượp, Mạy khô, Tre đông khê, Tre
lục bình, Tre không gai tân an và Tre trãi long an. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

6

trắng cao 5 mm. Mỗi đốt thân mang nhiều cành to gần như nhau, cỡ 4 mm. Bẹ mo hình
thang, đáy dưới rộng 21,7 cm, cao 22-27 cm, đáy trên rộng 11,2 cm, rụng sớm. Phiến mo
cụp về phía sau. Tai mo rộng 3,5 cm, cao phía trong 4 mm; mép ngoài thò dài 2 cm, cao 8
mm, có hàng lông tua dài 1 cm. Lưỡi mo nhỏ cao ở giữa, cao 1,5 mm, mép có răng cưa
thấp 0,5 mm. Phiến lá hình ngọn giáo, dài 22-24 cm, rộng 2,4-2,5 cm, đầu nhọn, gốc tròn
hay tim lệch. Tai một bên to (rộng 4 mm) mang 9 lông dài 1,1 cm; một bên nhỏ rất thấp,
mang 7 lông, dài 1 cm. Cuống lá dài 2 mm, rộng 2 mm. Măng tháng 6-8 [10].
b) Dùng phấn (Bambusa (Lingnania) chungii Mc Clure)
Thân ngầm dạng củ, mọc cụm thưa, thân khí sinh đứng thẳng, ngọn hơi cong, cao
5-10 (18) m, đường kính 3-5 (7) cm. Lóng dài 30-45(100) cm, vách dày 3-5 mm, khi non
phủ dày phấn sáp màu trắng, nhẵn. Vòng thân phẳng. Mo thân có bẹ mo hình thang, cao
30-35 cm, đáy dưới rộng 23-26 cm, cao 27-30 cm; đáy trên rộng 5,5-6,5 cm, hai đầu nhô
cao; mỏng, cứng; màu vàng nhạt. Tai mo hình dải hẹp; mép có lông mi màu nhạt, dài
mảnh và có ánh bóng. Lưỡi mo cao 1,5 mm. Phiến mo hình lưỡi mác hay trứng; đầu
nhọn, mép cuộn vào trong; gốc hình tròn thu hẹp; đáy rộng bằng khoảng 1/5 đầu bẹ mo
(dài 2,5-3 cm, cao 9-12 cm); màu lục-vàng nhạt. Tai mo cao 2-3 mm, dài 2-2,5 cm; mép
có hàng lông thô cứng, cao 1,2 cm; mặt trong có lông mềm dày. Sự phân cành bắt đầu từ
phía trên cao thân, khoảng đốt thứ 8 trở lên; ít hay nhiều cành, mọc cụm, kích thước gần
bằng nhau, nhẵn, có phủ sáp. Dùng phấn khác với các loài tre khác, mỗi đốt mang nhiều
cành phát triển từ 1 gốc giống như Nứa. Phiến lá hình lưỡi mác đến lưỡi mác dài, khi già
hình dải, dài 10-16 (20) cm, rộng 1-2 cm, hai bên gốc không đối xứng, đầu nhọn, gốc tròn
hay gần tròn, khá dày; mặt trên nháp, phần trên có lông; mặt dưới khi non phủ lông nhỏ,
khi già nhẵn; gân cấp 2 có 5-6 đôi. Thìa lìa 1 mm. Tai thấp, có lông cứng thưa, 5-6 cái,
dài 1,5 cm. Bẹ lá nhẵn. Măng vào mùa thu [10].
c) Lùng thanh hoá (Bambusa (Lingnania) longissima)
Thân ngầm mọc cụm dày, thân khí sinh đứng thẳng hay hơi cong; cao 10-20 m,

mặt dưới màu xanh nhạt; gân thứ cấp 9-10; gân ngang nhỏ không rõ; mép có răng và
lông. Bẹ lá màu vàng. Tai lá cong hình lưỡi liềm, dài 3-5 mm. Thìa lìa cao 1mm. Mùa
măng tháng 7-9 [10].
b) Mạy cượp (Bambusa sp.)
Thân ngầm mọc cụm dày, 20-30 cây trong một bụi, cây mọc sát nhau. Thân khí
sinh cao 8-10 m, đường kính 8-10 cm, không được thẳng, hơi uốn cong. Lóng dài 34-38
(50) cm, vách dày 2-3 cm; khi non có lông màu hơi bạc; vòng đốt nổi, có vòng tròn. Phân
cành ngay từ gốc thân; mỗi đốt có 1 cành to và nhiều cành nhỏ, các cành dài rủ xuống.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

