ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay Vệ Sinh An Toàn Thực Phẩm (VSATTP) là một trong những
vấn đề được ưu tiên hàng đầu của mọi quốc gia trên thế giới. VSATTP liên
quan trực tiếp tới sức khỏe con người. VSATTP không đảm bảo sẽ có thể gây
ra những tổn thất không nhỏ cho nền kinh tế. Ước tớnh mỗi năm có khoảng 3-
4 triệu người bị ngộ độc thực phẩm. Những năm qua, kinh tế nước ta được đổi
mới, phát triển và nhiều khởi sắc; đời sống nhân dân được cải thiện. Bên cạnh
đú cỏc vụ ngộ độc thức ăn vẫn xảy ra thường xuyên, khắp mọi nơi và ngày
càng nhiều mà nguyên nhõn chớnh là do nhiễm khuẩn
Có 2 dạng ngộ độc chính do vi sinh vật:
+ Do thực phẩm ăn bị nhiễm vi khuẩn: Salmonella, shigella, E. coli,Vibrio…
+ Do thực phẩm ăn bị nhiễm độc tố của vi khuẩn: độc tố của tụ cầu vàng
(Staphylococcus aureus), độc tố của vi khuẩn gây ngộ độc thịt (Clostridium
botulinum), độc tố của vi khuẩn gây nhiễm vào các loại ngũ cốc, gia vị, và các
loại thực phẩm khác Bacillus cereus (B.cereus)
Ngộ độc do nguyên nhân vi khuẩn chiếm khoảng 2/3 các vụ ngộ độc
thực phẩm. Trong số các căn nguyên vi khuẩn, B.cereus được biết đến như là
một trong những căn nguyên gây ngộ độc thực phẩm quan trọng ở các nước
phát triển và đang phát triển, nó đã và đang thu hút được sự quan tõm cả về
mặt lõm sàng lẫn chẩn đoán trong phòng xét nghiệm. B.cereus có trong mặt
khắp nơi trong môi trường, nó gõy bệnh bằng cách sinh độc tố. Tại châu Âu
từ năm 1973-1985 các vụ ngộ độc thực phẩm do B.cereus chiếm khoảng
17,8% các trường hợp ngộ độc thực phẩm [12], tại Hà Lan là 19% và ở Đài
Loan nó xếp thứ 3 trong các nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm
[16].Tại Norway từ năm 1988-1993 B.cereus chiếm khoảng 33% trong tổng
số các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm, ở Iceland từ năm 1985-1992 tỷ lệ
1
này là 47% và tỷ lệ thấp hơn ở các quốc gia khác: Mỹ là 1,3% và Canada là
2,2%. B.cereus được tìm thấy trong khoảng 25% sản phẩm thực phẩm lấy
mẫu: kem, bánh, thịt, khoai tây, sữa, gạo. Ô nhiễm của các sản phẩm thực
phẩm thường xảy ra trước khi nấu [26]

nghiên cứu sâu hơn về căn nguyên gây ngộ độc thực phẩm do B.cereus. Để
góp phần kiểm soát VSATTP, giảm chi phí xã hội thông qua việc ngăn ngừa
các vụ ngộ độc thực phẩm do B.cereus và nâng cao năng lực kiểm soát
VSATTP của các cơ quan chức năng. Đề tài “Nghiờn cứu xây dựng quy
trình phát hiện gen độc tố của B. cereus trong thực phẩm bằng kỹ thuật
multiplex PCR”
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1. Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện gen độc tố B. cereus bằng kỹ
thuật Multiplex-PCR ở quy mô phòng thí nghiệm.
2. Thử nghiệm quy trình trên để phát hiện gen độc tố của B.cereus trong
một số thực phẩm có nguồn từ gạo tại Hà nội.
3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. TÌNH HÌNH VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM
1.1.1 Trên thế giới
Ngày nay B.cereus được coi là một trong những căn nguyên quan trọng
gây ngộ độc thực phẩm mặc dù không phổ biến như Salmonella hoặc các loài
khỏc gõy bờnh qua thực phẩm [27]. Tuy nhiên số lượng chính xác về các
trường hợp ngộ độc thức ăn do B.cereus không được ghi nhận một cách đầy
đủ. Giữa năm 1972 và năm 1983 các trường hợp ngộ độc thức ăn do B.cereus
chiếm 2% tổng số các dịch bệnh truyền qua thực phẩm. Năm 1980: 9 ổ dịch
đã được báo cáo với trung tâm kiểm soát dịch bệnh, bao gồm các thực phẩm
như thịt bò, gà tây …. Năm 1981: 8 ổ dịch đã được báo cáo chủ yếu liên quan
đến gạo, còn nhiều vụ dịch khác không được báo cáo hoặc bị chẩn đoán sai
vỡ cỏc triệu chứng tương tự nhiễm độc Staphylococcus aureus (B.cereus loại
gây nôn) hoặc C.perfringens (B.cereus loại tiêu chảy) [24].
1.1.2 Ở Việt Nam
Việc ra đời của cục Vệ sinh An toàn Thực phẩm đã đánh dấu một bước
quan trọng trong công tác quản lý và chăm sóc sức khỏe cho nhân dân trong

