Chuyên đề công nghệ sinh học Phạm Việt Hà Cao Học K18
Trang
1

II . NGUYÊN LÍ KỸ THUẬT GEN
1. Các bước chủ yếu của kỹ thuật gen
Kỹ thuật gen gồm nhều giai đoạn nhằm biến đổi cấu trúc gen, tạo gen mới, đưa các gen
tái tổ hợp vào tế bào chủ để thu nhận các prôtêin tái tổ hợp, hoặc nghiên cứu cấu trúc bộ gen,
lập bản đồ gen. Kỹ thuật gen gồm các bước cơ bản sau:
a. Chuẩn bị gen cần tách dòng
Gen cần tách dòng (đoạn ADN insert), có thể được chuẩn bị bằng phương pháp tách
chiết (ADN, ARN) từ sinh vật mang nguồn gen tự nhiên hoặc tổng hợp nhân tạo.
Tách chiết (ADN, ARN) từ sinh vật mang nguồn gen tự nhiên; tách chiết plasmid từ vi
khuẩn. Tinh sạch và chọn lọc để thu được các gen cần tách dòng. Sử dụng kỹ thuật nhân gen
PCR để nhân gen cần thiết lên một số lượng lớn các bản sao, đảm bảo một lượng ADN (ARN)
cần thiết.
Tổng hợp đoạn ADN nhân tạo trên cơ sở đã biết các trình tự đặc hiệu ( hoặc trình tự
axitamin trong chuỗi polipeppit). Dùng kỹ thuật tổng hợp nhân tạo đoạn oligonuclêotit mạch
đơn và nhân gen PCR để tạo số lượng các đoạn ADN nhân tạo đủ lớn.
b. Tạo vectơ tái tổ hợp
Dựa vào đặc điểm của gen cần tách dòng để lựa chọn loại vectơ và enzim giới hạn phù
hợp. Gồm
+ Cắt ADN của tế bào cho chứa gen cần chuyển và ADN của plasmid cùng một loại
enzim cắt giới hạn, enzim này sẽ cắt hai mạch đơn của phân tử ADN ở vị trí nuclêôtit xác định
(trình tự nhận biết) tạo ra các đầu dính có trình tự nuclêôtit bổ sung.
+ Trộn ADN của tế bào cho với ADN plasmid đã cắt hở, các đầu dính bắt cặp bổ sung
với nhau nhờ enzim nối ligaza tạo liên kết photphođieste làm liền mạch ADN. Plasmid mang
gen lạ gọi là ADN tái tổ hợp.

Hình . Sơ đồ các bước chủ yếu của kỹ thuật gen
Chuyên đề công nghệ sinh học Phạm Việt Hà Cao Học K18

+Gen chỉ thị trong vectơ tách dòng càng dễ nhận biết càng tốt để dễ dàng chọn lọc các
vectơ tái tổ hợp. Các điểm cắt của enzim giới hạn thường nằm trong các gen chỉ thị,
giúp cho sự nhận biết và sàng lọc dễ dàng.
+ Vectơ tách dòng phải có hiệu quả tách dòng cao, tạo nên tỉ lệ vectơ tái tổ hợp cao.
3. Nguyên tắc tạo vectơ tái tổ hợp
Tạo vectơ tái tổ hợp là thực hiện kỹ thuật gắn nối gen cần tách dòng vào vectơ tách
dòng. Tạo vectơ tái tổ hợp thực hiện theo các bước sau :
+ Chuẩn bị nguyên liệu : Gen cần tách dòng (ADN insert) tinh sạch cần được nhân lên
bằng PCR ( 20- 25 chu kỳ) tạo một hàm lượng cần thiết sản phẩm PCR. Vectơ tách dòng thích
hợp nhw pBR 322, pUC 18…
+ Thực hiện phản ứng nối gen cần tách dòng với vectơ : chuẩn bị thành phần phản ứng
phù hợp với mỗi loại vectơ tách dòng.
Ví dụ : vectơ tách dòng là pUC 18 hỗn hợp phản ứng gồm : 1,0 µl đệm phản ứng ;
0,5µl ATP 10 mM ; 1,0 µl enzym T4 ADN ligase ; 1,0 µl vectơpUC 18 ; 5,0 µl sản phẩm
PCR tách dòng ; 1,5 µl H
2
O.
Chuyên đề công nghệ sinh học Phạm Việt Hà Cao Học K18
Trang
3

+ Hỗn hợp các thành phần phản ứng được ủ qua đêm ở nhiệt độ 16
0
C. Sau đó, tiến
hành điện di với thang ADN chuẩn để kiểm tra kết quả tạo vectơ tái tổ hợp. Vectơ tái tổ hơph
đã tạo được cần giữ trong tủ lạnh sâu ở -80
0
C đến -85
0
C để tiếp tục các nghiên cứu tiếp theo.