8

Bẹ mo hình thang, cao 12-25 cm, ở các đoạn thân phía trên có đáy dưới rộng 30-36 cm,
cao 14-18 cm; đáy trên hơi lõm, rộng 7-10 cm; mặt ngoài có lông thưa màu nâu đen. Tai
mo rộng 3-3,5 cm, cao 2-2,5 cm; mép lượn sóng, có lông cứng dài 6 mm, thưa. Thìa lìa
cao 6 mm, có lông cứng dài 3 mm, khi rụng còn lại như răng cưa. Phiến mo đáy rộng 3-
3,3 cm, cao 5-5,6 cm, mặt trong có lông. Phiến lá hình mũi giáo, dài 23-30 cm, rộng 4,5-
4,8 cm; gốc tù. Bẹ lá cao 1 mm, có lông dài 4 mm, thưa, sớm rụng. Cuống là dài 2-3 mm.
c) Mạy khô (Bambusa sp.)
Thân ngầm mọc cụm thưa, thân khí sinh cao 13-15 m, đường kính 4-5 (7) cm; lóng
dài 20-25 cm, tròn đều, vách dày 2-3 cm. Phân cành ngay từ gốc: mỗi đốt có 1 cành to và
nhiều cành nhỏ, nhiều cành nhỏ mọc dày bao quanh thân cây. Bẹ mo hình thuôn đứng
hay hình thang cao 25-32 cm, 2 mép mỏng, có gân mịn và dày, đáy dưới hơi lượn sóng,
đáy trên nhỏ cao ở giữa và hơi lõm ở ngoài; mặt ngoài có lông màu đen, thưa, sớm rụng.
Đoạn thân phía trên các bẹ mo có đáy dưới rộng 29-30 cm, cao 20-21 cm, đáy trên rộng
15-17 cm; đoạn thân phía dưới bẹ mo có đáy dưới rộng 22-26 cm, cao 11-14 cm, đáy trên
rộng 12-13 cm, tai mo một bên xuôi xuống và nhô ra ngoài; một tai đứng, rộng 3 cm và
cao 2 cm, có lông dày dài đến 2 mm, thìa lìa cao 4 mm; có lông mịn và thấp, dài 1 mm.
Phiến mo ở đoạn thân phía trên có đáy rộng 1,5 cm, cao 4 cm; có lông thưa, ngắn; ở đoạn
thân phía dưới có đáy rộng 3 cm, cao 1,2 cm; có lông thưa dày, dài đến 6 mm. Phiến lá

cm; đầu có mũi nhọn dài, đáy hơi lõm; mặt trong phía dưới có lông dày, màu nâu bạc.
Phiến lá hình dải, thuôn dài, dài 22-24 cm, rộng 2-2,4 (4) cm; gốc nhọn và lệch; gân lá 6-
7 đôi; mặt dưới nhiều lông nhung màu bạc; mặt trên lông thưa hơn. Tai lá rộng 2-3 mm,
cao 1 mm; có nhiều lông dài đến 3 mm, cứng, thưa. Thìa lìa cao đến 1 mm, có lông mịn.
Bẹ lá có gân chính nổi rõ và nhiều lông mịn màu nâu. Mùa măng tháng 8-9; măng có
màu bạc-đỏ, nhiều phấn trắng dày đặc [10].
f) Tre không gai tân an (Bambusa sp.)
Thân ngầm mọc cụm dày đặc, thân khí sinh cao 8-12 m, đường kính 5-5,5 cm,
đứng thẳng. Lóng dài 28-33 (45) cm, tròn đều; khi non màu xanh thẫm, khi già mẫu xanh
xám; vách dày 5-7 mm; vòng đốt nổi. Phân cành với mỗi đốt 1 cành to, dài, vươn cao, gốc
cành có rễ khí sinh; nhiều cành nhỏ. Bẹ mo hình chuông rộng, cao 18-20 cm, có đáy dưới
rộng 22-23 (28) cm, cao 15-18 (35) cm, đáy trên rộng 3-3,5 (5) cm; ở đoạn thân phía trên,
bẹ mo có đáy dưới nhỏ hơn (chỉ rộng 16-22 cm), nhưng cao hơn (cao 22-23 cm), đáy trên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