Trên thế giới
Các vụ ngộ độc thực phẩm do B.cereus có thể gặp ở các nước phát triển
và đang phát triển. Thức ăn nhiễm độc B.cereus là một khái niệm phổ biến
khắp thế giới. Quá trình nấu chín không tiêu diệt được vi khuẩn này vì B.
Cereus có khả năng tạo thành dạng bào tử để tự vệ, do đó nếu ăn ngay sau khi
5
nấu thì bào tử không có cơ hội phục hồi, dưới các điều kiện bảo quản không
đúng sau khi nấu các bào tử nảy mầm, tạo thành các tế bào sinh dưỡng và
được nhân lên. Đặc biệt là cơm nhiễm B.cereus không hề có biểu hiện gì khác
thường về mùi vị, màu sắc nên không thể nhận biết, do vậy nhiều trường hợp
ngộ độc do cơm nguội chúng ta lại lại nghĩ đến nguyên nhân ngộ độc do các
loại thức ăn khác. B. Cereus có khả năng sản sinh rất nhanh có thể phát triển
trên nhiều loại thực phẩm khác nhau như: rau sống, giá đỗ, bơ sữa [44]. Đõy
là mối lo ngại về vệ sinh, an toàn thực phẩm cho nhiều quốc gia trên thế giới.
Vì vậy việc nghiên cứu về dịch tễ, cơ chế bệnh sinh, các độc tố của B.cereus
ngày càng được chú trọng.
B.cereus lần đầu tiên được Frankland phân lập và mô tả nào năm 1887.
Tuy nhiên, cho đến tận năm 1950, vi khuẩn này mới được Hauge và cộng sự
chứng minh là căn nguyên gây ra các vụ dịch ngộ độc thức ăn. Các vụ dịch
ngộ độc thức ăn do B.cereus với đặc điểm là nôn và tiêu chảy [18]. Để khẳng
định B.cereus là nguyên nhân gây ngộ độc, Hauge đó phỏt triển mẫu phân lập
đến nồng độ khoảng 4x10
6
/ml và uống 200ml cocktail. Sau 13h, ông cảm thấy
đau bụng và đi tiêu ra nhiều nước, triệu chứng này dai dẳng khoảng 8h. Hơn
20 năm sau, một triệu chứng gây ngộ độc thực phẩm khác do chủng B. cereus
gây ra lại xuất hiện ở cỏc cụng nhân người Anh. Triệu chứng này nặng hơn
triệu chứng nôn mửa và kéo dài một thời gian ngắn (chưa đến 5h), điều này
cho thấy rằng đây là một sự nhiễm độc
Việt Nam:

sót khi xử lý nhiệt và hóa chất [11], chúng có khả năng thích nghi với một
loạt các điều kiện môi trường, nó được phân phối rộng rãi trong tự nhiên như
trong bụi, đất, ở các loài động vật khác nhau, thường thấy trong những hạt
8
ngũ cốc, gạo, bột hoặc thực phẩm khô lẫn lộn chung với nhau như gạo, mì,
khoai, ngụ do bị nhiễm từ đất trong quá trình trồng trọt và thu hoạch [32]
Đặc điểm nuôi cấy:
• Là loại vi khuẩn dễ mọc trờn các môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông
thường
• Tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ 5-50
0
C, tối ưu ở 35-40
0
C
• pH 4,5-9,3, thích hợp ở pH 7-7,2
• Trên môi trường LB lỏng: đục
• Trên môi trường thạch MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin) và môi
trường thạch Mossel (cereus selective agar) vi khuẩn B. cereus mọc tạo thành
dạng khuẩn lạc có màu hồng phấn chung quanh có vòng sáng.
Tính chất sinh hóa:
• Trên môi trường đường: lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và kị khí,
• Khử nitrat thành nitrit.
• Phân giải Tyroxin
• Catalase (+), Citrate (+)
Theo phân loại quốc tế B.cereus :
• Ngành (phylum) firmicutes
• Thuộc giới bacteria
• Lớp (class) bacilli
• Bộ (order) Bacillales
• Họ (family) Bacillaceaem

