i

Tóm tắt
Đặt vấn đề
Phát hiện và định lượng HIV1RNA là một nhu cầu rất cần thiết để có thể chẩn đoán phát hiện sớm nhiễm HIV
trong giai đoạn cửa sổ hay trẻ sơ sinh và nhũ nhi cũng như để theo dõi hiệu quả điều trị trên các bệnh nhân
HIV/AIDS đang được điều trị đặc hiệu. Nhu cầu này có thể giải quyết được bằng các bộ xét nghiệm dựa trên kỹ
thuật sinh học phân tử như PCR và bDNA đã được chấp nhận IVD và có trên thị trường. Tuy nhiên giá thành của
các bộ xét nghiệm này là khá cao, khó có thể đưa vào áp dụng tại các phòng thí nghiệm lâm sàng tại các quốc
gia thu nhập thấp như Việt Nam chúng ta.
Mục tiêu
Có 2 mục tiêu chính: (1) Xây dựng được qui trình xét nghiệm phát hiện và định lượng HIV1RNA dựa trên kỹ
thuật RT real-time PCR, đặt tên là HIV1 RT-TQPCR, sử dụng mồi và taqman probe đặc hiệu vùng gene gag trên
bộ gene HIV1; (2) Đánh giá qui trình xét nghiệm thông qua đánh giá giới hạn phát hiện, khoảng định lượng, độ
chính xác qua độ lặp lại, độ bền trong lưu trữ, và độ nhạy cảm cùng độ lặp lại cũng như độ tương đồng khi thử
trên mẫu thật so sánh với bộ HIV1 Amplicor làm chuẩn vàng.
Vật liệu và phương pháp
Qui trình xét nghiệm “HIV1 RT-TQPCR” được xây với mồi SK462 và SK431 đặc hiệu gene gag đã công bố và
taqman probe được thiết kế từ sự biến đổi probe SK101 cũng đã được công bố. Các chứng dương HIV1RNA và
các mẫu chuẩn định lượng là RNA phiên mã từ plasmid pGEM-T Easy đã chèn sản phẩm PCR đích nhân bản từ
chính gene gag sử dụng mồi SK462 và SK431. Chứng nội sử dụng chung mồi là được phiên mã từ plasmid
pGEM-T Easy đã chèn sản phẩm PCR khuếch đai từ các sợi Oligo có trình tự hai đầu bắt cặp bổ sung được với
trình tự hai mồi SK462 và SK431 nhưng trình tự probe là khác biệt. Bộ tách chiết RNA sử dụng bộ
NK
RNAPREP
của Nam Khoa và bộ tổng hợp cDNA sử dụng bộ
NK
cDNA synthesis của Nam Khoa. Giới hạn phát hiện, khoảng
định lượng, độ lặp lại liên phản ứng cũng như trong phản ứng được thực hiện trên các dãy pha loãng của chứng
dương HIV1RNA. Độ đặc hiệu được đánh giá trên các mẫu huyết thanh người bị nhiễm HBV, HCV, CMV và S.
aureus xác định bằng PCR hay nuôi cấy. Khả năng chống ức chế được thử trên các chất có khả năng ức chế PCR

đánh giá qui trình xét nghiệm HIV1 RT-TQPCR phát hiện và định lượng HIV1RNA chúng tôi thu được các thông
số như sau: (1) độ nhạy là 100% (2) độ đặc hiệu: 100% (3) ngưỡng phát hiện: 60 copies/ml huyết tương (4)
khoảng định lượng là 10
2
-10
8
copies/ml (5) độ bền trong lưu trữ ít nhất là 12 tháng (6) có khả năng chống ức
chế. Tuy nhiên để có thể đăng ký được chấp nhận IVD thì cần phải có thêm kinh phí để thử trên các trung tâm
đạt chuẩn ISO 15189 làm xét nghiệm phát hiện và định lượng HIV1RNA trong chẩn đoán.