10

cũng lớn hơn (rộng 4-5,5 cm); mặt ngoài có lông màu đen, thưa. Tai mo lõm, có lông tua
dài. Thìa lìa cao đến 3 mm, có lông tua cứng. Phiến mo ở đoạn thân phía dưới đáy rộng
1,2-2 cm, cao 4-7 cm; ở đoạn thân phía trên rộng 2,5-3 cm, cao 12-16 cm. Phiến lá dài 9-11 (15)
cm, rộng 1,8-2 cm; gốc tròn hay hình nêm, hơi cắt ngang; mép có răng cưa nhỏ; gân 5-6
đôi. Tai lá có lông ngắn, màu trắng. Thìa lìa ngắn, có lông dài. Cuống lá dài 1-2 mm [10].
g) Tre lục bình (Bambusa sp.)
Thân ngầm mọc cụm dày đặc, thân khí sinh cao 5-7 m đường kính 3-4,5 cm. Lóng
dài 30-32 cm, tròn đều; khi non hình chữ chi (Zic zắc), màu xanh, nhẵn bóng; vách mỏng,
dày 3-5 mm; vòng đốt hơi nổi. Phân cành với đốt có 1 cành to và 2 hay nhiều cành nhỏ.
Bẹ mo hình thang cao, cao 15-20 cm, đoạn thân phía dưới bẹ mo có đáy dưới rộng 12-
15(17) cm, cao 11-12 (23) cm, đáy trên rộng 4-4,5 (7) cm; đoạn thân phía trên bẹ mo có
đáy dưới rộng 13-15 cm, cao 22-24 cm, đáy trên rộng 6-6,5 cm. Tai mo rộng 2-4 mm, cao
3-10 mm. Thìa lìa cao 1-2 mm; lông tua dài, thưa. Phiến mo đáy rộng 3-3,5 cm, cao 4,5-8

thuộc chi Bambusa hay Lingnania, bởi chúng đều có một số đặc điểm hình thái giống với
cả hai chi, mà cơ quan sinh sản lại chưa bắt gặp. Vì vậy cần có sự hỗ trợ của phân tích DNA.
- Các loài tre chưa có tên khoa học: Vì chưa bắt gặp được cơ quan sinh sản nên ở
chi tre có tới 37 loài chưa có tên khoa học [10]. Trong số đó có 8 loài được lựa chọn cho
nghiên cứu này đó là: Bạc mày, Mét ba vì, Mạy cượp, Mạy khô, Tre đông khê, Tre lục
bình, Tre không gai tân an và Tre trãi long an. Tám loài tre này vẫn chưa có tên khoa học
và đều thuộc chi Bambusa.
1.3. Giới thiệu một số phƣơng pháp phân loại học thực vật
- Phương pháp phân loại bằng đặc điểm hình thái (Morphology): Đây là phương
pháp truyền thống được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu phân loại học, tiến hoá và giám
định sinh vật. Phương pháp chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái của các cơ quan và cơ
thể, đặc biệt là cơ quan sinh sản. Phương pháp phân loại bằng hình thái đòi hỏi mẫu vật
phải có đầy đủ các đặc điểm phân loại. Tuy nhiên trong thực tế mẫu vật thu được không
phải luôn luôn thỏa mãn yêu cầu trên, trong một số trường hợp, phương pháp phân loại bằng
hình thái khó thực hiện hoặc nhầm lẫn do mẫu mang đặc điểm trung gian hoặc đồng hình.
- Phương pháp phân loại bằng hoá học (Chemitaxonomy): Phương pháp xây
dựng trên cơ sở nghiên cứu tiến hoá học của các taxon thực vật. Tiến hành phân loại hoặc
định loại dựa trên một số phương pháp như sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí khối phổ và sắc
ký lỏng cao áp. Việc định loại hoặc giám định loài dựa vào dấu vân hoá học (chemical
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

