BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN
TRẦN MINH ĐỊNH
NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN SỰ GẮN CHÈN GENE
E6 VÀ E7 CỦA Human papilomavirus TYPE 16 VÀO
BỘ GENE NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT
MULTIPLEX RT-PCR LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN
Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất kỳ
một công trình nào khác.
Người cam ñoan
Trần Minh Định
ii
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn tất khóa luận này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu
sắc tới:
Lãnh ñạo trường Đại học Tây Nguyên, các phòng ban và khoa chức năng
ñã tổ chức Đào tạo, quản lý và tạo ñiều kiện thuận cho tôi hoàn tất khóa học và
luận văn. Các Thầy, Cô giáo trong và ngoài trường ñã nhiệt tình giảng dạy và
cung cấp những kiến thức quý báu trong suốt khóa học.
TS. Võ Thị Phương Khanh, người luôn quan tâm, nhiệt tình hướng dẫn và
tạo mọi ñiều kiện thuận lợi ñể tôi hoàn thành khóa luận.
PGS. TS Nguyễn Anh Dũng ñã có những trao ñổi quý báu và tạo ñiều
kiện thuận lợi ñể tôi hoàn thành khóa luận.
Bộ môn SHTN, Bộ môn Sinh học thực vật và Phòng thí nghiệm
CNSH&MT là các ñơn vị ñã tạo ñiều kiện thuận lợi ñể tôi thực hiện và hoàn tất
khóa luận.
Các anh, chị và các bạn học viên lớp Cao học SHTNK3; ñã luôn quan
tâm, chia sẻ và ñộng viên tôi trong suốt khóa học cũng như suốt thời gian thực
hiện khoa luận. Đặc biệt là bạn Hưng (Công ty CP TBR) ñã nhiệt tình và có
những trao ñổi quý báu trong quá trình thực hiện ñề tài; phòng Dịch vụ, Công ty
1.2.2. Các type của Human papillomavirus 4
1.2.3. Bộ gen của virus HPV type 16 5
1.2.4. Sự xâm nhiễm về mặt phân tử - hiện tượng chèn gen của virus HPV
nguy cơ cao vào bộ gen người 6
1.2.5. Tình hình nghiên cứu gắn chèn gen E6 và E7 của HPV vào bộ gen
người hiện nay 9
1.3. Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới và Việt Nam 11
1.3.1. Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới 11
1.3.2. Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung tại Việt Nam 12
1.4. Các phương pháp phổ biến chuẩn ñoán ung thư cổ tử cung hiện nay 13
1.4.1. Chẩn ñoán lâm sàng 13
1.4.2. Các phương pháp chẩn ñoán dựa trên tế bào cổ tử cung 14
1.4.3. Các phương pháp chuẩn ñoán tác nhân HPV gây ung thư cổ tử cung 15
1.5. Phương pháp RT – PCR trong chuẩn ñoán gắn chèn gen gây ung thư cổ
tử cung 19
1.6. Các phương pháp ñiều trị tổn thương tiền ung thư và ung thư cổ tử cung 20
1.6.1. Điều trị tổn thương tiền ung thư cổ tử cung 20
1.6.2. Điều trị ung thư cổ tử cung 21
v
1.7. Các loại vaccine phòng HPV hiện nay 21
Phần II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
2.1. Nội dung nghiên cứu 23
2.2. Địa ñiểm và thời gian nghiên cứu 23
2.2.1. Địa ñiểm nghiên cứu 23
2.2.2. Thời gian nghiên cứu 23
2.3. Vật liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 23
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu 24
2.3.2. Hoá chất nghiên cứu 25
2.3.3. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 27
2.3.3.1. Dụng cụ nghiên cứu 27
3.1. Nghiên cứu thiết kế và kiểm tra mồi khuếch ñại ñặc hiệu gen E6 và E7
của HPV type 16 41
3.1.1. Thiết kế và kiểm tra mồi 41
3.1.2. Đánh giá khả năng khuếch ñại của hệ mồi thiết kế 44
3.1.3. Giải trình tự kiểm tra sản phẩm khuếch ñại 45
3.2. Xây dựng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16
vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR 47
3.2.1. Nghiên cứu nồng ñộ enzym DNase I xử lý dịch mẫu sau tách chiết 47
3.2.2. Khảo sát nhiệt ñộ lai của hệ mồi 49
3.2.3. Khảo sát nồng ñộ mồi trong phản ứng PCR 50
3.2.4. Khảo sát nồng ñộ Mg
2+
54
3.2.5. Khảo sát nồng ñộ dNTP 55
3.2.6. Khảo sát ñộ nhạy của quy trình 56
3.2.7. Khảo sát ñộ ñặc hiệu của quy trình 57
3.2.8. Quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ
gen người bằng kỹ thuột multiplex RT-PCR 58
3.3. Bước ñầu ứng dụng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV
type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR trên các mẫu dịch
phết cổ tử cung thu thập tại Tp. Buôn Ma Thuột 60
vii
Phần IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65
4.1. Kết luận 65
4.2. Kiến nghị 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
PCR Polymerase chain reaction: Phản ứng kéo dài chuỗi.