ii

Abstract
Background
Detection and quantification of HIV1RNA is the necessary requirement from the clinical to detect HIV infection
during the window phase or to confirm the HIV infection in the baby, as well as to follow up the efficacy of the
specific treatment. These requirements could be solved by the using of the IVD approved kits using PCR or bDNA
technologies. However the price of these commercialized kits are very expensive, it could not be easily applied at
the clinical laboratory in the existing conditions of the low-income countries like Vietnam.
Main aims
There are two main aims: (1) Prepare the molecular biology kit named HIV1 RT-TQPCR kit, to detect and
quantify of the HIV1RNA based on the RT real-time PCR technology using the primers and taqman probe
specific the gag gene on the HIV1 genome; (2) Evaluate the process via the limit of detection, the range of
quantification, the accuracy, the specificity, the elimination of the inhibitors, and the stability of the kits as well
as the sensitivity-specificity and the similarity when testing on the real samples using HIV1 Amplicors as gold
standards.
Materials and methods
The “HIV1 RT-TQPCR” was prepared using the published SK462 and SK431 specific to gag gene, and the
taqman probe was designed from the modification of the published probe SK102. The positive control HIV1RNA
and the standards for quantification was prepared from the transcription of the plasmid pGEM-T Easy inserted

process gave the same results as the FDA approved for IVD kit, HIV1 Amplicor, when testing on the real samples
HIV [+] and HIV [-] with sensitivity and specificity 100% if the Amplicor was considered as gold standards.
Conclusion
Based on the results of the research we have complete the process with the necessary ingredients for a real-time
PCR tests as the RNA extraction kit and the cDNA synthesis kit, amplification, positive control and internal
control. At the time of the evaluation of HIV1 RT-TQPCR tests, we obtained the following parameters: (1)
sensitivity: 100% (2) specificity: 100% (3) threshold detection: 60 copies/ml plasma (4) the amount is about 10
2
-
10
8
copies/ml (5) durability in storage for at least 12 months (6) is resistant to inhibition. However, in order to be
approved as the IVD kit,the more funding will be needed to try the kit in the laboratories ISO 15189 certified for
testing of HIV1RNA detection and quantification for clinical apliucations.
iiiSTT
MỤC LỤC
Trang

PHẦN 1 MỞ ĐẦU
1
PHẦN 2 ĐẶT VẤN ĐỀ
2
PHẦN 3 TỔNG QUAN
3
1 Tình hình nhiễm HIV trên thế giớ và tại Việt Nam 3
1.1 Tình hình nhiễm HIV trên thế giới 3
1.2 Tình hình nhiễm HIV tại Việt Nam 3

5.2 Chứng âm 16
5.3 Chứng nội tại 16
6 PHƯƠNG PHÁP TẠO DÒNG 17
6.1 Mục đích của sự tạo dòng 17
6.2 Các bước cơ bản của phương pháp tạo dòng 17
PHẦN 4 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
19
1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 19
2 CÁC PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ĐƯỢC SỬ DỤNG 20
2.1
Tách chiết RNA với bộ thuốc thử “
NK
RNAPREP” của Nam Khoa
20
iv

2.1.1 Nguyên tắc 20
2.1.2 Phương pháp 20
2.2
Tổng hợp cDNA từ tách chiết RNA với bộ thuốc thử “
NK
cDNA synthesis”
của Nam Khoa
20
2.2.1 Nguyên tắc 20
2.2.2 Phương pháp 21
2.3
Tinh sạch sản phẩm PCR với bộ thuốc thử “Wizard® SV Gel and PCR
Clean-Up System” của Promega
21

định lượng HIV1RNA
28
3.3
Phương pháp pha chế HIV1-TQPCR master mix
29
3.4
Phương pháp pha chế các chứng và chuẩn
30
3.4.1
Chế tạo chứng dương HIV1RNA-C[+] và chuẩn định lượng HIV1-RNA
30
3.4.2
Chế tạo chứng nội HIV1RNA-IC
31
3.4.3 Mẫu huyết tương người bình thường 33
4
PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV1 RT-TQPCR
33
v

TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

4.1
Các chỉ tiêu phải đánh giá
33
4.2
Phương pháp đánh giá
34
4.2.1 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 34
4.2.2 Độ lặp lại trong phản ứng 34

HIV1 qua kết quả pha chế HIV1-TQPCR master mix
39
1.2
Kết quả chế tạo chứng dương HIV1RNA-C[+]
39
1.3 Kết quả chế tạo chứng nội HIV1RNA-C[+] 40
1.4
Kết quả chứng minh chứng nội HIV1RNA-C[+] pha ở nồng độ 100
copies/10µl là không cạnh tranh hệ thống đích
40
2
KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH THỬ NGHIỆM HIV1 RT-TQPCR
TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
41
2.1 Kết quả đánh giá giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 41
2.2 Kết quả đánh giá độ lặp lại trong phản ứng 41
2.3 Kết quả đánh giá độ lặp lại liên phản ứng 42
2.4 Kết quả đánh giá độ đặc hiệu 44
2.5 Kết quả đánh giá khả năng chống ức chế 44
2.6 Kết quả đánh giá độ ổn định trong bảo quản 45
3
KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV1 RT-TQPCR
THỰC HIỆN TRÊN MẪU THẬT
46
4
QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV1RNA RT-TQPCR VỚI CÁC THÀNH
PHẦN VÀ HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG
47
vi