Lấy 50 µl tế bào khả biến đang giữ trong ống eppendorf ở nhiệt độ -75
0
C đến -80
0
C để
trên đá khoảng 15 phút, sau đó thêm 0,5 ng ADN đaot nhẹ ống 3-4 lần và để trên đá khoảng
15-20 phút.
Lấy mẫu đặt vào bể ổn nhiệt có nhiệt độ 42
0
C trong 2 phút, đặt nhanh trên đá 2 phút.
Sau đó thêm khoảng 1000 µl môi trường LB lạnh, nuôi trong 37
0
C ở máy lắc trong 30-60
phút. Lấy 100 µl dịch tế bào đã sốc nhiệt, trải lên hộp Petri môi trường LB 2% agarose có bổ
sung ampicilin với nồng độ 50 µg/ml, IPTG và X-gal. Ủ hộp petriở 37
0
C trong 12- 16 giờ,
kiẻm tra các khuẩn lạc phát triển trên hộp petri. Thu nhận khuẩn trắng, cấy vào trong môi
trường lỏng để kiểm tra kết quả.
Biến nạp E.coli bằng kỹ thuật sốc nhiệt có hiệu quả khoảng 1/10000. sàng lọc các tế
bào mang vectơ tái tổ hợp, chuyển sang ống thạch nghiêng để giữ chủng giống.
4.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào nấm men bằng kỹ thuật xung điện
a. Chuẩn bị tế bào
Cấy 1 khuẩn lạc nấm men vào 5 ml môi trường YPD ( 1% cao nấm men, 2% pepton,
2% glucose), nuôi ở 28
0
C với tốc độ lắc 250 vòng/ phút trong 1 ngày đêm. Lấy 30 µl dung
dịch nuooi cấy vào 100 ml YPD, lắc 16-18 giờ, đo OD
600
để xác định mật độ tế bào (OD =1,3 -

không mang vectơ tái tổ hợp nhưng do xuất hiện các đột biến kháng chất kháng sinh, nên vẫn
có thể phát triển được. Để đảm bảo hiệu quả sàng lọc chuẩn xác, thường kết hợp sử dụng chỉ
thị hai loại kháng sinh, hoặc đồng thời sử dụng gen chỉ thị kháng sinh cùng với gen chỉ thị
màu, chỉ thị enzym
5.2. Chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng gen chỉ thị màu
Sử dụng gen chỉ thị màu kết hợp với gen chỉ thị khánh sinh là phương phápchọn lọc
dòng tái tổ hợp có hiệu quả cao. Trong kỹ thuật sàng lọc thể tái tổ hợp ở tế bào vi khuẩn, gen
LacZ kết hợp với IPTG và X- gal làm gen chỉ tị màu được sử dụng tương đối phổ biến, dễ
nhận biết dòng tái tổ hợp nhờ màu sắc khuẩn lạc. Gen LacZ mã hoá enzym β- galactosidase
của vi khuẩn E.coli có chất cảm ứng IPTG (isopropyl thiogalactoside- chất đồng đẳng của
lactose) β- galactosidase được tổng hợp trong tế bào E.coli.
Nếu môi trường có mặt X-gal (5-bromo -4-cloro-3-indolyl - β-D- galactopyranoside),
enzym β- galactosidase có khả năng thuỷ phân X-gal từ 1 hợp chất không màu thành màu
xanh. Do đó ở môi trường nuôi cấy vi khuẩn sau khi biến nạp có bổ sung thêm một ít X-gal và
chất cảm ứng IPTG, các tế bào vi khuẩn có gen LacZ nguyên vẹn (không tạo ADN tái tổ hợp)
tổng hợp enzym β- galactosidase thuỷ phân X-gal các tế bào này phát triển thành khuẩn lạc
có màu xanh.
Nếu gen cài ADN được xen vào giữa gen LacZ (vectơ tái tổ hợp) làm cho gen LacZ
mất hoạt tính, enzym β- galactosidase không được tổng hợp, tế bào vi khuẩn phát triển thành
các khuẩn lạc có màu trắng . Lựa chọn các khuẩn lạc có màu trắng cấy truyền vào môi trường
dinh dưỡng có thạchthu được dòng tế bào mang vectơ tái tổ hợp.
5.3. Chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng phương pháp lai phân tử
Đây là phương pháp chọn lọc dòng tái tổ hợp có độ chính xác cao, nhưng phức tạp và
tốn kém, phải có thiết bị chuyên dùng…Phương pháp lai axit nuclêic (ADN, ARN)với mẫu dò
đánh dấu phóng xạ hoặc huỳnh quang (mẫu dò là các đoạn oligo nuclêôtit được đánh dấu
phóng xạ, hoặc huỳnh quang). Các bước thực hiện gồm :
+Sau khi biến nạp các tế bào vi khuẩn ( hoặc nấm men) được nuôi cấy từ hộp petri trên
môi trường có 2% agar, để mỗi tế bào phát triển thành một khuẩn lạc. Đặt một màng lai lên
trên hộp petri
Chuyên đề công nghệ sinh học Phạm Việt Hà Cao Học K18