Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
Chương 1: Mở Đầu
1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay công nghệ sinh học là một lónh vực đang phát triển và có nhiều
tiềm năng lớn. Việt Nam cũng đã từng bước tạo điều kiện để phát triển công
nghệ sinh học, đặc biệt là những ứng dụng trong nông nghiệp và cả trong công
nghiệp.
Probiotic một thành quả khoa học, một thành quả của công nghệ sinh học.
Nó đang được ứng dụng rộng rãi vào đời sống con người bởi ví tính hợp lý và
hiệu quả mà nó thể hiện. Hiệu quả tác dụng của probiotic không chỉ đơn thuần
là làm thức ăn ngon hơn mà có rất nhiều tác dụng, như: tiêu hoá thức ăn và làm
bớt sự rối loạn tiêu hoá; đẩy mạnh sự tổng hợp vitamin B và một số enzyme
tiêu hoá; cải thiện sự dung nạp lactose; cải thiện chức năng miễn dòch; ngăn
chặn những chỗ loét trong hệ thống tiêu hoá; ngăn chăn chứng viêm; giảm
cholesterol; giảm tỷ lệ chết non; làm giảm số lượng vi khuẩn gây hại; tăng
trọng nhanh…
Trên quan điểm về an toàn sinh học, an toàn thiết thực thì probiotic đang
chiếm thế thượng phong so với một số phương cách khác. Vì tính hiệu quả của
probiotic (tính trò bệnh) là sự điều hoà tự nhiên không làm tồn dư kháng sinh,
tồn dư tác hại trong sinh vật chủ. Mà với sự khắt khe của con người thì điều này
là số một.
Như đã biết trước đây và cả hiện nay nhiều nông dân sử dụng chất kháng
sinh trong chăn nuôi như là biện pháp tối ưu nhất bởi những lợi ích mà nó mang
lại như:
• Tăng năng suất sinh trưởng và sinh sản ở gia súc, gia cầm
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 1
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
• Tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, làm cho vật nuôi thích ứng nhanh
chóng với sự thay đổi bất thường về cơ cấu và chủng loại nguyên liệu trong
khẩu phần ăn

thúc đẩy khoa học phát triển. “ Probiotic” là một phần của sự phát triển ấy.
Để có thể có một chế phẩm probiotic có đầy đủ những hoạt tính cần thiết,
khâu chọn lọc chủng vi khuẩn để làm probiotic là cực kì quan trọng. Bởi vì ngay
tại khâu này sẽ quyết đònh vai trò và tác dụng của chế phẩm lên đối tượng cần
quan tâm. Tuy nhiên, trong phạm vi nhỏ hẹp của nghiên cứu này, tôi chỉ thực
hiện đề tài ở bước kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật vì thời gian thực hiện đề
tài chỉ trong 12 tuần không cho phép tôi thực hiệân hoàn chỉnh tất cả các tiêu chí
tuyển chọn Probiotic. Chính vì thếø tôi đã chọn đề tài “THỬ NGHIỆM VÀ SO
SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐO HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT
CỦA VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC ĐỂ CHỌN CHỦNG TIỀM NĂNG
PROBIOTIC”.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Thử nghiệm và so sánh các phương pháp đo hoạt tính kháng vi sinh vật của
vi khuẩn lên men lactic.
Chọn lọc vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính probiotic.
1.3. Đối tượng nghiên cứu
Vì thời gian hạn hẹp, đề tài chỉ tập trung ở những đối tượng sau :
- Vi khuẩn lên men lactic có nguồn gốc từ thực phẩm lên men ( cà muối,
dưa muối, nem, sữa lên men) và có nguồn gốc từ các chế phẩm dược.
- Vi sinh vật chỉ thò Escherichia coli.
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 3
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
1.4. Phương pháp nghiên cứu
1.4.1. Phương pháp luận
Trước khi bắt tay vào thực hiện đề tài này, tôi đã tham khảo khá nhiều các
nghiên cứu từ trước tới nay về probiotic cũng như các phương pháp tuyển chọn
nó. Nhận thấy có khá nhiều phương pháp được sử dụng để thực hiện việc chọn
lọc này, tôi đã xem xét và chọn ra những phương pháp điển hình nhất cho đề tài
của mình.