dGTP 2’deoxyguanosine 5’- triphosphate
dNTP 2’-deoxynuclosid 5’- triphosphat
ELISA Enzyme – Linked Immunosorbent Assay
HIV-1 Human Immunodeficiency Virus type 1
IC Internal Control
OD Optical Density
PCR Polymerase chain reaction
Realtime PCR Realtime Polymerase chain reaction
RNA ribonucleic acide
RT-PCR reverse transcriptase- polymerase chain reaction
UNIADS Joint Unitied Nations Programme on HIV/AIDS
Taq Thermus aquaticus
SIV Simian Immunodeficiency Virus
WHO World Heath Organization
CV Coeficient of variation
SOC Super Optimal Catabolite Repression Broth
IPTG isopropyl-β-D-thiogalactoside
X- gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- galactoside

viii

DANH SÁCH BẢNG
Số
TÊN BẢNG SỐ LIỆU
Trang
1
Thể tích của các thành phần được lấy từ các nồng độ hay hàm lượng gốc
để pha được các HIV1-TQPCR mastermix cho 10 mix – 50 mix hay 100
mix
29

Trang
1 HIV mô tả từ máy tính 4
2 Hình chi tiết của virus HIV 7
3 Hình ảnh cấu trúc của virus HIV 7
4 Vị trí của các gene trong bộ gene HIV 7
5
Cơ chế hoạt động của SYBR I (1) Khi chưa có sản phẩm khuếch đại thì ống
thứ nghiệm không phát được hùynh quang khi nhận được ánh sáng kích thích,
(2) Nhưng khi có hiện diện của sản phẩm khuếch đại thì SYBR I chèn vào và
tập trung trên phân tử DNA , làm cho ống phản ứng bị phát huỳnh quang khi
nhân được ánh sáng kích thích
9
6 Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong real-time PCR 10
7 Tóm tắt cơ chế họat động của Beacon probe trong real-time PCR 11
8 Tóm tắt cơ chế hoạt động của probe lai trong real-time PCR 12
9
Biển đồ một đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang
phát ra từ ống phản ứng khi nhận ánh sánh kích thích ở mỗi chu kỳ nhiệt
12
10
Biểu đồ khuếch đại vẽ lên các đường biểu diễn khuếch đại của các mẫu thử và
các mẫu chuẩn
13
11
Biển đồ chuẩn vẽ lên đường biểu diễn chuẩn về mối quan hệ giữa số lượng
bản DNA đích có trong các mẫu chuẩn và chu kỳ ngưỡng tương ứng. Trong
biểu đồ ở trên này, chúng ta E2-E4-E7 là các ống phản ứng chứa các mẫu
chuẩn còn B4 là ống phản ứng chứa mẫu thử
14
12 Nguyên tắc tổng hợp cDNA từ RNA 20

Eseay chèn sản phẩm PCR
18
(A) Biểu đồ khuếch đại dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có (màu đỏ) và không
có (màu xanh) cho thêm 10µl chứa 100 copies chứng nội HIV1RNA-IC trước
khi tách chiết RNA để tổng hợp cDNA rồi chạy real-time PCR. Kết quả cho
thấy cả hai dãy pha loãng ở nồng độ cuối đều cho tín hiệu khuếch đại, chứng
tỏ chứng nội HIV1RNA-IC ở nồng độ 100 copies cho vào thể tích mẫu tách
chiết đã không cạnh tranh với đích. (B) Biểu đồ khuếch đại của chứng nội
HIV1RNA-IC trong các 5 mẫu HIV1RNA-C[+] có cho 10µl chứng nội vào
mẫu, kết quả này chứng minh chứng nội thật sự được khuếch đại khi cho vào
HIV1-TQPCR mix
41
19
Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có hàm
lượng copies 1 đến 10
10
copies trong 150µl huyết tương
41
20
Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn 3 dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có hàm
lượng copies 1 đến 10
8
copies trong 150µl huyết tương
42
21
Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có hàm
lượng copies 1 đến 10

26
Kết quả biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn của xét nghiệm phát hiện
HIV1RNA trong 2 mẫu 10
3
và 10
7
copies HIV1RNA có trong 150µl, thực
hiện ngay sau khi pha.
45
27
Kết quả biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn của xét nghiệm phát hiện
HIV1RNA trong 2 mẫu 10
3
và 10
7
copies HIV1RNA có trong 150µl, thực
45
xi

hiện sau 4 tháng bảo quản
28
Kết quả biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn của xét nghiệm phát hiện
HIV1RNA trong 2 mẫu 10
3
và 10
7
copies HIV1RNA có trong 150µl, thực
hiện sau 8 tháng bảo quản
46
29