PK Phòng khám
PKĐK Phòng khám ña khoa
RNA Ribonucleotide acid
RT Reverse Transcriptase
RT-PCR Reverse Transcriptase - Polymerase chain reaction
TAE Tris acetate EDTA
Taq Thermus aquaticus
TE Tris acid – EDTA
Tm melting Temperature: Nhiệt ñộ biến tính.
x
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Trang
Hình 1.1: Sự phát triển của các tế bào bất thường trong bệnh ung thư cổ tử
cung 3
Hình 1.2: Human papillomavirus type 16 4
Hình 1.3: Cấu trúc bộ gene của Human papillomavirus type 16 5
Hình 1.4: Quá trình xâm nhiễm và gây bệnh của HPV type nguy cơ cao trong
tế bào chủ 7
Hình 1.5: Sơ ñồ biểu diễn phân bố tỉ lệ ung thư cổ tử cung trên thế giới 10
Hình 1.6: Tế bào cổ tử cung bình thường và nghịch sản 13
Hình 2.1: Thang DNA 100bp 26
Hình 2.2: Sơ ñồ biểu thị vị trí gắn mồi E6f-E6r trên gene E6 và trên amplicon 31
Hình 3.1: Kết quả ñánh giá khả năng khuếch ñại của hệ mồi thiết kế 44
Hình 3.2: Kết quả thực hiện phản ứng multiplex PCR trên 3 mẫu chứng
dương chưa xử lý enzym DNase I 45
Hình 3.3: Kết quả khảo sát nồng ñộ enzym DNase I xử lý dịch sau tách chiết 47
Hình 3.4: Kết quả khảo sát nhiệt ñộ lai của hệ mồi 47
Bảng 3.9: Kết quả giải trình tự gene E6 và E7 của HPV type 16 gắn chèn vào bộ gene
người 58
Bảng 3.10: Kết quả kiểm chứng quy trình phát hiện gắn chèn gene E6 và E7 của
HPV type 16 vào bộ gene người trên các mẫu dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp.
Buôn Ma Thuột 62
23
Phần II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung nghiên cứu
1. Nghiên cứu thiết kế và kiểm tra mồi khuếch đại đặc hiệu gen E6 và E7 của
HPV type 16.
2. Xây dựng quy trình phát hiện sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16
vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR
- Nghiên cứu nồng độ enzym DNase I xử lý dịch sau tách chiết
- Khảo sát nhiệt độ lai của hệ mồi
- Khảo sát nồng độ mồi
- Khảo sát nồng độ Mg
2+
- Khảo sát nồng độ dNTP
- Khảo sát độ nhạy của quy trình
- Khảo sát độ đặc hiệu của quy trình
3. Bước đầu ứng dụng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV
type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR trên các mẫu mẫu dịch
phết cổ tử cung thu thập tại Tp. Buôn Ma Thuột.
2.2. Địa ñiểm và thời gian nghiên cứu
2.2.1. Địa ñiểm nghiên cứu
- Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Bộ môn Sinh học thực nghiệm, Khoa
KHTN&CN, trường Đại học Tây Nguyên.
- Phòng thí nghiệm CNSH&MT, trường Đại học Tây Nguyên.
2.2.2. Thời gian nghiên cứu
Đăk Lăk.