Metchnikoff làm việc ở viện Pasteur Paris. Ông ta cho rằng vi sinh vật trong
ruột có ảnh hưởng xấu tới sức khỏe vật nuôi và những ảnh hưởng xấu này có
thể được cải thiện bởi việc sử dụn sữa chua. Ông đã trích dẫn các quan sát về
nông dân Bungari sử dụng số lượng lớn sữa chua và có tuổi thọ rất cao. Ông
phân lập được hệ sinh vật từ sữa chua ông gọi là “Bulgarian bacillus” và sử
dụng chúng trong các thử nghiệm. Những sinh vật này được xác đònh và được
biết đến là Lactobacillus bulgaricus và ngày này được gọi là L. delbrueckii
subsp bulgaricus là một trong số sinh vật được sửdụng để lên men sữa và sản
xuất yoghurt. Sau khi Metchnikoff mất vào năm 1916, hoạt động nghiên cứu
này chuyển về USA. Được biết ở thời điểm đó người ta đã đề xuất việc sử dụng
các L. acidophilus và nhiều thử nghiệm đã được thực hiện với sinh vật này. [34]
Thuật ngữ probiotic vốn có nhiều đònh nghóa khác nhau, nó được sử dụng
lần đầu tiên năm 1965 (Lilly & Stillwell ) để mô tả một chất được tạo bởi một
protozoan để kích thích sự tăng trưởng của một sinh vật khác. Đến năm 1974,
Parker đã sử dụng để chỉ các chất bổ sung thức ăn động vật: là các sinh vật và
chất có tác động tích cực lên động vật bằng cách cân bằng vi sinh vật ruột.
Fuller (1989) đã đưa ra đònh nghóa rất gần với hiện nay là “ một bổ sung vi sinh
vật sống qua thức ăn có tác động tích cực lên ký chủ bằng cách cải thiện cân
bằng vi sinh vật đường ruột”. [33]
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 6
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
Bảng 2.1: Một số sản phẩm sữa lên men có chứa đựng các vi khuẩn
probiotic (T. Mattila-Sandholm, M. Saarela, Probiotic functional foods)
Dạng sản
phẩm
Tên sản
phẩm
Công ty
Vi Khuẩn probiotic bổ

Yakult Yakult L. casei Shirota strain
Nertherlands,
UK,
Germany
Cultures
yoghurt-
style
product
Gaio
MD-
Foods
E. faecium Denmark
Yoghurt SNO
Dairygol
d
L. acidophilus Ireland
Yoghurt
Actimel
Cholester
ol
Control
Danone L. acidophilus Belgium
Fermented
milk drink
Actimel Danone L. casei Europe
Yoghurt Yoplait Waterfor
L. acidophilus
Ireland
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 7

lactose
 Làm giảm Cholesterol trong huyết thanh
 Kích thích hệ thống miễn dòch
 Giảm nhiễm trùng đường niệu
 Tăng trọng (5%) ở gia cầm
 Giảm bệnh nhiễm trùng ở gia cầm
 Giảm tiêu chảy ở dộng vật non
 Giảm tác dụng phụ của chất kháng sinh
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 8
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
Hiệu quả lâm sàng của một vài chủng probiotic được trình bày trong Bảng
dưới đây:
Bảng 2.2: Tác dụng lâm sàng của một số chủng probiotic [8], [15]
Chủng Tác dụng lâm sàng trên người
Lactibacillus rhamnosus GG
(ATCC 53103)
Giảm hoạt tính enzyme phân, giảm tiêu chảy
do kháng sinh ở trẻ em, điều trò và dự phòng
rotavirus và tiêu chảy cấp ở trẻ em, điều trò
tiêu chảy tái phát do Clostridium difficile,
kích thích miễn dòch, giảm nhẹ triệu chứng
viêm da không điển hình ở trẻ em
Lactobacillus johnsonii
(acidophilus) LJ-1 (La1)
Cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, tăng
cường miễn dòch, hỗ trợ điều trò Helicobacter
pylori
Bifidobacterium lactis Bb-12 Dự phòng tiêu chảy du lòch, điều trò tiêu chảy
do virus, kể cả rotavirus, cân bằng hệ vi sinh

