MỤC LỤC

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3

1.1. Dịch tễ học của các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm
khuẩn huyết ở người 3

1.1.1. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm
khuẩn huyết trên thế giới 3

1.1.2. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở Việt
Nam 7

1.2. Đặc điểm của một số loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở người. 8

1.2.1. Vi khuẩn Escherichia coli 8

1.2.2. Klebsiella pneumoniae 9

1.2.3. Salmonella sp 10

1.2.4. Proteus mirabilis 12

1.2.5. Nhóm các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaece 12

1.3.Phương pháp chẩn đoán xác định vi khuẩn gây bệnh 13

1.3.1. Kỹ thuật xét nghiệm truyền thống phát hiện vi khuẩn 13

1.3.2. Phương pháp sử dụng sinh học phân tử phát hiện vi khuẩn 14


2.4.4. Tách chiết ADN từ các mẫu bệnh phẩm 27

2.4.5. Phương pháp xác định nồng độ và đo độ tinh sạch bằng máy quang phổ 28

2.4.6. Kỹ thuật PCR và PCR đa mồi 28

2.4.8. Giải trình tự gen 30

2.4.9. Đánh giá độ nhạy, đặc hiệu phản ứng PCR đa mồi 31

2.4.10. Phương pháp xử lý số liệu bằng toán thống kê 33

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI PHÁT
HIỆN VI KHUẨN 34

3.1.1. Kết quả tách chiết ADN trên chủng vi sinh 34

3.1.2. Kết quả PCR đơn mồi từ các mầm bệnh đơn lẻ 34

3.1.3.Kết quả giải trình tự gen các mầm bệnh 35

3.1.3.1. Kết quả xác định trình tự đoạn gen 16S ribosomal RNA của họ
Enterobacteriaceae 36

3.1.3.2. Kết quả xác định trình tự đoạn gen flagellin của vi khuẩn Salmonella 37

3.1.3.3. Kết quả xác định trình tự gen aldehyde dehydrogenase của vi khuẩn K.
pneumoniae 38

dụng kit thương mại MolYsis 50

3.2.3.3.Kiểm chứng hàm lượng ADN vi khuẩn thu nhận sau khi xử lý bằng dung
môi phá bạch cầu 52

3.3. KẾT QUẢ SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN VI
KHUẨN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

KIẾN NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤCDANH MỤC HÌNH

Hình.1 Các giai đoạn tổng hợp của phản ứng PCR 15

Hình 2. Mô hình thí nghiệm thực hiện quá trình tối ưu hóa PCR đa mồi 22

Hình 3. Mô hình nghiên cứu thiết lập phương pháp loại bỏ ADN người 23

Hình.4. Hình ảnh mô phỏng cho quá trình thiết kế mồi phát hiện vi khuẩn gây bệnh24

Hình 5. Hình ảnh mô phỏng kết quả điện di các sản phẩm PCR phát hiện vi khuẩn
gây bệnh 26


SHPT108@dehumanDNA 52

Hình. 19. Sơ đồ so sánh kết quả PCR đa mồi và cấy máu 54
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1
.
Sự phân bố các mầm bệnh gây NKH từ năm 1990 đến 2010 của 17 nghiên
cứu khác nhau ở khu vực gần Việt Nam (Nam và Đông Nam Châu
Á) 4

Bảng 2. Danh mục các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 21

Bảng 3. Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 21

Bảng.4. Trình tự mồi trong phản ứng PCR đa mồi phát hiện tác nhân vi khuẩn gây
bệnh 25

Bảng 5. Công thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu phương pháp 32

Bảng 6. Kết quả đo OD các mẫu ADN sử dụng trong nghiên cứu 34

Bảng 7. Kết quả độ nhạy, độ đặc hiệu bộ mồi Ent/beta và EPKS thiết kế trên các
loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriacae và ADN khác 44

Bảng8: Hàm lượng và chất lượng ADN thu nhận từ 1ml máu ngoại vi chứa vi khuẩn
E.coli 48