Bảng 2.2: Địa ñiểm và số lượng mẫu thu thập sử dụng trong ñề tài
STT Địa ñiểm thu mẫu Số mẫu thu thập
1 Bệnh viện đa khoa Thiện Hạnh 64
2 Phòng khám đa khoa Hồng Đức 2
25
3 Phòng khám số 46 Phan Chu Trinh 2
4 Phòng khám đa khoa Nguyễn Dũng 7
5 Phòng khám số 120 Hồ Tùng Mậu 11
Tổng cộng 86
+ Chứng nội: là yếu tố kiểm soát nội phản ứng nhằm kiểm chứng phản ứng
có diễn ra bình thường hay không. Một đoạn amplicon có kích thước 400bp được
tổng hợp tại Công ty IDT (Hoa Kỳ) dùng làm chứng nội, trình tự amplicon được
thiết kế với 2 vị trí lỗi (mismatch) thể hiện qua bảng 2.3
Bảng 2.3: Trình tự amplicon tổng hợp làm chứng nội
Trình tự amplicon (5’ – 3’)
Kích
thước (bp)
CACAGAGCTGCAAACAACTATCCAATTATCAACAATTACTACAT
GCAGCAGTACCAGAACTCCATGGACACGCAGCTTGGTGACAACG
CTATTAGCGGAGGCTCCAACGAGGGGTCCACGGACACCACCTCC
ACTCACACAACCAACACTCAGAACAATGACTGGTTTTCAAAGCT
GACCAGTTCCGCTTTTAGCGGTCTTTTCGGCGCTCTTCTTGCTGAC
AAGAAAACCGAGGAGACCACTCTTCTCGAGGACCGCATCCTCAC
TACCCGCAACGGACACACGACCTCGACAACCCAGTCGAGCGTTG
GAGTCACTTACGGGTACGCAACAGCTGAGGACTTTGTGAGCGGA
CCAAACACATCTGGGCTTGAGACCAACCGTCAAAAGCCACTGTG
TC
- Dung dịch điện di TAE 50X: 40mM Tris- 20mM Acetic Acid- 1mM EDTA
(hãng Fermentas)
- Dung dịch nạp mẫu 6X: 10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol
blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol 60 mM EDTA (hãng Fermentas)
- Dung dịch nhuộm mẫu Ethidium bromide.
27
- Thang DNA 100 bp (hãng Fermentas).
Hình 2.1. Thang DNA 100bp
2.3.3. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
2.3.3.1. Dụng cụ nghiên cứu
- Micropipettes loại: 10µl, 100µl, 1000µl (hãng Axygen – Hoa Kỳ).
- Đầu tip thường, loại: 10µl, 100µl, 1000µl (hãng Greiner)
- Filter tip loại: 10µl, 100µl, 1000µl (hãng Greiner)
- Eppendorf 1.5ml (loại thường và loại Biopure), eppendorf 0.2ml nắp phẳng
(hãng Greiner)
- Vật liệu tiêu hao: găng tay không phấn, khẩu trang, cồn 70
0
,
2.3.3.2. Thiết bị nghiên cứu
- Máy tính và các phần mềm chuyên dụng để thiết kế và đánh giá mồi
- Máy Vortex (hãng IKA)
- Tủ lạnh âm 30
0
C và tủ lạnh thường
- Bước 4: Sắp gióng các trình tự gen E6 và E7 với từng mồi xuôi, mồi ngược,
đánh giá mức độ tương đồng của các trình tự trên bằng phần mềm clustal.
- Bước 5: Phân tích và đánh giá các thông số của mồi về Tm, %GC, hairpin
(kẹp tóc), self – dimer, hetero – dimer, độ tương đồng, kích thước sản phẩm PCR
tạo thành bằng các phần mềm BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), Oligo
Analyzer. Từ đó, chọn cặp mồi thích hợp nhất để thực hiện phản ứng multiplex RT
- PCR.
Sau khi thiết kế và kiểm tra, các cặp mồi đạt tiêu chuẩn về mặt lý thuyết sẽ
được gửi tổng hợp nhân tạo tại Công ty IDT (Hoa Kỳ).
2.4.1.1.3. Một số tiêu chuẩn thiết kế và ñánh giá mồi
Trong giai đoạn thiết kế mồi, qua tham khảo một số tài liệu về thiết kế mồi
của Andrew Wallace (1996), Alkami Biosystems (1999) , một số tiêu chuẩn của
mồi được rút ra như sau:
- Chiều dài của mồi tốt nhất nằm trong khoảng 18 – 25 cặp base.
- Thành phần các nucleotide của mồi phải cân bằng. Các mồi có hiệu quả
khuếch đại tốt nhất là những mồi có các base loại G, C tập trung thành nhóm và
chiếm tỉ lệ khoảng từ 40% - 60%. Ngoài ra, các base cuối ở đầu 3’hay gần đầu 3’
của các mồi này nên là G, C, GC hoặc CG.
- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi là một thông số quan trọng có ảnh hưởng
lớn đến khả năng bắt cặp của mồi với DNA bản mẫu. Để đạt hiệu quả nhân bản tốt
nhất, nhiệt độ nóng chảy của mồi nằm trong khoảng 50
0
C – 72
0
C. Ngoài ra, nhiệt
độ nóng chảy mồi xuôi và mồi ngược không được cách biệt quá xa, tối đa khoảng
5
0
C.
- Trong cấu trúc của mồi không được có những vùng trình tự có thể tự bắt
nhân tới khám sản tại các Phòng khám và Bệnh viện trên địa bàn thành phố Buôn
Ma Thuột. Mẫu lựa được chọn là các mẫu có kết quả Pap nghi ngờ hoặc viêm
nhiễm nặng và bệnh nhân 26 tuổi trở lên.