C, có khả năng chịu các điều kiện của axit,
độc tố gõy nôn phát triển tốt trong thức ăn từ cơm, khoai tây nghiền,
thực phẩm có nhiều tinh bột và rau [9 ; 32],
10
Hình 1: Cấu trỳc hoỏ học của độc tố gây nôn
Tiêu chảy là do độc tố gây ly giải hồng cầu BL, độc tố ruột khụng gõy
ly giải hồng cầu và độc tố K. Độc tố liên quan đến hội chứng tiêu chảy
không bền với axit của dạ dày, độc tố tiêu chảy phát triển nhiều trong thực
phẩm từ rau, thịt, [32]. Độc tố tế bào K (cytK) của B.cereus là một yếu tố
quan trọng gây ngộ độc thực phẩm vì hoạt tính ly giải hồng cầu và gây độc
tế bào của nó.
Bào tử của B.cereus có khả năng bám vào các tế bào Caco-2 (tế bào
biểu mô của người). Sau khi bám vào, các bào tử này nảy mầm một cách
nhanh chóng (trong vòng 1h), hình thành tế bào B.cereus sinh dưỡng trên đỉnh
của các tế bào biểu mô, tiếp đó là sản sinh ra độc tố, nếu độc tố này xuất hiện
trong đường ruột, độc tố đường ruột sẽ tập trung khoanh vùng ở vùng ngoại
biên của ống ruột sẽ tăng cao hơn và vì vậy gây nên mối nguy lớn hơn và gây
bệnh một cách trầm trọng, thời gian ủ bệnh sẽ lâu hơn [44].
Ngoài gây ngộ độc thực phẩm B.cereus còn gây bệnh ở mắt trong
trường hợp viêm nội nhãn sau chấn thương có thể dẫn đến mất khả năng nhìn
nếu không được điều trị kịp thời. Việc nhiễm B.cereus cũng xuất hiện dự
khụng đặc hiệu ở những người bị ung thư, suy giảm miễn dịch và một số bệnh
11
khác. B.cereus cũng là một trong những nguyên nhân gây viêm vú và sảy thai
ở gia súc, và một số bệnh khác.
Bảng 1.1: So sánh độc tố gây tiêu chảy và độc tố gây nôn[33]
Đặc tính Độc tố gây tiêu chảy Độc tố gây nôn
Thành phần hóa
học Protein Cereulide
Độc tố được sản

buồn nôn. Buồn nôn, nôn mửa
Loại thực phẩm
thường gặp nhất
Sữa, sản phẩm của sữa, rau,
sản phẩm từ thịt
Cơm nấu chín hoặc
chiên, mì ống, phở
Bảng 1.2: Các loại độc tố của B.cereus
Độc tố Thành phần độc Protein Gen mó hoỏ
12
tố
Độc tố gây ly giải
hồng cầu (Hbl)
L2 HblC
L1 HblD
B HblA
Độc tố khụng gõy
ly giải hồng cầu
(Nhe)
NheA NheA
NheB NheB
NheC NheC
Đ ộc t ố T BceT
CytK-1 CytK-1
CytK-2 cytK-2
Độc tố FM EntFM EntFM
Độc tố gây nôn
(Cereulide)
Cereulide Ces
1.2.3 Triệu chứng lâm sàng

tính chất hóa sinh và miễn dịch.
- Ưu điểm của phương pháp này
• Thao tác đơn giản.
• Dễ làm.
• Không phải đầu tư dụng cụ và thiết bị đắt tiền.
- Nhược điểm
• Độ nhạy không cao.
• Thời gian để xác định tình trạng ô nhiễm thực phẩm do B.cereus lâu
(khoảng 5-7 ngày).
• Tốn nhiều nhân công, cần có kỹ thuật viên có kinh nghiệm về vi sinh vật.
• Không thể phát hiện được các chủng B.cereus này có hay không có
sinh độc tố do đó hạn chế trong công tác phòng ngừa.
• Tốn nhiều hóa chất.
• Yêu cầu kỹ năng thao tác.
14
1.2.4.2 Phương pháp miễn dịch
Phương pháp này dựa trên phản ứng của kháng thể đặc hiệu với kháng
nguyên bề mặt để phát hiện nhanh sự nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm.
- Ưu điểm
• Độ nhạy cao, cho phép phát hiện các sản phẩm ở mức độ khoảng 10 pg.
• Thời gian cho kết quả nhanh hơn các phương pháp xét
nghiệm truyền thống.
- Nhược điểm
Quy trình phức tạp, phải có những cán bộ kinh nghiệm và được đào
tạo bài bản mới có thể thực hiện được.
1.2.4.3 Phương pháp sinh học phân tử :
- Kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi men):
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR dựa trên sự thay đổi nhiệt độ ở 3 giai
đoạn khác nhau của quá trình phản ứng : giai đoạn biến tính, giai đoạn gắn
mồi và giai đoạn kéo dài. Đây là kỹ thuật nhân số lượng bản sao gen của độc tố vi