Sp Độ đặc hiệu
X

Giá trị trung bình

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhiễm trùng là một bệnh lý thường gặp, trong đó nhiễm trùng đường máu
(nhiễm khuẩn huyết) gây biến chứng và nguy cơ tử vong cao nhất. Có nhiều căn
nguyên khác nhau gây ra bệnh lý nhiễm trùng như vi khuẩn, kí sinh trùng và nấm.
Tuy nhiên, các nghiên cứu ở Việt Nam cũng như trên thế giới chỉ ra rằng tác nhân
gây bệnh chủ yếu là vi khuẩn trong đó nhiều nhất là các loài thuộc họ
Enterobacteriaceae như Escherichia coli, Klebsiella. sp và Staphylococcus aureus.
Việc xác định căn nguyên gây nhiễm khuẩn là cần thiết cho việc chỉ định
đúng kháng sinh trong điều trị. Cho đến nay cấy khuẩn vẫn là phương pháp được
áp dụng thường quy trong chẩn đoán các mầm bệnh gây nhiễm trùng. Tuy nhiên
phương pháp kinh điển này đang thể hiện một số điểm yếu trong chẩn đoán, đó là i)
thời gian cấy khuẩn dài (từ 18-72h). Trong khoảng thời gian này tình trạng của bệnh
nhân có thể chuyển sang một pha mới nguy hiểm hơn, ii) các quy trình cấy khuẩn
không được tối ưu cho nuôi cấy mọi vi khuẩn, đặc biệt là các vi khuẩn yếm khí
cộng thêm việc xử lý kháng sinh phổ rộng trước đó cũng gây áp lực áp chế sự hình
thành khuẩn lạc sau nuôi cấy, iii) Chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết đòi hỏi một lượng
máu lớn sẽ là thách thức đối với bệnh nhân nhi sơ sinh hoặc người cao tuổi. Do đó,
việc triển khai những kỹ thuật chẩn đoán mới bổ trợ cho phương pháp cấy khuẩn
kinh điển là điều cần làm.
Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) không còn
là điều mới mẻ trong sinh học phân tử, tuy nhiên ứng dụng của nó trong chẩn đoán,
đặc biệt là chẩn đoán các mầm bệnh gây nhiễm trùng vẫn dừng ở mức tiềm năng là
vì: i)Mỗi một phản ứng PCR chỉ xác định được 01 loài vi sinh vật, trong khi đó nếu

CHƯƠNG 1.
TỔNG QUAN
1.1. Dịch tễ học của các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm
khuẩn huyết ở người
1.1.1. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm
khuẩn huyết trên thế giới
Nhiễm khuẩn huyết (NKH) là một trong những bệnh lý được quan tâm bởi tỷ
lệ mắc bệnh, tử vong cao. Một trong những nguyên nhân gây tử vong cao đó là do
các vi khuẩn đa kháng kháng sinh. Triệu chứng lâm sàng của NKH không đặc hiệu
và không khẳng định, thường chỉ biểu hiện rõ trong giai đoạn trễ. Các marker sinh
học - đặc biệt là các cytokin có vai trò quan trọng, giúp phát hiện và đánh giá mức
độ nặng của tình trạng viêm, phân biệt tác nhân là vi khuẩn, góp phần giúp thầy
thuốc chẩn đoán và điều trị kịp thời NKH trong giai đoạn “giờ vàng”, rút ngắn thời
gian nằm viện và giảm tỉ lệ tử vong của bệnh nhân. NKH có xu hướng gia tăng và
do các nguyên nhân xác định. Trong đó, bệnh lý nhiễm trùng đường hô hấp luôn là
nguyên nhân phổ biến dẫn tới NKH hay sôc nhiễm khuẩn [30]. Nhìn chung, nhiễm
trùng đường hô hấp chiếm khoảng một nửa số ca NKH. Ngoài ra, còn có các
nguyên nhân khác như nhiễm khuẩn đường sinh dục, nhiễm khuẩn ổ bụng. Với các
nguyên nhân gây bệnh khác nhau nhưng việc sử dụng kháng sinh sớm là điều tiên
quyết trong điều trị khỏi bệnh cho bệnh nhân. Nghiên cứu của Houck PM ở những
bệnh nhân viêm phổi và bệnh nhân NKH chỉ ra rằng việc sử dụng kháng sinh chậm
trễ trong điều trị kháng sinh nguy cơ dẫn tới tử vong tăng lên đáng kể. Đặc biệt với
nhiễm khuẩn, nguy cơ tử vong tăng lên khoảng 10% trong mỗi giờ chậm trễ [21].
Song song với việc sử dụng kháng sinh sớm thì việc lựa chọn kháng sinh thích hợp
cũng rất quan trọng. Cùng với đó, việc điều trị kháng sinh hiện nay nếu chờ đợi dựa
vào kết quả cấy máu thì quá lâu nên nhiều khi các bác sỹ lâm sàng buộc phải điều
trị bệnh nhân theo kinh nghiệm tích lũy. Như vậy mặt tích cực là sử dụng kháng
sinh sớm nhưng lại trở nên gặp khó khăn trong việc lựa chọn sử dụng kháng sinh
thích hợp để điều trị. Do vậy, nhờ sự phát triển của nền sinh học phân tử hiện đại,
4

