- 1 -

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuẩn đoán vi khuẩn Pasteurella
multocida bằng kỹ thuật gen. Giáo viên phụ trách: TS. Nguyễn Ngọc Hải.
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Trung Tuyến.
MSSV: 06126179
Khoa: Công Nghệ Sinh Học

- 2 -I. ĐẶT VẤN ĐỀ.

- 3 -II. TỔNG QUAN.
II.1. Bệnh tụ huyết trùng.
Tụ huyết trùng là bệnh nhiễm khuẩn có độc lực cao ở gia súc gia cầm, do
vi khuẩn Pasteurella multocida gây ra. Bệnh chủ yếu gây nhiễm khuẩn huyết. Vi
khuẩn tấn công vào cơ quan tiêu hoá, các hạch và nhất là cơ quan hô hấp. Bệnh
lưu hành ở từng địa phương, hoặc thành dịch lớn ở trâu, bò, dê, cừu, thỏ, gia
cầm. Bệnh ở gia cầm còn gọi là hoắc loạn gà. Bệnh ở trâu, bò, lợn còn gọi là
nhiễ
m khuẩn huyết xuất huyết. Bệnh ở trâu còn gọi là bacbon (barbone). Bệnh
thường xảy ra khi thời tiết thay đổi, thường phát vào mùa nóng ẩm ở những vùng
ẩm thấp, cơ thể thú nuôi giảm sức đề kháng, bệnh thường lây qua đường hô hấp,
tiêu hoá, vết thương ngoài da hoặc tiếp xúc với nguồn bệnh.

II.2. Vài nét lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng.
II.2.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng trên thế giới.
Năm 1875, Bollinger là người đầu tiên phát hiện ra bệnh tụ huyết trùng ở
bò tại Đức.
Năm 1879, Tousain phát hiên bệnh tụ huyết trùng ở gà. Gà bị bệnh do vi khuẩn Pasteurell amultocida - 4 -
Năm 1880, Louis Pasteur, nhà vi trùng học người Pháp đã phát hiện được
vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng ở gà (Fowl cholera)
Năm 1881, Gaffky phát hiện bệnh ở thỏ và đặt tên là bệnh bại huyết

bệnh tụ huyết trùng ở Sơn La trong giai đoạn 1990-1993, khảng định: tiêm
phòng bệnh tụ huyết trùng là biện pháp hiệu quả, kinh tế và quan trọng hàng đầu.

Tiêm phòng bệnh tụ huyết trùng là biện pháp hiệu quả, kinh tế và quan trọng
hàng đầu.

Năm 1995, Nguyễn Ngã nghiên cứu tính kháng nguyên và độc lực vi khuẩn
gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò ở khu vực miền trung nhằm chọn giống vi khuẩn

- 6 -
địa phương thích hợp có khả năng kết hợp với giống vi khuẩn nước ngoài để chế
tạo vắc-xin có hiệu lực cao.
Năm 1996, Hoàng Đạo Phấn nghiên cứu tác động của thực khuẩn thể đặc
hiệu đối với khuẩn Pasteurella multocida phân lập từ gia súc gia cầm.
Năm 1996, Nguyễn Thu Thiên và Nguyễn Ngã đã phân lập và xác định các
type huyết thanh Pasteurella multocida ở trâu bò nuôi tại miền trung Việt Nam.
Nă
m 2000, Đinh Duy Kháng và Lê Văn Phan đã ứng dụng kỹ thuật PCR để
định type vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập ở miền trung Việt Nam. HB1,
HB2 và HS1, HS2 là hai cặp mồi được dung để xác định Pasteurella multocida
gây bại huyết, xuất huyết.

II.3. Vi khuẩn Pasteurella multocida.
II.3.1. Đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Pasteurella multocida.
Vi khuẩn Pasteurella nằm trong bộ Eubacteriales, thuộc họ
Parvobacteriaceae, thuộc giống Pasteurella và chia làm ba loài, trong đó có loài
gây bại huyết, xuất huyết cho gia súc, gia cầm là: Passteurella multocida và
Pasteurella haemolytica.

II.3.2. Đặc tính hình thái của vi khuẩn Pasteurella multocida.