12

fingerprint), thực chất đấy là tổ hợp các hợp chất điển hình cho mỗi loài và có đặc điểm ít
biến động. Ưu điểm của phương pháp này là cho kết quả nhanh, chính xác và có thể cho
biết thêm các số liệu về thành phần hoá học. Phương pháp không yêu cầu tính nguyên vẹn
của mẫu vật. Đây là phương pháp đang được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới. Ở nước
ta, phương pháp này mới chỉ được bắt đầu nghiên cứu ở một vài cơ sở. Tuy nhiên, do
thành phần hoá học thường biến động theo tuổi, thời vụ và điều kiện môi trường, nên đòi
hỏi người nghiên cứu cần có kiến thức rộng trên một số lĩnh vực.

vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại và mức độ
tiến hoá của nhiều loài động thực vật và vi sinh vật. So với chỉ thị hình thái thì chỉ thị
DNA cho độ chính xác cao mà không lệ thuộc vào bất cứ yếu tố khách quan nào. Hiện
nay, ở Việt Nam phương pháp đang được sử dụng trong nghiên cứu phân loại, định loại,
tiến hóa,… trên nhiều đối tượng sinh vật ở Viện Công nghệ sinh học, Viện Sinh thái và
Tài nguyên sinh vật, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam,…
1.4. Hệ gen sử dụng trong nghiên cứu phân loại phân tử ở thực vật
1.4.1. Một số vùng gen thuộc hệ gen lục lạp
Hệ gen lục lạp (cpDNA) là một phân tử DNA vòng, sợi đơn, mỗi gen thường
không lặp lại, có kích thước từ 120 kb - 220 kb. Không giống như các gen nhân, các gen
lục lạp chỉ mã hoá các protein cần thiết cho chức năng quang hợp. Hệ gen lục lạp thường
được sử dụng cho nghiên cứu phân loại ở thực vật do đặc tính di truyền theo dòng mẹ,
không bị tái tổ hợp di truyền cho thế hệ sau và rất bảo thủ [34].

Hình 1.1. Hệ gen lục lạp của cây Arabidopsis thaliana [34]
Hệ gen lục lạp được đánh giá là sự tích lũy các đột biến theo thời gian, nên phản
ánh đúng mức độ tiến hóa của loài. Các gen lục lạp có tốc độ đột biến thấp hơn từ 4-5 lần
so với gen trong nhân, nhưng nhanh hơn khoảng ba lần so với DNA ty thể thực vật và
Vùng
gen
nghiên
cứu
Vùng
gen

Vùng ITS (internal transcribed spacer) của gen mã hoá cho ribosome nhân gồm
các đơn vị gen 18S, 5,8S và 26S (Hình 1.2). Giữa các đơn vị gen có các đoạn ITS-1 và
ITS-2, các thành phần này tạo thành một nhóm gen cơ bản. Các nhóm gen như vậy lặp lại
liên tục trong hàng nghìn bản sao trong hệ gen nhân và chúng được ngăn cách bởi vùng
NTS (nontranscribed spacer) (Hình 1.2).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

15

Trong các nghiên cứu phân loại ở mức độ loài, vùng ITS đã được các nhà nghiên
cứu kiến nghị làm vùng DNA barcode cho nhiều loài thực vật [14], [16], [17]. Ở mức độ
loài, vùng ITS có mức độ đa dạng cao (khoảng 13,6% giữa các loài gần gũi), nhưng lại có
mức độ biến đổi thấp bên trong loài [17]. Với sự hiện diện của trên 70.000 trình tự ITS
được công bố trên ngân hàng Genbank năm 2011 đây là nguồn tư liệu có giá trị, mở ra
những triển vọng lớn cho nghiên cứu phân loại và giám định. Hình 1.2. Sơ đồ vùng gen ITS
- Gen PIF (P instability factor): PIF - like transposable elements là đoạn DNA có
khả năng di chuyển độc lập ngay trong nội bộ một thể nhiễm sắc hoặc từ thể nhiễm sắc
này sang thể nhiễm sắc khác, còn gọi là gen nhảy (transposon). Gen nhảy lần đầu tiên
được Barbara McKlintock (1941) phát hiện nghiên cứu ở cây ngô từ những năm 40 của
thế kỷ XX, nhưng mãi đến những năm 70 - 80 với sự tiến bộ của kỹ thuật phân tích di
truyền người ta mới hiểu rõ được cấu trúc và cơ chế hoạt động của transposon.
Transposon được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm, thực vật, động vật và con người. Chúng rất đa
dạng về độ lớn và cơ chế hoạt động, nhưng đều có điểm chung là được xếp xen kẽ vào hệ
gen và sử dụng enzym transposaza để di chuyển từ vị trí này sang vị trí khác của phân tử