5

mầm bệnh vi sinh khuẩn khác thường gặp ở người lớn như S. aureus, E. coli và
nhóm vi khuẩn Gram âm khác. Vi khuẩn thường gặp ở trẻ em như S. pneumoniae,
H. influenzae. Kết quả được thể hiện ở Bảng 1 dưới đây:
Bảng 2
.
Sự phân bố các mầm bệnh gây NKH từ năm 1990 đến 2010 của 17
nghiên cứu khác nhau ở khu vực gần Việt Nam (Nam và Đông Nam Châu Á)
[12]

Tính chung
(n; %)
Người lớn
(n; %)
Trẻ em
(n; %)
Enterobacteriaceae Gram âm 2132 (60,6) 1392 (77,4) 740 (42,9)
Salmonella enteric
S enterica serotype Typhi 964 (27,4) 532 (29,6) 432 (25,1)
Non-typhoidal Salmonella 170 (4,8) 148 (8,2) 22 (1,3)
Non-Salmonella Enterobacteriaceae
Escherichia coli 240 (6,8) 215 (12,0) 25 (1,5)
Klebsiella sp 156 (4,4) 137 (7,6) 19 (1,1)
Enterobacter sp 29 (0,8) 26 (1,4) 3 (0,2)
Proteus sp 10 (0,3) 8 (0,4) 2 (0,1)
Citrobacter sp 8 (0,2) 8 (0,4) 0 (0)
Shigella sp 3 (0,1) 1 (0,1) 2 (0,1)
Other Enterobacteriaceae 11 (0,3) 5 (0,3) 6 (0,3)
Các VK Gram âm khác,

24 (0,7) 22 (1,2) 2 (0,1)
Other streptococci 27 (0,8) 10 (0,6) 17 (1,0)
Các Gram dương khác 17 (0,5) 16 (0,9) 1 (0,1)
Không xác định 12 (0,3) 11 (0,6) 1 (0,1)
Nấm
43 (1,2) 43 (2,4) 0 (0)
Cryptococcus spp 33 (0,9) 33 (1,8) 0 (0)
Candida spp 2 (0,1) 2 (0,1) 0 (0)
Histoplasma capsulatum 4 (0,1) 4 (0,2) 0 (0)
Penicillium marneffei 4 (0,1) 4 (0,2) 0 (0)
Mycobacteria
57 (1,6) 57 (3,2) 0 (0)
Mycobacterium
tuberculosis complex
27 (0,8) 27 (1,5) 0 (0)
Mycobacterium avium complex 24 (0,7) 24 (1,3) 0 (0)
Other mycobacteria 6 (0,2) 6 (0,3) 0 (0)
Nguyên nhân khác
663 (18,8) 1 (0,1) 662 (38,4)
7