Không có tác dụng trên tiêu chảy do
rotavirus, không có hiệu ứng tăng cường miễn
dòch khi bò tiêu chảy do rotavirus, không có
tác dụng lên hoạt tính enzyme phân
Vào cuối năm những năm 1940 có hai nghiên cứu phát triển về hệ vi sinh
vật đường ruột này. Đầu tiên, thấy rằng thuốc kháng sinh bổ sung trong thức ăn
đã thúc đẩy tăng trưởng của vật nuôi. Mong muốn khám phá cơ chế này đã ảnh
hưởng tới việc tăng cường nghiên cứu về thành phần của hệ vi sinh vật đường
ruột này và cách thức mà nó tác động lên vật chủ. Thứ hai, càng ngày càng có
nhiều vật nuôi bò bệnh, cung cấp cho những thí nghiệm để khám phá hệ sv trong
đường ruột bởi những vật chủ có sẵn. Và cuối cùng cho thấy rằng L. acidophilus
không là vi khuẩn lactobacillus duy nhất có trong ruột non mà có nhiều sinh vật
khác cần được nghiên cứu để sử dụng làm probiotics. Những nghiên cứu tiếp
sau đó cho thấy có khoảng 10
14
vi sinh vật thuộc khoảng 400 loài khác nhau tồn
tại ở trong ruột (Moore & Holdemann 1974), chính vì vậy việc nghiên cứu về
những sinh vật có thể sử dụng làm probiotic ngày càng được mở rộng. [30]
Sau nhiều nghiên cứu, người ta đã tổng kết lại được rất nhiều sinh vật có
thể sử dụng làm probiotic. Điều này sẽ được trình bày ở mục tiếp theo.
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 10
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
2.1.1.3. Các thành phần của Probiotics
Bảng 2.3: Những vi sinh vật được xem như là probiotic (Holzapfel et al. 2001) [5]
Lactobacillus Bifidobacteriu
m
Other lactic acid
Bacteria
Non-lactic acid

Escherichia coli Nissle 1917
Propionibacterium freudenreichii
Saccharomyces cerevisiae
Saccheromyces boulardii
2.1.1.4. Tiêu chí chọn lọc chủng probiotic [2], [3], [33], [34]
Các sinh vật được lựa chọn làm probiotic phải đáp ứng được các tiêu chuẩn
như:
 Tiêu chuẩn về an toàn
 Tiêu chuẩn về đặc điểm và chức năng
Đã có nhiều nghiên cứu, nhiều thông tin về những tiêu chuẩn dành cho
probiotic, ta có thể tổng kết lại như sau:
 Khía cạnh an toàn của probiotic bao gồm những điểm cụ thể sau:
• Có đònh danh chính xác
• Những chủng sử dụng cho người tốt nhất là có nguồn gốc từ người
• Được phân lập từ đường tiêu hóa của người khỏe mạnh
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 11
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
• Được chứng minh là không có khả năng gây bệnh
• Không liên quan tới bệnh tật
• Không gây khử liên hợp muối mật
• Đặc điểm di truyền ổn đònh
• Không mang các gen đề kháng kháng sinh có thể truyền được
Tính an toàn của các chủng probiotic là điều được quan tâm hàng đầu. Có
một số phương thức giúp tiến hành đánh giá tính an toàn của probiotic như:
nghiên cứu trên các đặc tính của chủng probiotic, nghiên cứu về dược động học
của chủng probiotic, nghiên cứu các tác động qua lại giữa probiotic và vật chủ.
Các probiotic thường thuộc nhóm vi sinh vật GRAS (Generally Regarded As
Safe)
Bảng 2.4: Vi sinh vật probiotics và tính an toàn của chúng [2], [15]

• Có khả năng sống và không bò biến đổi chức năng khi đưa vào sản
phẩm.
• Không gây các mùi vò khó chòu cho sản phẩm.
• Các vi khuẩn sống phải đi đến được nơi tác động của chúng. Để tồn
tại được nó phải có đặc tính sau:
Có khả năng dung nạp với acid (chòu pH thấp ở dạ dày) và dòch vò
của người.
Có khả năng dung nạp với muối mật (là đặc tính rất quan trọng để
probiotic có thể sống sót được khi đi qua ruột non).
• Có khả năng bám dính và niêm mạc đường tiêu hóa vật chủ.
• Có khả năng sinh các enzyme hoặc các sản phẩm cuối cùng mà vật
chủ có thể sử dụng.
• Có khả năng kích thích miễn dòch nhưng không có tác động gây
viêm.
• Có khả năng cạnh tranh với hệ vi sinh vật tự nhiên, có hoạt tính đối
kháng với các vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt là sinh vật gây bệnh đường ruột.
• Sản xuất các chất kháng vi sinh vật ( ví dụ như bacteriocin,
hydrogen peroxide, acid hữu cơ).
• Có khả năng chống đột biến và các yếu tố gây ung thư.
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 13
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
Sau đây là một số chức năng quan trọng của những chủng được sử dụng
làm probiotic
 Khả năng bám dính [1], [2], [10]
Khả năng bám vào bề mặt và sau đó là phát triển trong đường tiêu hóa
người được xem là điều kiện tiên quyết quyết đònh chức năng của probiotic.
Những vi khuẩn có khả năng bám dính vào bề mặt ruột sẽ tồn tại lâu hơn và do
đó có điều kiện để biểu hiện những tác động điều hòa miễn dòch hơn là những
chủng không có khả năng nám dính