Nhược điểm: Cần máy móc, trang thiết bị hiện đại, điều kiện kỹ thuật cao.
1.2.5 Điều trị
Vi khuẩn B.cereus tạo ra 1 quang phổ β-lactamase rõ nét, do vậy chỳng
cú sức đề kháng với penicillin, ampicillin và cephalosporins, trimethoprim.
Trong 1 nghiên cứu, 54 mẫu chất phân lập từ mỏu đó thấy rằng tất cả các
chủng đều dễ bị ảnh hưởng bởi imipenem và vancomyxin, và tất cả đều nhạy
với chlroamphenicol, ciprofloxacin, erythromyxin và gentamicin. Các chủng
nhạy với clindamycin, erythromycin, chlroamphenicol, vancomycin,
aminoglycosides, tetraclycline và sulphonamides [20].
1.2.6 Phòng bệnh
Thực phẩm cần phải được ăn ngay sau khi nấu, nếu để lâu cần phải để
nguội nhanh chóng sau đó để trong môi trường lạnh.
1.2.7 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu về B.cereus.
1.2.7.1 Kỹ thuật PCR.
Trên thế giới, các kỹ thuật PCR đã được sử dụng để phát hiện các gen
đặc hiệu của B.cereus trong thực phẩm[13 ; 14 ; 16]. Kỹ thuật PCR không chỉ
giảm thời gian phát hiện B.cereus trong các mẫu thực phẩm, mà còn có thể
17
phát hiện được một cách chính xác các chủng B.cereus này có khả năng sinh
ra các độc tố hay không. Năm 2008, Jackson N.Ombui và cộng sự đã sử dụng
phương pháp Multiplex-PCR để xác định giới hạn lượng B.cereus có thể
phát hiện trong một số loại thực phẩm.
Nghiên cứu xây dựng qui trình phát hiện gen độc tố ruột của B.cereus
trong thực phẩm bằng kỹ thuật multiplex PCR là vấn đề cần thiết. Nó không
những giải quyết việc xác định nhanh các độc tố ruột của B.cereus, giỳp các
bác sĩ lâm sàng và dịch tễ cú cỏc biện pháp xử lý và điều trị kịp thời, mà còn
là tiền đề để phát triển kỹ thuật PCR trong xác định trực tiếp các căn nguyên
khác gõy ngộ độc thực phẩm. Có hai loại phản ứng PCR :
+ PCR đơn thực hiện với một cặp mồi duy nhất.
+ PCR đa mồi (Multiplex-PCR) thực hiện với nhiều cặp mồi trong cùng

năm 1990 trên cơ sở kỹ thuật PCR. Khác với kỹ thuật PCR thông thường
thường sử dụng các đoạn mồi bổ sung cho các trình tự đã biết, RAPD chỉ sử
dụng các mồi oligonucleotid được tổng hợp ngẫu nhiên từ 9 đến 12 base. Như
vậy, RAPD cho phép phát hiện tính đa hình mà không cần biết trước một
trình tự nucleotide nhất định. Tính đa hình này có thể sử dụng làm marker
phân tử hoặc dùng để lập bản đồ gen. Năm 1996 Ron S. Ronimus và cộng sự
đã sử dụng phương pháp RAPD-PCR để xác định Bacillus trong các thực
phẩm công nghiệp bị nhiễm.
Ưu điểm : Có độ nhạy và độ đặc hiệu cao khi phân biệt các loài khác nhau.
Nhược điểm: Phương pháp này rất nhạy cảm với điều kiện phản ứng
như chất lượng DNA, nồng độ muối ví dụ Mg
2
+ và tỷ lệ giữa mồi và đoạn
mẫu (template) và vì thế các kết quả không phải luôn trước sau như một.
19
1.2.7.4. Kỹ thuật điện di xung trường (PFGE, Pulsed-Field Gel Electrophoreis) [35]
Kỹ thuật PFGE lần đầu tiên được Schwartz và Cantor (1984) giới thiệu.
Mục đích của kỹ thuật này là tăng khả năng di động của các mảnh DNA có
kích thước lớn trong điện trường, do đó các thành phần gel và đệm hầu như
không thay đổi theo các phương pháp điện di thông thường. Tuy nhiên theo
phương pháp thông thường thì sự điện di liên quan đến sự di động của các
mảnh DNA có kích thước khác nhau trên gel agarose trong một trường điện
không đổi. Kết quả ở đây là phân tử lớn khó di động hơn phân tử nhỏ qua mắt
xích agarose, tạo ra sự tách biệt trong trường điện di. Trong trường hợp PFGE
làm thay đổi khả năng di động lại là trường điện tích thay đổi liên tục dẫn đến
các mảnh DNA có kích thước khác nhau thay đổi hướng di động. Như vậy kết
quả là các mảnh có kích thước khác nhau sẽ có khả năng di động khác nhau.
Kích thước càng lớn thì mức độ di động càng chậm. Sự di động khác nhau
của DNA chủ yếu phụ thuộc vào kích thước chứ không phải do gel agarose
như ở phương pháp điện di thông thường.