Như vậy, các nghiên cứu trên cũng đã phản ánh rõ ràng về tần suất xuất hiện
các vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm cao hơn nhóm vi khuẩn Gram dương,
đặc biệt là họ vi khuẩn Enterobacteriaceae như Escherichia coli, Klebsiella spp,
Enterobacter spp, Proteus spp, Salmonella sp và Enterobacteriaceae khác là những
tác nhân hàng đầu gây bệnh lý NKH.
1.1.2. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở Việt
Nam
Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về các căn nguyên vi sinh vật gây
bệnh ở người trên các thể bệnh khác nhau như viêm tiết niệu, nhiễm trùng vết mổ,

nguyên chính gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp nhất, mức độ gây hại lớn vẫn tập
trung vào nhóm vi khuẩn Gram âm, đặc biệt là các loài vi khuẩn thuộc họ
Enterobacteriaceae. Điều này cho thấy, trong thực hành lâm sàng tại Bệnh viện,
việc chẩn đoán xác định chính xác và nhanh chóng chúng là việc làm rất cần thiết.
1.2. Đặc điểm của một số loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở
người.
Enterobacteriaceae là các chi vi khuẩn đường ruột Gram âm có hình que,
chiều dài điển hình từ 1 μm đến 5 μm kị khí không nghiêm ngặt, lên men đường
thành acid lactic. Hầu hết chúng khử nitrat thành nitrit, ngoại trừ một số vi khuẩn
như Photorhabdus. Trong lâm sàng vi khuẩn Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Proteus mirabilis và Salmonella sp chiếm trên 90% số các vi khuẩn
thuộc họ Enterobacteriaceae đã được nhận diện.
1.2.1. Vi khuẩn Escherichia coli
Vi khuẩn E. coli được Theodor Escherich tìm ra năm 1885 và mang tên
chính thức là Escherichia coli năm 1919. Vi khuẩn E. coli thường sống trong ruột.
Đây là trực khuẩn Gram âm điển hình với kích thước trung bình từ 2-3 µm x 0.5
µm, có lông quanh thân nên di động được, không có bào tử, có một tỷ lệ nhỏ các
chủng có vỏ. Vừa ưa khí, vừa kỵ khí, dễ nuôi, phát triển dễ dàng trên các môi
trường thông thường mọc được ở nhiệt độ từ 5 đến 40
0
C, thuận lợi ở 37
0
C, pH thích
9

hợp 7,0 đến 7,2, nhưng vẫn phát triển ở pH 5,5 đến 8,0. Trên môi trường thạch
thường sau 8-10 giờ nuôi cấy đã có thể nhìn thấy khuẩn lạc riêng rẽ qua kính phóng
đại. Khuẩn lạc to dần, tròn, lồi, hơi phồng, đường kính 1,5mm, mặt nhẵn, bờ đều
[37]. Vi khuẩn E. coli là một trong những thành viên chính của hệ vi khuẩn bình
thường ở ruột. Tuy nhiên, trong những điều kiện thuận lợ, chính E. coli lại là căn

khuẩn này khá đa dạng.

Klebsiella pneumoniae chủ yếu gây bệnh cơ hội, ở cộng
đồng hoặc trong bệnh viện - là một căn nguyên gây viêm phổi và thường gặp ở trẻ
sơ sinh, tỷ lệ tử vong cao nếu không được điều trị sớm [5], [37]. Ngoài ra nó còn có
khả năng gây NKH, viêm màng não, viêm tai giữa, viêm xoang, nhiễm khuẩn
đường tiết niệu,…Theo các tác giả Mỹ cho thấy Klebsiella spp đóng vai trò quan
trọng trong NKH cả bệnh viện và cộng đồng chiếm tỷ lệ 4- 17% trong các trường
hợp NKH nói chung. Tỷ lệ tử vong do Klebsiella sp cao từ 20-60 % tùy đối tượng
và địa phương khác nhau. Theo Hang J.B cho thấy tỷ lệ Klebsiella spp gây NKH ở
Nauy từ 4,1đến 8,5 %.
Nguồn lây vi khuẩn này chủ yếu từ đường ruột hoặc có thể xâm nhập theo các
đường khác nhau như dụng cụ phẫu thuật, ống dẫn lưu, ống thông tiểu. Klebsiella
bám vào niêm mạc đường hô hấp, đường tiết niệu nhờ fimbriae và một số kết dính
có khả năng ức chế manose.Vi khuẩn này có khả năng xâm nhập vào mô hoặc tuần
hoàn gây ra tình trạng bệnh nghiêm trọng. Một điều đáng lưu ý, song song với cơ
chế gây độc thì vi khuẩn này còn có sự đề kháng kháng sinh mạnh, đặc biệt là đối
với những bệnh nhân sử dụng kháng sinh không phù hợp [5].
1.2.3. Salmonella sp
Salmonella là một trong những tác nhân hàng đầu gây bệnh ở đường ruột ở
các nước. Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình dài khoảng 2-3
µm và rộng khoảng 0,5-1,0 µm. Chi này hiếu khí tùy tiện, phát triển được trên môi
trường nuôi cấy thông thường, không lên men lactose, lên men đường glucose
thường sinh hơi…
Salmonella là một trong những chi quan trọng nhất thuộc họ vi khuẩn đường
ruột. Đến nay hơn 2500 type huyết thanh Salmonella đã được xác định. Những
Salmonella gây bệnh ở người thường được xếp thành hai loại: các Salmonella gây
11