3. Tăng cường khả năng đònh vò kháng thể trên bề mặt ruột, thường là IgA
 Khả năng chống lại các yếu tố gây bệnh [2], [5]
Để có thể tác động lên hệ sinh thái vi khuẩn đường ruột thì điều khá quan
trọng đó là probiotic phải có khả năng chống lại các vi khuẩn gây bệnh bằng
cách tiết ra các kháng sinh hay là những chất cạnh tranh.
Vi khuẩn probiotic tạo ra các chất đa dạng mà ức chế cả vi khuẩn Gram
dương và Gram âm. Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ những sinh
vật mang mầm bệnh có thể sống được mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chất
của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố.
Qua nghiên cứu cho thấy các kháng sinh và chất cạnh tranh thường thấy ở
các chủng probiotic là:
• Bacteriocin
• Hydrogen peroxide
• Acid hữu cơ (acid lactic, acid acetic )
• Diacetyl…
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 15
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
Cơ chế tác động: cạnh tranh với các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính
vào đường ruột, cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh,
tác động kháng độc tố.
 Khả năng chống đột biến và các yếu tố gây ung thư [2], [5], [18]
Trong nhiều năm qua, có những nghiên cứu cho thấy vi sinh vật trong thực
phẩm hay trong hệ sinh thái ruột có khả năng chống đột biến và chống lại các
yếu tố gây ung thư. Cơ ché này được nghiên cứu và kết luận như sau:
Nhờ sự gắn kết và phân hủy các chất gây ung thư
Sản xuất các hợp chất kháng ung thư
Điều hòa những enzyme tiền chất gây ung thư ruột, như các enzyme phân
(nitroreductase, β-glucuronidase ) có khả năng chuyển các chất tiền sinh ung
thư thánh chất gây ung thư trong trực tràng

Thông tin liên hệ với khách hàng
PROBIOTIC
Pha 3: Kiểm nghiệm mức độ hiệu quả trên người
So sánh hiệu quả điều trò 1 bệnh đặc trưng bằng
probiotic với phương pháp điều trò thông thường.
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
Hình 2.1: Sơ đồ hướng dẫn của FAO và WHO trong tuyển chọn Probiobic
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 17
Phân lập các
dòng vi khuẩn
Sàng lọc in
vitro
Sàng lọc in vivo
quy mô nhỏ
Kiểm tra khả năng gây bệnh
đối với vật chủ
Không đạt
OK
?
Đạt
Đạt
Thử nghiệm in vivo
quy mô pilot
OK
?
Khả năng gây bệnh đối với
điều kiện nuôi (nếu cần)
OK
?

bào này được sử dụng để kiểm tra hện thống tế bào bám dính và sự xâm nhập
của các vi sinh vật chỉ thò
Tế bào Caco2 được nuôi cấy tăng sinh khối tế bào trong Eagle’s minimum
essential medium (MEM). Hỗn hợp chứa vi khuẩn khoảng 10
8
tb/ml và 240µl
MEM được sử dụng để ủ với tế bào Caco2. Sau khi nuôi ủ, sinh khối tế bào
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 19
Probiotics
Sự
bám
dính
Chòu
acid dạ
dày
Kháng
vi sinh
vật
Chòu
được
muối
mật
Thử
nghiệm
in vivo
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
được nhuộm với dung dòch màu Giema. Lúc này quan sát được các tế bào
Lactobacilli bám chặt trên tế bào Caco2 dưới kính hiển vi độ phòng đại 100.
Hình 2.4: Minh họa các vi khuẩn probiotic bám dính lên bề mặt ruột tác