nhiều công bố về mối quan hệ chủng loại và nhận dạng loài. Chẳng hạn, Sun và cộng sự
(2005) đã sử dụng trình tự nucleotide DNA vùng ITS nhân để nghiên cứu 21 loài tre
thuộc các chi Bambusa, Dendrocalamopsis, Dendrocalamus, Guadua, Leleba và
Lingnania, từ các kết quả thu nhận đã giải quyết được mối quan hệ di truyền của một số
loài thuộc chi Bambusa (B. subaequalis, B. multiplex, B. emeiensis, B. chungii, B.
contracta, B. hainanensis, B. flexuosa, B. sinospinosa, B. tuldoides, B. surrecta, B.
intermedia và B. valida) [38]. Tương tự, Yang và cộng sự (2007) cũng đã xác định trình
tự nucleotide gen GBSSI và trnL cho 53 loài cần chỉnh lý tên chi (Schizostachyum,
Cephalostachyum, Dinochloa, Leptocanna, Melocanna, Melocalamus và
Pseudostachyum), thông qua kết quả so sánh trình tự nucleotide các tác giả đã đề nghị
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

17

chuyển loài C. virgatum và loài C. pergracile về chi Schizostachyum; Melocanna và
Pseudostachyum là những chi độc lập [43]. Năm 2009, Wu và cộng sự đã công bố trình tự
hệ gen lục lạp đầy đủ của 2 loài tre là Dendrocalamus latiflorus và Bambusa oldhamii,
với kích thước tương ứng là 139.350 bp và 139.365 bp [25], [42]. Yang và cộng sự (2010)
đã sử dụng 01 vùng gen nhân (GBSSI) và ba vùng gen lục lạp (psbA-trnH, rpl32-trnL và
rps16 intron) để xác định trình tự nucleotide và lập cây phát sinh chủng loại cho 64 loài
thuộc tông phụ tre. Kết quả xác định trình tự bốn vùng gen, các tác giả đã đề nghị chuyển
loài D. rongchengensis về chi Bambusa, ngược lại các tác giả lại không đồng ý quan điểm
của Staleton và Xia (1996) là chuyển loài D. membranaceus về chi Bambusa [37]. Hay
Zhou và cộng sự (2010) cũng đã làm rõ mối quan hệ di truyền các loài tre thuộc các chi
Guaduinae, Shibataceae, Arudinarieae, Bambusinae, Melocananinae và Chusqueeae trên
cơ sở xác định trình tự vùng gen PIF. Tương tự, Goh và cộng sự (2010) đã xác định trình
tự nucleotide vùng gen nhân GBSSI và bốn vùng gen lục lạp (rps16-trnQ; trnC-rpoB;
trnH-psbA; trnD-trnT) để nghiên cứu mối quan hệ di truyền gần gũi giữa các loài tre
(climbing bamboos) ở Đông Nam Á với các loài trong chi Bambusa [21].
Trong nước: Các nghiên cứu về đa dạng di truyền phục vụ công tác bảo tồn đa

được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Nguồn gốc, ký hiệu mẫu và một số đặc điểm hình thái của 11 loài tre sử dụng
trong nghiên cứu
Tên
loài
Tên khoa
học
Ký hiệu
Mã hiệu
mẫu*
Địa điểm thu mẫu
Đặc điểm hình thái
Các loài chỉnh lý tên chi: gồm 3 loài
Dùng
cầu
hai
Bambusa
(Lingnania)
sp.
K3001/2
VNMN B000197
Cầu Hai, Phú Thọ
Mỗi đốt thân có rất
nhiều cành chính,
phiến mo ngửa giáp
xuống thân hoặc ngửa
gần sát xuống thân.
K3001/8
VNMN B000201
Đồng Hỷ, Thái Nguyên

VNMN B000218
Quỳ Châu, Nghệ An
Mỗi đốt thân có rất
nhiều cành chính,
phiến mo có hai dạng:
ngửa sát xuống hoặc
ngửa gần sát xuống thân
K3003/10
VNMN B000221
Thuận Châu, Sơn La
K3003/14
VNMN B000222
Ba Bể, Bắc Kạn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