bệnh thương hàn (Salmonella Typhi) và Salmonella gây bệnh khác. Các Salmonella

thiểu nguy cơ biến chứng cho bệnh nhân. Chính vì vậy ngày nay các phương pháp
sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử lại được chú ý đến bởi tính nhanh, nhạy và đặc
hiệu. Đối với vi khuẩn này, có nhiều dấu ấn sinh học phân tử để nhận biết đó là các
gen độc lực, gen mã hóa cho các kháng nguyên đặc trưng, một số phải kể đến như
gen Salmonella plasmid virulence (spv), invA gen, 16s rRNA [19]…
1.2.4. Proteus mirabilis
Proteus là trực khuẩn, Gram âm, kích thước dài khoảng từ 0,4 đến 0,8 µm và
rộng khoảng từ 1,0 đến 3,0 µm, di động dễ dàng bằng các tiên mao. Kỵ khí tùy tiện,
là vi sinh vật dị dưỡng, có cả hai kiểu trao đổi chất: hô hấp và lên men. Nhiệt độ
tăng trưởng tối ưu là 37
0
C. Proteus thuộc ngành Proteobacteria, lớp Gamma
Proteobacteria, dòng Enterobacteiales, họ Enterobacteriaceae. Dựa vào tính chất
sinh vật hóa học người ta phân loại Proteus thành các loài: Proteus mirabilis,
Proteus vulgaris, Proteus myxofaciens, Proteus penneri, Proteus là vi khuẩn “gây
bệnh cơ hội”. Có khả năng gây bệnh cho con người, tạo ra enzyme protease phân
giải protein làm nhiễm trùng ống niệu, và gây ra những thương tổn khác cho cơ thể.
Ngộ độc Proteus vi khuẩn này nhiễm trong thịt và các sản phẩm thịt có thể gây ngộ
độc cho người. Ngoài enzyme protease, vi khuẩn này còn có các yếu tố độc lực và
các nội độc tố khác như hemolysin, flagella, immunoglobulin A(IgA),….[24]
Như đã nói đến ở trên, vi khuẩn Proteus mirabilis là vi khuẩn cơ hội thường
gây viêm tiết niệu, đây cũng được xác định là một cửa vào gây NKH trong trường
hợp nhiễm trùng đường niệu nặng, có tổn thương. Do vậy, việc xác định vi khuẩn
này sớm giúp ích cho việc điều trị cho bệnh nhân.
1.2.5. Nhóm các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaece
Ngoài các vi khuẩn kể tên trên như E. coli, K. pneumoniae, Samonella sp,
Proteus sp còn có các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaece như Citrobacter
sp, Enterobacter spp, Shigella sp, Yersinia sp…Những vi khuẩn này thường gây
bệnh đường ruột mà ít khi là tác nhân gây NKH [20].
13


