Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(2): 243-253, 2007

243
NUÔI CẤY TẾ BÀO VÀ TÁI TẠO MÔ SẸO TỪ HUYỀN PHÙ TẾ BÀO CÂY THÔNG ĐỎ
HYMALAYA (THÔNG ĐỎ LÂM ĐỒNG) (Taxus wallichiana Zucc.)

Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Trịnh Đôn, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Đinh Văn Khiêm, Phan Xuân Huyên
Phân viện sinh học tại Đà lạt
TÓM TẮT
Thông đỏ Taxus wallichiana là loài cây trong vỏ có chứa nhiều Taxol, được dùng để chữa ung
thư buồng trứng và ung thư vú. Đây cũng là loài thực vật rất khó nuôi trồng. Trong nghiên cứu này,
chúng tôi thiết lập điều kiện tạo huyền phù tế bào và tái tạo mô sẹo T. wallichiana. Điều kiện tốt để
khởi tạo huyền phù tế bào là môi trường B5 cơ bản có bổ sung 20% nước dừa tươi, 60 g/L sucrose,
4 mg/L 2,4-D và 1mg/L kinetin. Tuy nhiên, môi trường này không thích hợp cho sự tăng trưởng mô
sẹo. Tế bào nuôi cấy tăng trưởng tốt trong 24 ngày khảo sát, trong đó tám ngày đầu là giai đoạn
phát triển chậm (phase lag). Chúng tôi thu tế bào từ huyền phù nuôi cấy vào nhiều thời điểm và trải
lên các môi trường thạch khác nhau để khảo sát sự hình thành mô sẹo. Mô sẹo tái tạo tốt nhất là từ
huyền phù 25 ngày trải lên môi trường thạch B5 cơ bản có bổ sung 4 mg/L 2,4-D, 1 mg/L kinetin,
20 g/L sucrose và nuôi cấy trong điều kiện tối. Tế bào và mô sẹo thu được từ nghiên cứu này là
nguyên liệu cho nuôi cấy trên quy mô lớn, đồng thời phục vụ việc tách chiết và định lượng taxoid.
Từ khóa: Mô sẹo, huyền phù tế bào, Taxol, Taxus wallichiana Zucc.
TỔNG QUAN
Thông đỏ (Taxus) là một chi gồm nhiều loài
phân bố ở các vùng ôn đới của bắc bán cầu. Trong
những thập niên gần đây, thông đỏ được coi là một
nguồn dược liệu quan trọng sau việc khám phá một
hợp chất diterpene amide chống ung thư mới với tên
thương mại là “Taxol” từ vỏ cây thông đỏ Thái Bình
Dương (Taxus brevifolia) (Wani et al., 1971;
Edgington 1991). Hợp chất này còn được gọi là
paclitaxel, hay tên đầy đủ theo IUPAC (Liên đoàn

như các nghiên cứu sự nảy mầm của phôi T. baccata,
đặc biệt chú trọng đến việc khảo sát sự ngủ của hạt
(Lepage-Degivry, 1973; Lepage-Degivry và Garello,
1973), các phương pháp nuôi cấy phôi để giảm thời
gian ngủ của hạt T. brevifolia (Flores và Sgrignoli,
1991; Chee, 1994), và phương pháp nuôi cấy đoạn
cắt thân để tạo cây con T. brevifolia (Eccher, 1988;
Chee 1994). Đã có nhiều báo cáo về các phương
pháp sản xuất Taxol từ mô Taxus spp. trong nuôi cấy
mô sẹo và huyền phù tế bào (Fett-Neto et al., 1992;
Wickremesinhe và Arteca, 1994). Để tăng hàm
lượng các hợp chất thứ cấp, các nhà khoa học cũng
nghiên cứu việc bổ sung các hợp chất kích thích
(elicitor) (Christen et al., 1991; Zhong et al., 1995)
hay các tiền chất của paclitaxel như kalium acetate,
mevalonolactone, glucose, leucine và phenylalanine
(Strobel et al., 1992; Fett-Neto et al., 1994; Shuler et
Duong Tan Nhut et al.

244
al., 1994) vào môi trường. Phương pháp nuôi cấy
lỏng đã cho thấy nhiều ưu thế vượt trội trong việc
thu nhận tế bào so với phương pháp nuôi cấy trên
môi trường thạch truyền thống vì nó cho phép việc
tối ưu hóa tốc độ tăng trưởng, cho phép thu nhận tế
bào bằng cách lọc, và quan trọng là tế bào trong nuôi
cấy lỏng vẫn giữ được khả năng phát triển thành mô
sẹo (Phillips et al., 1996). Nuôi cấy tế bào trong các
bình phản ứng sinh học (bioreactor) cũng đã được
thực hiện để thu một lượng lớn sinh khối và Taxol

hiệu là C3, là môi trường B5 cơ bản (Gamborg et al.,
1968) có bổ sung 4 mg/L 2,4-D (acid 2,4-
dichlorophenoxyacetic) và 1 mg/L kinetin. Mô sẹo
tạo thành được tiếp tục duy trì trên cùng môi trường
dưới ánh sáng cường độ 45 μmol/m
2
/s (12 giờ chiếu
sáng/ngày) và sử dụng làm mẫu cấy tiếp theo.
Môi trường và điều kiện thí nghiệm
Môi trường với các thành phần khoáng và
vitamin B5 được dùng làm môi trường cơ bản cho tất
cả các thí nghiệm. Ảnh hưởng của 2,4-d, kinetin,
nước dừa tươi và sucrose được khảo sát bằng cách
bổ sung các thành phần này vào môi trường với các
nồng độ khác nhau (Bảng 1). Môi trường được làm
rắn với 9 g/L thạch (Agar Hải Phòng). Chúng tôi
dùng bình nuôi cấy 250 mL (40 mL môi
trường/bình) để tạo mô sẹo, bình tam giác
Erlenmeyer 250 mL (60 mL môi trường/bình) để
nuôi cấy huyền phù, và bình 500 mL để tái tạo mô
sẹo. Môi trường được điều chỉnh pH 5,8–5,9 trước
khi hấp khử trùng ở 121
o
C, 1 atm trong 30–40 phút.