19

Các loài chƣa xác định tên khoa học dạng Bambusa sp.: gồm 8 loài
Bạc
mày
Bambusa sp.
K3004/1
VNMN B000223
Cầu Hai, Phú Thọ
Thân khí sinh cao 13-
18 m, đường kính 13-
15 cm, ngọn hơi cong
xuống, lóng hơi uốn
khúc, bẹ mo hình thang.
K3004/2

10 cm, không được
thẳng, hơi uốn cong,
bẹ mo hình thang.
K3009/2
VNMN B000262
Khuổi Chám, Kim
Bình, Tuyên Quang
K3009/5
VNMN B000265
Bó Củng, Kim
Bình, Tuyên Quang
Mạy
khô
Bambusa sp.
K3010/5
VNMN B000267
Bản Nà Nghè,
Mường Phăng, Điện
Biên
Thân khí sinh cao 13-
15 m, đường kính 4-5
(7) cm; lóng dài 20-
25 cm, tròn đều, vách
dày 2-3 cm, bẹ mo hình
thuôn đứng hay hình thang.
K3010/8
VNMN B000270
Chiềng An, Thanh
An, Điện Biên
K3010/9

Tân Thạnh, Long An
Thân khí sinh cao 5-7
m đường kính 3-4,5
cm, bẹ mo hình thang cao.
K3013/5
VNMN B000283
Cao Lãnh, Đồng Tháp
K3013/6
VNMN B000284
Châu Thành, Tiền Giang
Tre
không
gai
tân an
Bambusa sp.
K3014/2
VNMN B000285
Tân Thạnh, Long An
Thân khí sinh cao 8-
12 m, đường kính 5-
5,5 cm, đứng thẳng,
bẹ mo hình chuông rộng.
K3014/5
VNMN B000286
Mỹ Xuyên, Sóc Trăng
K3014/8
VNMN B000288
Bình Thuỷ, Cần Thơ
Tre
trãi

cặp mồi
Trình tự nucleotide (5’– 3’)
Kích
thƣớc
lý
thuyết
(bp)
Nhiệt
độ bắt
cặp
(Tm)
C
Nguồn gốc
tổng hợp cặp
mồi
ITS
(PIF)
PIF5/
PIF3
GGGGCTTTGGATGGAACACA
ATGGCGAGGTTGAACAACTC
450
50
Zhou et al.,
(2010)
trnL-
trnF
trnLF/
trnFR
CGAAATCGGTAGACGCTACG

rpoC2F2/
rpoC2R2
TGTTTGGGGATTTCTATTGA
TCTTTTGTTCCTTGATGCTC
600
52
Thiết kế dựa
vào trình tự
nucleotide loài
Bambusa
oldhamii mã
số FJ970915
Genbank (2011)

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu bao gồm: Hóa chất tách chiết và tinh sạch
DNA (CTAB, EDTA, Tris-HCl, Isopropanol, ethanol, ARNase, chloroform, Kit tinh sạch
genomic tổng số, Kit phân tích PCR, Kit tinh sạch sản phẩm PCR, đệm TAE, agarose, TE
là của các hãng Fermentas, Biobasis, QIAGEN,
Các thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: Các thiết bị chính sử dụng trong thí nghiệm: Máy PCR System 9700
(Applied Biosystem, Mỹ), máy ly tâm của hãng Hitachi (Nhật Bản), bộ điện di
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

21

Nytechnich (Anh), máy chụp ảnh gel (Cleaver, Đức), máy ổn nhiệt (Memmert, Đức). Xác
định trình tự trên máy ABI PRISM
®
3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems), …
Dụng cụ: Cối, chày sứ, thìa vô trùng, giấy thấm vô trùng, ống eppendorf, đầu côn