nhiờn trong phạm vi luận văn cao học này chúng tôi chỉ áp dụng hai kỹ thuật là :
- Phát hiện sự ô nhiễm của B.cereus trong thực phẩm thông qua phát hiện
các gen độc tố của B.cereus trong các mẫu thực phẩm bằng kỹ thuật
Multiplex-PCR.
- Kỹ thuật giải mã trình tự gen (sequencing) nhằm khẳng định chắc chắn
các gen độc tố phát hiện từ các mẫu thực phẩm trong nghiên cứu của chúng
21
tôi tương đồng 99-100% (giống hệt) với các trình tự gen độc tố chuẩn của
B.cereus trong ngân hàng gen mà đã được thế giới công nhận.
22
CHƯƠNG 2
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 1
- Chủng B.cereus chuẩn quốc tế ATCC4342 cú cỏc gen độc tố bceT,
nheA, hblA và hblD được sử dụng để xây dựng qui trình kỹ thuật multiplex
PCR phát hiện các gen độc tố.
- Chủng E. coli, Salmonelle và Klebsiella không có gen độc tố được sử
dụng làm chứng âm
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 2
- Các mẫu thực phẩm bán tại các chợ ở Hà Nội bao gồm: Bánh phở, bún,
cơm, cơm nắm, cơm rang, bánh dày và xụi xộo. Đây là các thực phẩm có
nguồn gốc từ gạo, giàu tinh bột, là môi trường thuận lợi cho B.cereus phát
triển được lựa chọn cho nghiên cứu và phải đảm bảo các tiêu chuẩn:
+ Tối thiểu 100g/mẫu.
+ Đại diện cho cỏc lụ thực phẩm.
+ Được đựng vào cỏc tỳi vô trùng.
+ Các mẫu được giữ trong tủ lạnh nhiệt độ từ 0-5
0
C hoặc ở -20

AAT CAA GAG CTG TCA CGA AT
Độc tố
gây tiêu
429
Genbank No :
U63928
hblD-R
CAC CAA TTG ACC ATG CTA AT
- Dung dịch tách triết DNA khuôn mẫu : TE (Tris-EDTA)
- Dung dịch MgCl
2
25mM (Invitrogen)
- Taq DNA polymerase (Invitrogen)
- Hỗn hợp dNTPs 2,5mM (Invitrogen)
- Nước siêu sạch
- Đệm tra mẫu : Gel Loading Buffer
- Thạch điện di (electrophoresis agar, Invitrogen)
- Thang DNA chuẩn (DNA ladder, Invitrogen)
- Dung dịch đệm TAE (Invitrogen)
- Ethidium bromide
- Kít tinh sạch DNA (Qiagen)
24
- Kít Tag DyeDeoxiTerminator Cycle sequencing (Amersham)
2.2.1.2 Máy móc và dụng cụ
- Máy luân nhiệt PCR: Amp PCR System 9700 (USA); Effpendorf (Đức)
- Máy đọc trình tự gen ABI (Applied Biosystem)
- Máy điện di ngang Mupid (Nhật Bản)
- Máy soi gel và chụp ảnh tự động: Chemidoc EQ-Bio-Rad (USA)
- Máy đo nồng độ DNA và độ dục vi khuẩn Eppendorf (Đức)
- Máy li tâm lạnh Beckman (USA) và ly tâm để bàn Eppendorf (Đức)