1

PHẦN 1 MỞ ĐẦU
Tên đề tài
Nghiên cứu xây dựng qui trình phát hiện và định lượng Human
Immunodeficiency Virus – 1 trong huyết tương người bằng kỹ thuật
real-time PCR
Chủ nhiệm đề tài
Họ và tên: Nguyễn Việt Quốc
Năm sinh: 18/03/1982 Nam/Nữ: Nam
Học vị: Cử nhân Công nghệ Sinh học Năm đạt học vị:
2005
Cơ quan công tác Công ty TNHH Nam Khoa
Cơ quan chủ trì Trung tâm Phát triển Khoa học – Công nghệ trẻ
Thời gian thực hiện đề tài 12 tháng
Kinh phí được duyệt 80.000.000 đồng
Kinh phí đã cấp 49.000.000 đồng theo TB số : /TB-SKHCN ngày
Mục tiêu Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và định
lượng Human Immunodeficiency Virus – 1 trong
huyết tương người bằng kỹ thuật real-time PCR
Nội dung
Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện
Thu nhận mẫu huyết tương dương tính và âm
tính với HIV bằng thử nghiệm ELISA
50 mẫu huyết tương dương tính và 20
mẫu huyết tương âm tính
Thực hiện thử nghiệm với kits Qiagen với
huyết tương thu nhận được
Xác định mẫu huyết tương dương tính

nhiều hạn chế.
Hiện nay, với sự phát triển của Công nghệ Sinh học, đặc biệt là sinh học phân
tử đã mở nhiều hướng mới cho việc phát hiện và điều trị căn bệnh thế kỹ này.
Các trường đại học, các viện nghiên cứu như Pastuer, các doanh nghiệp đã tiến
hành nghiên cứu, áp dụng các phương pháp hiện đại như PCR, RT-PCR, real-
time PCR trong việc phát hiện và theo dõi điều trị.
Trong các phương pháp chẩn đoán thì RT- real-time PCR là một sự tiến bộ
vượt bậc cho ta độ chính xác cao và thời gian ngắn. Điều này có ý nghĩa quan
trọng đối với các nhà lâm sàng trong việc chuẩn đoán và điều trị các trường
hợp nhiễm HIV1. Và quan trọng hơn nữa nếu chúng ta xây dựng thành công
bộ kits phát hiện và định lượng HIV1 bằng kỹ thuật real-time PCR với giá
thành phù hợp với người có thu nhập thấp như ở Việt Nam chúng ta.
Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng
quy trình phát hiện và định lượng Human Immunodeficiency virus – 1
trong huyết tương người bằng kỹ thuật real-time PCR”.
Mục tiêu nghiên cứu tổng quát của đề tài là: Xây dựng quy trình phát hiện
và định lượng Human Immunodeficiency virus – 1 trong huyết tương
người bằng kỹ thuật real-time PCR 3

PHẦN 3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1 TÌNH HÌNH NHIỄM HIV TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM
1.1 Tình hình nhiễm HIV trên thế giới

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, vào thời điểm tháng 6/1994 trên thế
giới có 985.199 ca AIDS thì đến tháng 12/1996 có 22,5 triệu người nhiễm
HIV và đến tháng 10/1999 có 33,4 triệu người nhiễm HIV
[31]

nhiều công trình nghiên cứu và sáng chế liên quan đến các kỹ thuật phát hiện
và địnhlượng HIV1 và cũng từ đó đã có những sản phẩm thương mại có liên
quan như các bộ kit phát hiện và định lượng HIV1-RNA của Roche, của
Abbott.
1.2 Tình hình nhiễm HIV tại Việt Nam