Bảng 1. Thành phần của các môi trường thí nghiệm.

Ký hiệu 2,4-D (mg/L) Kinetin (mg/L) Tỷ lệ nước dừa (theo thể tích)
C2 1 - -
C3 4 1 -

kinetin; nước dừa; điều kiện sáng (trong tối hoàn
toàn và cường độ sáng 45 mol/m
2
/s; nồng độ
sucrose (20–80 g/L). Lượng mô sẹo ban đầu là 2,30
g. Các thí nghiệm được lặp lại 4 lần. Mật độ tế bào
được ghi nhận sau hai đến ba tuần nuôi cấy.
Tăng trưởng huyền phù tế bào
Huyền phù tế bào được chuyển sang môi trường
mới (50% thể tích). Mật độ và trọng lượng tươi tế
bào trong huyền phù được ghi nhận 4 ngày/lần trong
24 ngày. Thí nghiệm được lặp lại ba lần.
Tái tạo mô sẹo từ huyền phù
Môi trường thạch bổ sung 2,4-D và kinetin được
dùng để trải 2 mL huyền phù tế bào. Sự tái tạo mô
sẹo được ghi nhận sau 1, 2, 3, và 4 tháng. Mỗi
nghiệm thức được tiến hành với 30 bình nuôi cấy.
Đo sinh khối
Trọng lượng tươi và khô của mô sẹo và tế bào
huyền phù thu bằng cách lọc qua giấy lọc được đo
bằng cân phân tích (Sartorius, Đức).
Để tính mật độ tế bào, chúng tôi trải 10 µL
huyền phù tế bào lên một lamelle úp ngược trên một
lame kính lõm. Số lượng tế bào được đếm với một
buồng đếm dưới kính hiển vi (Olympus, Hoa Kỳ)
với độ phóng đại 10 X.
Phân tích số liệu
Số liệu được phân tích bằng phương pháp kiểm
tra Duncan (Duncan, 1995).
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

chuyển qua nuôi cấy lỏng lắc (Bảng 3).

Bảng 2. Ảnh hưởng của nước dừa và ánh sáng đối với sự tăng trưởng mô sẹo của thông đỏ Lâm Đồng (Taxus
wallichiana Zucc.) sau 6 tuần nuôi cấy.

Môi trường
Sáng/tối
Trọng lượng tươi (g) Trọng lượng khô (g) Hình thái
C3 Sáng 1.25 ± 0.11a 0.12 ± 0.03a Hơi xanh, cứng, tăng trưởng chậm
C3∙CW Sáng 0.45 ± 0.12c 0.05 ± 0.02b Hơi xanh, tăng trưởng chậm
C3 Tối 1.37 ± 0.11a 0.13 ± 0.04a Hơi vàng, mềm, tăng trưởng mạnh
C3∙CW Tối 0.87 ± 0.09b 0.03 ± 0.02b Nâu, bở
Số liệu được trình bày với ± độ lệch chuẩn (SD). Ký tự giống nhau trong cùng một cột thể hiện không có sự khác biệt có ý
nghĩa theo Phương pháp kiểm tra Duncan ở mức 5% xác suất.

Duong Tan Nhut et al.

246 Hình 1. Ảnh hưởng của nước dừa và ánh sáng lên sự tăng trưởng mô sẹo: Trên môi trường C3 dưới điều kiện
sáng (a) và tối (c); và trên môi trường C3∙CW dưới điều kiện sáng (b) và tối (d).

Bảng 3. Ảnh hưởng của nguồn mô sẹo đối với sự khởi tạo huyền phù tế bào cây thông đỏ Lâm Đồng (Taxus
wallichiana Zucc.) sau 3 tuần nuôi cấy.

Nguồn mô sẹo Mật độ (tế bào/mL) Trọng lượng tươi sinh khối (mg/mL)
Nuôi cấy có ánh sáng 3.884.15 ± 114.03b 12.56 ± 1.44b
Nuôi cấy trong tối 6.421.22 ± 105.11a 21.94 ± 1.58a
Số liệu được trình bày với ± độ lệch chuẩn (SD). Ký tự giống nhau trong cùng một cột thể hiện không có sự khác biệt có ý

khoảng 1,5 lần.
Huyền phù tế bào hình thành tốt nhất trong môi
trường có 60 g/L sucrose (Hình 4). Nồng độ đường
cao hơn làm giảm sự tăng trưởng của huyền phù.
Trong giai đoạn tăng trưởng hàm mũ (phase log),
vách tế bào và tinh bột được tổng hợp mạnh bằng
nguồn carbon từ môi trường (Stepan-Sarkissian and
Grey, 1990); tuy nhiên, đường ở nồng độ cao có thể
gây stress thẩm thấu cho tế bào.

Hình 2. Ảnh hưởng của môi trường đối với mật độ tế bào huyền phù cây thông đỏ Lâm Đồng (Taxus
wallichiana Zucc.) sau 2 tuần nuôi cấy trong điều kiện sáng. Thanh sai số biểu diễn sai số chuẩn (SE).

Hình 3. Ảnh hưởng của môi trường đối với trọng lượng tươi sinh khối huyền phù tế bào cây thông đỏ Lâm
Đồng (Taxus wallichiana Zucc.) sau 2 tuần nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng. Thanh sai số biểu diễn sai số