nghiên cứu mới, tuy nhiên tất cả những nghiên cứu từ trước tới giờ đều dựa trên
khả năng sinh kháng sinh hay các chất cạnh tranh để ngăn chặn sự phát triển
của các vi sinh vật gây bệnh.
Hình 2.5 sẽ cho thấy sơ đồ khái quát hóa về các phương pháp đánh giá
hoạt tính kháng vi vinh vật dựa trên dạng vật liệu khác nhau.
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 21
Turbidometric
assay method
well
diffusion
assay
Spot
on
lawn
Disc
diffusion
assay
Agar
spot
test
Dùng sản phẩm
thô (dòch nuôi
cấy)
Sản phẩm đã qua
tinh chế (dòch nuôi
cấy ly tâm loại bỏ
tế bào)
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
Hình 2.5: Sơ đồ khái quát hóa các phương pháp in vitro trong kiểm tra đánh giá

vào dòch ly tâm môi trường (2) nuôi
cấy LAB. Đặt giấy thấm lên bề mặt
môi trường agar đã trải vi khuẩn chỉ
thò trước đó. Ủ qua đêm, kiểm tra
vùøng kháng khuẩn.
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 22
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
Well diffusion
assay
(khuếch tán qua
giếng thạch) [12],
[19], [20], [25],
[41]
Như trên Trên môi trường agar (3). Trải vi
khuẩn chỉ thò, đục lỗ đường kính 8mm.
Cho dòch ly tâm môi trường(2) nuôi
cấy LAB. Ủ qua đêm, kiểm tra vùøng
kháng khuẩn
Đấu tranh trực
tiếp của Probiotic
với vi khuẩn chỉ
thò
Giống như trên. Tuy nhiên sử dụng
trực tiếp dòch nuôi cấy LAB. Ủ qua
đêm, kiểm tra vùøng kháng khuẩn
Spot on lawn
[12], [11], [31],
Đấu tranh trực
tiếp của Probiotic

Kiểm tra vùng kháng khuẩn là đo vòng trong suốt không có sự phát triển
của vi khuẩn chỉ thò.
Agar spot test
Well diffusion assay
Disc diffusion assay
Spot on lawn
Hình 2.6: Minh họa các phương pháp kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật [19]
2.1.3.5. Thử nghiệm in vivo [10], [41]
Đây là khâu quan trọng trong quá trình hình thành nên một chế phẩm
Probiotic. Vì nó thể hiện được tính an toàn của sản phẩm cũng như là vấn đề về
đạo đức. Một chế phẩm probiotic trước khi trở thành thành phẩm để sản xuất và
tiêu thụ, phải trải qua công đoạn thử nghiệm in vivo nhằm kiểm tra ảnh hưởng
của chế phẩm lên cơ thể tiếp nhận. Tức là kiểm tra độc tính hay những biến đổi
xấu lên cơ thể tiếp nhận khi sử dụng chế phẩm này. Qui trình kiểm tra này có
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 24
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
thể bắt đầu với thử nghiệm in vivo trên chuột hoặc thỏ, sau đó mới được thử
nghiệm trực tiếp trên cơ thể tiếp nhận như gia súc gia cầm với chế phẩm trong
chăn nuôi Đặc biệt nếu là chế phẩm dành cho người thì việc thử nghiệm càng
phải gắt gao và đòi hỏi tính chính xác, tính an toàn cao.
2.1.4. Ứng dụng Probiotics trong chăn nuôi [1], [3]
Phương pháp chăn nuôi hiện đại trong đó bao gồm các điều kiện và chế độ
ăn gây ra stress và có thể gây ra những thay đổi trong thành phần của hệ vi sinh
vật mà làm cho vật nuôi giảm sự đề kháng đối với bệnh tật.
Probiotic được bổ sung vào thức ăn để tăng cường tốc độ tăng trưởng của
vật nuôi và cải thiện sức khỏe của chúng bằng cách tăng sự đề kháng. Mục đích
của phương pháp tiếp cận probiotic là để cân bằng lại hệ vi sinh vật và phục hồi
sức đề kháng của động vật. Sự điều trò như vậy không đưa bất cứ hóa chất vào
bên trong cơ thể động vật. Giảm nguy cơ nhiễm bệnh và không đưa hóa chất