Trường hơp nhiễm HIV đầu tiên ở nước ta phát hiện vào tháng 12 năm 1990
tại thành phố Hồ Chí Minh. Nhưng thực sự dịch HIV/AIDS bắt đầu bùng nổ từ
1993 trong nhóm những người nghiện chích ma túy tại thành phố Hồ Chí
Minh. Sau đó dịch bắt đầu lan ra các tỉnh. Tính đến tháng 12 năm 2002, theo
báo cáo của các tỉnh thành, cả nước đã phát hiện 58.490 trường hợp nhiễm
HIV, 8.718 trường hợp biến chuyển thành bệnh AIDS và 4.834 trường hợp đã
tử vong
[33]
. Tính đến tháng 6 năm 2008, đại dịch HIV ở nước ta đang tăng với
tốc độ gắp hai lần so với cùng kỳ name 2007. Trong các ca nhiễm HIV thì có
tới 83.3% ở độ tuổi từ 20 đến 39, tỷ lệ nhiễm ở nam giới cao gấp 4 lần so với
nữ giới
[32]
. Theo thống kê từ cục phòng chống HIV/AIDS, đa phần các trường 4

hợp nhiễm HIV ở nước ta là nghiện chích ma túy hoặc liên quan đến ma túy,
con đường lây nhiễm chủ yếu hiện nay là sử dụng chung kim tiêm và quan hệ
tình dục không an toàn; 100% tỉnh /thành nước ta có người nhiễm HIV. Tại
một số địa phương, tỷ lệ người nghiện ma túy quan hệ tình dục với gái mại
dâm cũng đang tăng mạnh như: An Giang (43,3%), Đà Nẵng (35,2%), Cần
Thơ (28,9%) Cũng trong khoãng thời gian này tổng số người nhiễm HIV tử

2 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA HIV
2.1 Một số đặc điểm sinh học của HIV

HIV là một retrovirus thuộc họ lentivirus có vật
liệu di truyền là RNA. Quá trình nhân lên của
HIV qua giai đọan trung gian DNA nhờ
enzyme sao chép ngược. Sau một thời gian ủ
bệnh kéo dài, các lentivirus làm suy giảm hệ
thống miễn dịch kéo dài trong suốt giai đoạn
gây bệnh
[30]
.
2.2 Các type di truyền của HIV

Hình 1: HIV mô tả từ máy tính
() 5

HIV gây bệnh AIDS thường gặp nhất là HIV1 và là tác nhân gây bệnh lan
rộng khắp thế giới. Tác nhân thứ hai là HIV-2, ít gặp hơn và độc lực thấp hơn
nhưng vẫn cho các triệu chứng lâm sàng giống HIV1, tuy nhiên chúng khác
nhau ở một số điểm: Về di truyền: bộ gen của HIV1 và HIV-2 có cấu trúc di
truyền khác nhau. Trên 50%, HIV-2 giống với SIV (gây bệnh ở khỉ). Kháng
nguyên của hai virus này cũng khác nhau. Trọng luợng phân tử của các thành
phần cấu trúc cũng khác biệt. Thời gian không triệu chứng của HIV-2 cũng dài
hơn HIV1. Tỷ lệ nhiễm HIV1 cao hơn HIV-2.
[48]
Những chủng của HIV1 có thể được xếp lớp vào 4 nhóm: nhóm M "chính",

E) là phân type gây đại dịch ở các nước Đông Nam Á và cũng là phân nhóm
chiếm đến 97% phân typ HIV-1 lưu hành tại Việt Nam nhưng có nguồn gốc
từ Trung Phi. Phó type F đã được tìm thấy ở Trung Phi, Nam Mỹ và Đông
Âu. Phó type G và CRF A/G đã được quan sát ở Tây và Đông châu Phi và 6

Trung Âu. Phó type H chỉ được tìm thấy ở Trung Phi, Phó type J chỉ
có ở Trung Mỹ và K chỉ có tại Cộng hòa Dân chủ Congo và Cameroon.
[49]
Liệu có thể có thêm nhiều phó type sẻ “xuất hiện”: Gần như chắc chắn rằng
các phó type gene mới và CRFs của HIV sẽ được phát hiện trong tương lai, và
thực sự rằng là những phó type mới và CFRs mới sẽ phát triển vì sự tái tổ hợp
và đột biến của virus vẫn tiếp tục xảy ra. Các phó type và CRFs hiện nay cũng
sẽ tiếp tục lây lan đến các khu vực mới khi đại dịch toàn cầu vẫn tiếp diễn
[48]
2.3 Cấu trúc HIV

2.3.1 Hình thể và cấu tạo virus
Trên kính hiển vi điện tử virus HIV có dạng hình cầu lởm chởm, xù xì. Đường
kính khoảng từ 100-120 nanometres, khoảng 60 lần nhỏ hơn một tế bào hồng
cầu
[44]
. Virus HIV hoàn chỉnh có cấu tạo từ ngoài vào trong gồm có 3 lớp:
Bao ngoài: Là màng lipid kép. Trên màng này là các phân tử glycoprotein,
dưới có chứa nhiều các núm (gai nhú) trên bề mặt là các phân tử glycoprotein
có trọng lượng phân tử 160 kilodalton (Gp160), gồm 2 thành phần: Gp120
đảm nhận vai trò phân tử nhận biết thụ thể CD4+ có trên tế bào lympho CD4
và một số tế bào khác, nhờ đó virus bám được vào tế bào đích. Gp41 (ở HIV2