c. Chẩn đoán ngưng kết
- Thử nghiệm ngưng kết trên phiến kính: Dựa trên nguyên lý của phản ứng kết
hợp kháng nguyên vỏ của vi khuẩn với kháng thể đặc hiệu tương ứng tạo sự ngưng
kết. Trên thị trường thương mại các sinh phẩm sử dụng cho thử nghiệm ngưng kết
trên phiến luôn có sẵn, giúp cho việc xác định các khuẩn lạc nghi ngờ có phải là vi
khuẩn nào gây bệnh.
- Chẩn đoán huyết thanh học: Phương pháp chơng pn huyết bchơng pếchthanh
của bệnh nhân, dựa trên cơ sở: huyết thanh người mắc bệnh có chứa kháng thể phản
ứng đặc hiệu với yếu tố gây bệnh (kháng nguyên), thường là vi khuẩn (phản ứng
ngưng kết kháng nguyên - kháng thể) được gọi là thử nghiệm Elisa. Phức hợp
kháng nguyên-kháng thể sẽ được nhận biết bởi cộng hợp kháng huyết thanh tương
ứng gắn với enzyme peroxidaza hoặc phosphataza gây chuyển mầu cơ chất phù
hợp. Kết quả phản ứng được đo bằng thiết bị đo quang phổ và thông qua độ đậm
đặc khác nhau của mầu sắc mà đánh giá mức độ phản ứng của mẫu xét nghiệm [23],
[37].
1.3.2. Phương pháp sử dụng sinh học phân tử phát hiện vi khuẩn
1.3.2.1.Kỹ thuật PCR
Polymerase Chain Reaction (PCR) là một kỹ thuật cho phép khuếch đại các
trình tự ADN đặc hiệu được Kary Mullis phát minh vào năm 1985 và được Saiki và
cộng sự phát triển sau này. Kỹ thuật đã được áp dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh
vực như khoa học hình sự, mô bệnh học, các chẩn đoán trước sinh và chẩn đoán các
mầm bệnh.
Nguyên lý cơ bản của PCR
Đây là kỹ thuật in vitro cho phép nhân nhanh một đoạn gen mong muốn lên
hàng triệu lần trong một thời gian ngắn nhờ hai đoạn mồi oligonucleotide gắn với
hai đầu 3’ ở cả hai sợi của đoạn ADN đích (target sequence) với sự tham gia của
15

ADN polymerase. Phản ứng PCR là một chuỗi chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ

16

Do kỹ thuật và phản ứng PCR rất nhạy nên phải tránh sự nhiễm chéo giữa
các ADN khác có trong phòng thí nghiệm và điều kiện làm việc thực hiện các phản
ứng phải nghiêm ngặt.
1.3.2.2. Kỹ thuật PCR đa mồi (PCR đa mồi)
PCR là một trong những kỹ thuật phổ biến hiện nay trong nghiên cứu và
được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán. Tuy nhiên, chẩn đoán bằng PCR có nhược
điểm là chỉ thực hiện được phản ứng đơn lẻ phát hiện một tác nhân vi khuẩn gây
bệnh, như vậy giá thành sẽ cao. Để tăng cường khả năng chẩn đoán và vượt qua
những thiếu sót của PCR, Chamberlain và cộng sự là những người đầu tiên mô tả,
phát triển kỹ thuật PCR đa mồi vào năm 1988. Trong kỹ thuật PCR đa mồi, nhiều
gen đích được khuếch đại cùng một lúc bằng nhiều cặp mồi trong cùng một phản
ứng. Kỹ thuật PCR đa mồi tiết kiệm thời gian, công sức và đóng vai trò rất quan
trọng trong chẩn đoán phân tử bao gồm phân tích đột biến gen, tính đa hình ADN,
phân tích định lượng, phân tích đột biến [10]
Trong lĩnh vực bệnh truyền nhiễm, kỹ thuật này rất có giá trị trong chẩn đoán
xác định virut, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng và xác định kiểu gen [9, 17, 39]. Xét
nghiệm chẩn đoán xác định sự có mặt của mầm bệnh dựa trên sự tồn tại của axit
nhân của vi sinh vật trong chẩn đoán NKH có thể được chia ra thành 2 nhóm: (i)
xác định ADN của mầm bệnh từ chai nuôi cấy và (ii) xác định vi sinh vật trực tiếp
từ máu, huyết thanh/huyết tương. Hiện nay, người ta có thể chia thành ba chiến lược
khác nhau trong thiết kế các xét nghiệm xác định các ADN của mầm bệnh. Chiến
lược thứ nhất là thiết kế các bộ mồi (primers) đặc hiệu cho từng mầm bệnh; chiến
lược thứ hai là thiết kế các bộ mồi có thể bắt cặp với một đoạn gen chung cho nhiều
mầm bệnh như khu vực 16S, 5S, và 23S của rRNA hoặc 18S; 5,8S; và 28S
ribosomal của DNAs (rDNAs); chiến lược thứ ba là áp dụng PCR đa mồi để phát
hiện đồng thời nhiều mầm bệnh. Việc nghiên cứu phân tử rRNA là phương pháp
hữu hiệu nhất được sử dụng để xác định mối quan hệ, tiến hóa của các vi sinh vật,
vì rRNA có mặt ở tất cả các loại vi sinh vật, có khả năng xác định, có tính bảo thủ