trình tự nucleotide loài Bambusa oldhamii mã số FJ970915 trên ngân hàng Genbank. Quá
trình thiết kế cặp mồi được thực hiện trên phần mềm DNAstar.
2.4.3. Phương pháp nhân bản PCR
Nhân bản PCR và đọc trình tự: Mỗi phản ứng PCR có thể tích 25µl với các thành
phần: 13 µl H
2
O deion; 2,5 µl buffer 10X; 1 µl MgCl
2
25mM; 2,5 µl dNTPs 2,5mM; 1,25
µl mồi xuôi (10 pmol); 1,25 µl mồi ngược (10 pmol); 0,5 µl Taq polymerase (5U/µl); 3 µl
DNA. Phản ứng được thực hiện trên máy PCR model 9700 (GeneAmp PCR System 9700,
Mỹ). Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gồm: 94C trong 3 phút; 35 chu kỳ nối tiếp nhau
với các bước: 94C trong 50 giây, 50 đến 55C trong 55 giây (nhiệt độ bắt cặp của từng
cặp mồi như trong bảng 1), 72C trong 45 giây; kết thúc phản ứng nhân gen ở 72C trong
10 phút, giữ sản phẩm ở 4C.
2.4.4. Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR
Tinh sạch sản phẩm PCR là bước quan trọng để thực hiện phản ứng giải trình tự.
Quá trình tinh sạch nhằm thu được sản phẩm đoạn gen mong muốn. Sản phẩm PCR được
điện di trên gel agarose 0,9%, cắt lấy phân đoạn DNA quan tâm trên bàn soi UV và tinh
sạch bằng bộ KIT QIAquick Gel Extraction của QIAGEN. Kiểm tra sản phẩm thu được
trên gel agarose 0,9%. Chụp ảnh sản phẩm thôi gel và xác định hàm lượng DNA để gửi đi
xác định trình tự.
2.4.5. Xác định trình tự nucleotide các đoạn DNA
Trình tự nucleotide được xác định bằng kỹ thuật xác định trình tự trực tiếp từ sản
phẩm PCR theo hai chiều (mồi xuôi và mồi ngược) trên máy đọc trình tự ABI PRIMS
®

3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) tại phòng thí nghiệm trọng điểm
công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học.
2.4.6. Phân tích số liệu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

24

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả tách chiết và làm sạch DNA tổng số từ các mẫu tre
Đã tách chiết và làm sạch DNA tổng số của 33 mẫu lá và thân đại diện cho 11 loài
tre nghiên cứu. Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 0,9% tại hình 3.1A
cho thấy chất lượng DNA tương đối sạch. Kết quả đo OD cũng cho thấy chỉ số
OD260/OD280 của các mẫu luôn nằm trong khoảng 1,8 đến 2 (dung dịch DNA có độ
sạch rất cao). Để phản ứng PCR có độ nhạy cao, đảm bảo kết quả xác định trình tự
nucleotide được chính xác chúng tôi đã tiến hành tinh sạch DNA tổng số bằng bộ KIT
tinh sạch DNA (DNA Purification Kit) (Hình 3.1B).

Hình 3.1. Kết quả kiểm tra DNA tổng số (A) và DNA tinh sạch (B) đại diện của 11 loài
tre trên gel agarose 0,9% (giếng 1: Bạc mày; 2: Mét ba vì; 3: Mạy cượp; 4: Mạy khô; 5:
Tre đông khê; 6: Tre lục bình; 7: Tre không gai tân an; 8: Tre trãi long an; 9: Dùng cầu
hai, 10: Dùng phấn; 11: Lùng thanh hoá)
3.2. Kết quả nhân bản trình tự DNA của 11 loài tre nghiên cứu với các vùng gen đích
Tổng số năm cặp mồi đặc hiệu đã được sử dụng và nhân bản thành công năm đoạn
gen đích, trong đó cặp mồi PIF5/PIF3 dùng để nhân bản vùng gen nhân và 04 cặp mồi

Hình 3.2. Sản phẩm PCR đại diện của 11 loài tre phân tích với cặp mồi PIF5/PIF3 điện
di trên gel agarose 0,9%. (M: marker phân tử 1 kb, từ giếng 1 đến 11 đại diện cho 11 loài
tre (1mẫu/loài), thứ tự các loài đại diện như trong hình 3.1)
3.2.2. Kết quả nhân bản trình tự DNA của 11 loài tre với cặp mồi psbA3’f/trnH
Vùng psbA – trnH đã được chứng minh là vùng dễ thực hiện phản ứng PCR nhất
đối với rất nhiều loài thực vật [35]. Do có một vùng không mã hoá nên kích thước của
vùng psbA - trnH cũng thay đổi khác nhau giữa các loài. Vùng này có kích thước biến đổi
trong một giới hạn rất lớn, từ 247bp đến 1221bp [27]. Cặp mồi psbA3’f/trnH đã được sử
dụng để nhân bản đoạn DNA cho tất cả 11 loài tre nghiên cứu. Kết quả cho thấy sản phẩm
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M
0.25 kb
0.5 kb