2.3.2 Cấu trúc gene HIV
Mỗi sợi RNA có khoảng 9200
cặp base với 3 gen cấu trúc
chính là: Gene Gag (groupe
Antigen – Kháng nguyên đặc
hiệu nhóm): mã hóa cho
protein lõi của virus P24,
protein nhân capsid P6 và P7, và P17 bên trong của virus. Gene Pol
(polymerase):mã hóa cho các loại enzyme virus, quan trọng nhất là Reverse
Transcriptase, integrase, protease. Gene Env (enveloppe): mã hóa cho các
glycoprotein vỏ Gp41, Gp120 bao phủ ngoài có vai trò quan trọng trong việc
giúp virus bám và xâm nhập được vào tế bào đích. Ngoài 3 nhóm gene chính,
genome của virus còn có các gene khác mã hóa cho các protein có chức năng
điều hòa và protein có cùng tên với gen mã hóa cho nó: Tat, Rev, Nef, Vif,
Vpr, Vpu. Các LTR (long termina Repeat) là những vị trí lồng ghép trong bộ
gene đặc biệt vùng U3 của R và 5’LTR chứa các chuỗi điều hòa sao chép và là
vị trí khởi đầu cho sự sao chép
[48]
.
2.4 Sức đề kháng của virus HIV

chảy, gan to, lách to, nhức đầu, và các bệnh nhiễm trùng cơ hội như candida
miệng, viêm da(không zona,zona), lao phổi. Giai đoạn bệnh AIDS: Khi bệnh
nhân chẩn đoán là AIDS nghĩa là nhiễm HIV giai đoạn cuối.
Thời gian từ lúc xác định bệnh đế khi chết thường không quá 2 năm. Biểu hiện
lâm sàng chính thường là nhiễm trùng cơ hội (ở phổi, hệ thần kinh, hệ tiêu
hoá) hoặc ung thư.

Những chỉ số sinh học lâm sàng như nồng độ virus tự
do và kháng nguyên p24 trong máu, các kháng thể kháng HIV, và số lượng tế
bào T CD4 của bệnh nhân nhiễm HIV thay đổi trong tiến trình bệnh sang giai
đoạn AIDS
[48]
.
3.1 Nồng độ HIV1 tự do và kháng nguyên p24 trong huyết tương

Nồng độ virus tự do trong huyết tương và nồng độ kháng nguyên p24 (một
lọai kháng nguyên cấu thành lõi của HIV) tỷ lệ thuận với nhau, hai chỉ số này
có giá trị rất cao ở giai đọan nhiễm cấp (2-8 tuần đầu). Khi các virus chuyển
sang dạng tiềm ẩn DNA provirus trong các tế bào đích (T CD4 chủ yếu) thì
nồng độ virus tự do và kháng nguyên p24 sẽ giảm dần. Dựa vào chỉ tiêu trên,
người ta có thể phát hiện chẩn đoán nhiễm HIV/AIDS trực tiếp bằng các
phương pháp sau: Phân lập bằng phương pháp nuôi cấy tế bào đơn nhân
(PBMC). Phát hiện RNA hoặc DNA provirus của HIV bằng kỹ thuật sinh học
phân tử.
3.2 Sự xuất hiện của các kháng thể kháng HIV1 trong huyết thanh của bệnh
nhân nhiễm HIV/AIDS

Các kháng thể kháng HIV1 sẽ xuất hiện sau 1- 3 tháng so với thời điểm bắt
đầu nhiễm HIV. Khả năng trung hòa của các kháng thể này rất kém cho nên
bệnh vẫn diển tiến, đây là hiện tượng đáp ứng đáp ứng miễn dịch không đầy

Agglutination), kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme ELISA (Enzyme – Linked
Immunosorbent Assay), các thử nghiệm khẳng định như là: thử nghiệm miễn
dịch điện di Western blot, thử nghiện miễn dịch huỳnh quang (Immuno –
Fluorescence Assay IFA). Hiện nay, nước ta Bộ Y tế đã ban hành Hướng
dẫn thực hiện xét nghiệm tải lượng HIV1 trong theo dõi điều trị HIV/AIDS
(Quyết định số 1921/QĐ-BYT, ngày 05/6/2013, của Bộ Y tế).
[49]