DNA vi khuẩn nếu mật độ của chúng vượt quá ngưỡng 500 CFU/ml. Vì thế với
18

trường hợp bệnh nhân nhiễm khuẩn nhập viện có mật độ vi khuẩn trong máu quá
thấp dưới ngưỡng phát hiện, khi đó phương pháp này sẽ không thể phát hiện được,
gây nên hiện tượng âm tính giả. Ở một khía cạnh khác, các giả thuyết gần đây cho
rằng sự tiến hoá hình thành tế bào nhân chuẩn (bao gồm cả tế bào người) là kết quả
của sự lai ghép giữa nhóm archaeal với proteobacterial hoặc cyanobacterial
prokaryote, điều này có nghĩa sẽ tồn tại các trình tự tương đồng có tính bảo tồn cao
giữa các nhóm tế bào vi khuẩn, nấm men và tế bào động vật có vú bao gồm cả tế
bào người [16], [29], [33], [38]. Vì thế nếu phản ứng PCR sử dụng các chuỗi mồi có
trình tự bắt cặp và khuếch đại các khu vực bảo tồn cao (thuật ngữ tiếng Anh là
highly conserved motif), hiện tượng dương tính giả sẽ xuất hiện. Để hạn chế các
hiện tượng âm tính giả do độ nhạy kỹ thuật thấp và dương tính giả do bắt cặp của
mồi vào khu vực bảo tồn giữa các loài, người ta có thể sử dụng các Kit loại bỏ ADN
người kết hợp làm giàu ADN vi khuẩn sau đó mới thực hiện các phản ứng PCR đặc
hiệu [16].
Thông thường một Kit loại bỏ ADN người thường bao gồm các thành phần i)
giúp phá vỡ tế bào máu tổng số đồng thời gây đứt gãy ADN người, thông thường
các hoá chất này sẽ không làm tổn thương tế bào vi khuẩn ii) thu nhận và tách đặc
hiệu ADN vi khuẩn. Hiện nay Kít làm giàu ADN vi khuẩn do hãng MolYsis, có thể
cho hiệu quả làm giàu 40000 lần nhưng giá thành rất cao (khoảng £10/lần tách) [31]
vì thế rất khó được chấp nhận ở những nước thu nhập thấp trong đó có Việt Nam.
Để khắc phục những khó khăn trên, chúng tôi thiết lập phương pháp loại bỏ ADN
người kết hợp làm giàu ADN vi khuẩn: Ý tưởng kỹ thuật này là một điểm mới chưa
từng được triển khai tại bất cứ phòng thí nghiệm hay trung tâm chẩn đoán nào ở
nước ta. Các bệnh phẩm máu ngoại vi hoặc các dịch cơ thể có nghi ngờ mang vi
khuẩn được rửa bằng dịch phá bạch cầu Mammalian cellular lysis (MCLB1) [14],
[31], nhờ đó loại bỏ các thành phần ức chế phản ứng PCR như heparin, huyết sắc tố.
1.3.3.2. Cơ sở lý thuyết của công nghệ loại bỏ ADN người ”làm giàu” ADN vi