Mẫu được bảo quản trong dung dịch TE1X và vận chuyển về phòng thí
nghiệm trong điều kiện từ 0
0
C tới 4
0
C. Tại phòng thí nghiệm, bảo quản mẫu - 20
0
C.
2.4.3. Phương pháp tách chiết tế bào thu nhận RNA tổng số
Để tách chiết tế bào thu nhận RNA tổng số, sử dụng phương pháp tủa trong
phenol/chloroform theo phương pháp của Chomczynski & Sacchi (1987). Quy trình
tách chiết đã được thương mại hóa và cung cấp từ Công ty CP Công nghệ Việt Á –
Tp. Hồ Chí Minh, quy trình bao gồm các bước sau:
- Đánh dấu các eppendorf 1.5ml Bio-pure.
- Hút tất cả các dung dịch đều sử dụng đầu tip có phin lọc.
- Các mẫu bệnh phẩm được vortex kỹ. Sau đó, hút 200µl vào các eppendorf
vô trùng có chứa sẵn 900µl dung dịch 1. Vortex 30 giây, để yên 10 phút. Thêm
200µl dung dịch 2 (lắc kỹ trước khi hút), trộn đều, ly tâm 13000 vòng/phút, 10 phút.
- Cẩn thận hút 600µl dịch trong nổi có chứa RNA (tránh làm xáo trộn hai
lớp) và một eppendorf bio-pure khác có chứa sẵn 600µl dung dịch 3 (trộn đều trước
khi sử dụng). Trộn đều hỗn hợp, để yên 10 phút ở nhiệt độ lạnh, sau đó ly tâm
13000 vòng/phút, 10 phút.
- Hỗn hợp sau khi ly tâm được loại bỏ dịch nổi, thu cặn. Cho từ từ 900µl
dung dịch 4 vào, ly tâm 13000 vòng/phút, 5 phút.
- Tiếp tục loại bỏ hết dịch nổi và thu cặn. Để khô ở nhiệt độ 60
0
C trong 10
33
A: vị trí gắn mồi E6f-E6r trên gen E6 tạo sản phẩm có kích thước 287bp
B: vị trí mismatch và gắn mồi E6f-E6r trên amplicon tạo sản phẩm có kích thước 400bp
2.4.5. Phương pháp multiplex RT – PCR
2.4.5.1. Phản ứng RT
- Phản ứng RT để phiên mã ngược RNA thành cDNA. Thành phần 1 phản
ứng 20µl bao gồm: 12.5µl dịch tách chiết RNA, 1µl enzym RT, 6.5 µl RT buffer.
Đậy nắp eppendorf thật kỹ, đặt vào máy PCR.
- Thao tác thực hiện trong điều kiện đá đang tan.
- Cài đặt chương trình luân nhiệt cho phản ứng RT:
25
0
C – 10 phút, 42
0
C - 30 phút, 85
0
C – 5 phút, giữ ở 4
0
C
2.4.5.2. Phản ứng multiplex PCR
- Thành phần cho một phản ứng 25µl bao gồm:
2.5µl dung dịch đệm (buffer) 10X; 0.625 unit Taq DNA polymerase; 3.0 mM
MgCl
2
; 280µM dNTPs; Mồi xuôi và mồi ngược E6: mỗi mồi 500nM; Mồi xuôi và
mồi ngược E7: mỗi mồi 500nM; 1µl chứng nội ở nồng độ 10
4
bản sao/ml; 2.5µl
dịch cDNA. Thêm nước cất hai lần cho đủ 25µl.
- Thao tác thực hiện trong điều kiện đá đang tan
0
C, đổ
vào giá nằm ngang có lắp lược, chờ gel đông, đặt vào bồn điện di có chứa dung dịch
TAE 1X, rút lược khỏi gel.
2.4.6.3. Kỹ thuật ñiện di kiểm tra sản phẩm multiplex RT - PCR
Thành phần điện di bao gồm 7µl sản phẩm PCR hoặc chứng dương, chứng
âm với 3 µl dịch nạp mẫu. Cho hỗn hợp trên vào các giếng trên gel agarose 2%.
Điện di ở điện thế 50V, 5 phút. Tăng lên 80V, 30 phút. Nhuộm gel trong dung dịch
TAE 1X có ethidium bromide 15 phút.
Quan sát kết quả điện di thông qua thiết bị chụp hình chuyên dụng GelDoc
XR có kết nối phần mềm chuyên dụng (Biorad). Kích thước các sản phẩm PCR
được ghi nhận sẽ đối chiếu với chứng dương, chứng âm và thang chuẩn 100bp.
Copyright: Tài liệu đại học ©