4 PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR

4.1 Khái niệm real-time PCR
Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị
được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, chính vì vậy nên được gọi là
real-time; và do đặc điểm này nên với real-time PCR người làm thí nghiệm
không cần thiết phải làm tiếp các thí nghiệm để đọc và phân tích kết quả để
xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không vì kết quả cuối cùng của
phản ứng khuếch đại cũng được hiển thị ngay sau khi hoàn tất phản ứng
khuếch đại. Như vậy, nên có thể nói real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA
đích trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết
quả khuếch đại trong ống phản ứng
được hiển thị cùng lúc với phản ứng
khuếch đại xảy ra để người làm thí
nghiệm có thể thấy được
[9]
.
Huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA:
Khởi thủy ethidium bromide được sử
dụng cho nguyên tắc real-time PCR
này, nhưng sau này các nhà khoa học
sử dụng SYBR I vì các ưu điểm vượt

10

do vậy mà tube phản ứng sẽ không bị phát huỳnh quang hay chỉ phát huỳnh
quang không đáng kể khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích. Nhưng khi có sự
hiện diện sản phẩm khuếch đại của PCR thì màu huỳnh quang sẽ bị chèn vào
và tập trung trên các sợi đôi DNA của sản phẩm khuếch đại và sẽ làm cho tube
phản ứng bị phát huỳnh quang khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích.
[9]

Probe làm chất phát huỳnh quang, đó là những đoạn oligonucletides sợi đơn
có trình tự có thể bắt cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích
(trong PCR, đó là sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích). Sử dụng probe
làm chất phát huỳnh quang dựa trên nguyên tắc là khi có mặt sản phẩm khuếch
đại đặc hiệu trong ống phản ứng thì sẽ có sự bắt cặp của probe lên trình tự đặc
hiệu của sản phẩm khuếch đại, và khi có sự bắt cặp này thì sẽ có sự phát
huỳnh quang từ ống phản ứng khi nó nhận được nguồn sáng kích thích. Có
nhiều loại probe được sử dụng, thông thường nhất là taqman probe, beacon
probe và probe lai.
Cơ chế phát huỳnh quang
của Taqman probe trong
các chu kỳ nhiệt có thể
tóm tắt như sau:
(1) Khi chưa có sự xuất
hiện của sản phẩm
khuếch đại đặc hiệu từ
DNA đích thì Taqman
probe vẫn còn nguyên
vẹn do vậy mà huỳnh
quang phát ra được từ
reporter ở đầu 5’ sẽ bị


Q

Ánh sáng kích thích
[1]
Khi chưa có m
ặt sản phẩm khuếch đại đặc
hiệu, Taqman probe không phát được huỳnh
quang khi nhận được nguồn sáng kích thích vì
hu
ỳnh quang phát ra bị quencher hấp
ph
ụ hết

[2]
(a) Khi có m
ặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu,
Taqman probe sẽ bắt cặp trên trình tự đặc hiệu
của sản phẩm khuếch đại ở giai đoạn nhiệt độ
b
ắt cặp sau giai đoạn biến tính

[2]
(b) Taqman probe s
ẽ trở th
ành trình t
ự cản đầu
3’ khi Taq polymerase kéo dài mồi để bắt đầu
t
ổng hợp sợi bổ sung

tắt như sau: (1) Ở giai đoạn
nhiệt độ biến tính, cấu trúc
kẹp tóc của Beacon probe
không còn nên nếu ở giai
đoạn này reporter nhận
nguồn sáng kích thích thì nó
sẽ phát huỳnh quang. (2) Ở
giai đoạn nhiệt độ bắt cặp,
nếu chưa có mặt sản phẩm
khuếch đại đặc hiệu, Beacon
probe sẽ không phát được
huỳnh quang khi nhận được
nguồn sáng kích thích vì
cấu trúc kẹp tóc của hai đầu
đã làm cho repoter gần với
quencer khiến tất cả huỳnh
quang phát từ reporter đều bị
quencher hấp phụ. Nhưng
nếu có mặt sản phẩm khuếch
đại đặc hiệu, Beacon probe
sẽ bắt cặp vào trình tự đặc
hiệu trên sợi đích của sản
phẩm khuếch đại, nhờ vậy
reporter cách xa quencher
nên reporter phát được
huỳnh quang khi nhận nguồn sáng kích thích. (3) Trong giai đoạn nhiệt độ kéo
dài, enzyme Taq polymerase không thủy giải Beacon probe mà chỉ làm tách
Beacon probe khỏi sợi đích khi sợi bổ sung được tổng hợp kéo dài đến trình tự
mà probe bắt cặp vào. Cuối giai đoạn kéo dài, Beacon probe tách khỏi sợi đích
và trở lại cấu trúc kẹp tóc nên không cho reporter phát được huỳnh quang nếu

Cu
ối giai đọan kéo d
ài, Beacon probe tách kh
ỏi sợi đích v
à tr
ở lại cấu
trúch chân tóc nên không cho reporter không được hùynh quang nếu
nhận được nguồn sáng kích thích
R
Q
Trong giai đ
ọa
n nhi
ệt độ kéo d
ài, enzyme Taq polymerase đư
ợc sử dụng
không thủy giải Beacon probe mà chỉ làm tách Beacon probe khỏi sợi
đích khi sợi bổ sung được tổng hợp kéo dài đến trình tự mà probe bắt
c
ặp v
ào.
12

huỳnh quang có độ dài sóng khác biệt với
huỳnh quang phát ra từ D. Để hệ thống hoạt
động được thì thiết bị real-time phải phát
được nguồn sáng kích thích D, nhưng CCD

thiết bị real-time
ghi nhận được tín
hiệu huỳnh quang
phát ra từ ống
phản ứng bắt đầu
vượt qua cường độ
huỳnh quang nền.
Để có thể xác định
được cường độ
huỳnh quang nền,
thiết bị real-time
thường ghi nhận
cường độ tín hiệu
huỳnh quang xuất
Hì
nh
9
: Biển đồ một đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ
huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận ánh sánh kích thích ở mỗi
chu kỳ nhiệt
Giai đo
ạn ủ

Giai đo
ạn lũy thừa

Giai đo
ạn b
ình nguyên


trong r
eal
-
time PCR

Khi chưa có m
ặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, huỳnh quang
phát ra từ D của probe lai 1 không kích thích được A của
probe lai 2 vì chúng ở cách xa nhau
D

A

Khi có m
ặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, Probe lai 1 v
à probe lai
2 bắt cặp lên sợi khuôn làm cho D rất gần A nên huỳnh quang phát
ra từ D (có bước sóng trùng với bước sóng nguồn sáng kích thích
của A) sẽ được A hấp phụ rồi chuyển sang phát huỳnh quang với
bước sóng khác biệt với bước sóng phát huỳnh quang của D
A

D

D
A

D A
Trong g
iai đo

huỳnh quang mà máy
sẽ ghi nhận được, còn
nếu số lượng DNA
đích ít hơn thì cần
nhiều chu kỳ nhiệt
hơn. Đây chính là
một đặc điểm vượt
trội của real-time
PCR so với PCR cổ điển, vì nhờ dựa vào đặc điểm này mà người làm thí
nghiệm xác định được số copies của tác nhân đích có trong mẫu thử, một
thông số mà PCR cổ điển không thể nào làm để có được kết quả chính xác.
Tuy nhiên để real-time PCR xác định được chính xác số lượng bản đích ban
đầu có trong mẫu thử, người làm thí nghiệm phải thực hiện real-time PCR các
mẫu thử chứa các số lượng bản DNA đích ban đầu cần xác định số lượng cùng
lúc với các mẫu chuẩn chứa số lượng DNA đích ban đầu đã biết rõ số lượng,
và thường thì các mẫu chuẩn là các mẫu pha loãng theo hệ số pha loãng 10
chứa số lượng DNA đích ban đầu. Sau khi hoàn tất các chu kỳ nhiệt của real-
time PCR, trên biểu đồ khuếch đại, các mẫu chuẩn và các mẫu thử sẽ có các
đường biểu diễn khuếch đại của nó và tương ứng với các đường biểu diễn
khuếch đại này, các mẫu chuẩn và mẫu thử đều có một chu kỳ ngưỡng (Ct).
Đường biểu diễn vẽ lên mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với số lượng bản
DNA đích ban đầu có trong các mẫu chuẩn được gọi là đường biểu diễn chuẩn
(standard curve). Đây là một đường thẳng tuyến tính đi qua các điểm tọa độ
xác định bởi số lượng bản DNA đích ban đầu của từng mẫu chuẩn trên trục
tung) và chu kỳ ngưỡng của ống phản ứng chứa số lượng bản DNA đích này.
Trên biểu đồ chuẩn này, trục tung (Y) là Ct còn trục hoành (X) là số lượng bản
DNA đích ban đầu có trong các mẫu chuẩn. Do các mẫu chuẩn thường được
pha cách nhau theo hệ số pha loãng 10, nên số lượng bản DNA đích trong các
Đường biểu diễn khuếch
đại của các mẫu chuẩn