được nuôi trong các môi trường dinh dưỡng, quá trình trao đổi chất diễn ra trong
tế bào vi khuẩn sẽ tạo ra các sản phẩm có thể làm thay đổi pH của môi trường.
Khi đó dựa vào các chất chỉ thị màu thì người ta có thể xác định đặc tính sinh
hóa của chúng.
- 8 -II.3.5. Đặc tính kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida.
Đặc tính kháng nguyên của Pasteurella multocida rất phức tạp và cấu trúc
từng loại kháng nguyên cũng luôn thay đổi. Kháng nguyên của Pasteurella
multocida có 2 loại chính là kháng nguyên vỏ K và kháng nguyên thân O. Việc
tìm hiểu cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida có vai trò rất

y, người ta đã giải trình tự và xác định được 104 gene có liên quan đến kh
ả năng
gây bệnh của Pasteurella multocida, chiếm khoảng 7% bộ gene. Đại diện trong
số đó là nhóm gene pfh (Pasteurella filamentous hemagglutinin, pfh). Nhóm

- 9 -
gene này có kích thước 24 kb, bao gồm 2 gene liên quan đến khả năng gây bệnh
của Pasteurella multocida đó là gene pfhB1 (tổng hợp protein 2615aa) và pfhB2
(3919aa). Nhóm gene này có những đặc điểm quan trọng sau:
- Đầu amino của 2 gene pfhB1 và pfhB2 theo mô hình N(P/Q)NG(I/M),
mô hình này liên quan đến tiến trình tiền phiên mả va tính hiệu ngoại
bào.
- Vùng trung tâm có chứa một vùng quy định khà năng bám dính của vi
khuẩn vào bề mặt của tế bào. Điều này giúp vi khuẩn có thể tấn công vô
tế bào và gây bệnh cho vật chủ.
-
Đầu carboxy chứa vùng có cấu trúc tương tự như protein kháng huyết
thanh p76 của Haemophilus somnus (có 66% amino acid tương tự). Khả
năng này giúp cho Pasteurella multocida tăng khả năng sống sót trong
cơ thể vật chủ từ đó tăng cường khả năng gây bệnh của vi khuẩn.

II.3.5.3. Xác định type kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella
multocida.
Vi khuẩn Pasteurella multocida mọc dễ dàng trên các môi trường nhân tạo
vì vậy việc chuẩn đoán vi khuẩn không có khó khăn gì đặc biệt. Tuy nhiên để
xác định chính xác type kháng nguyên của vi khuẩn đó thì lại khá phức tạp khi
sử dụng các kỹ thuật thông thường.
Việc xác định type kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida chủ
yếu được thực hiện bằng phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính, ng
ưng

(Townsend và cs., 2001) Với 2 cặp mồi HSB và CAPB sản phẩm DNA tương ứng được tạo ra có kích
thước tương ứng là 620 bp và 720 bp (Townsend và cs., 2001). Với cặp mồi
HSB có thể nhận diện được hầu hết các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida,
trong đó cặp mồi CAPB cho phép phân biệt các chủng Pasteurella multocida
serotype B (B:2, B:5, B:2,5). Ngoài ra để xác định vi khuẩn Pasteurella
multocida serotype D người ta sử dụng cặp mồi CAPD (
đặc hiệu cho vi khuẩn P.
multocida serogroup D) (Townsend và cs., 2001). Do các chủng Pasteurella
multocida có thể dương tính cùng lúc với cặp mồi HSB và CAPB hoặc HSB và
CAPD, nên để xác định vi khuẩn Pasteurella multocida serotype B hoặc
serotype D cần thiết phải sử dụng đồng thời 2 cặp mồi HSB và CAPB hoặc HSB
và CAPD.
Kết quả PCR có tính chính xác cao và rất nhanh chóng, vì thế có thể sử dụng
chúng trong chuẩn đoán và nghiên cứu dịch tễ bệnh do Pasteurella multocida
trên gia súc gia cầm. III.2. Xác định serotype vi khuẩn Pasteurella multocida
bằng phương pháp nested-PCR.

Trong phương pháp này người ta sử dụng 2 cặp mồi: cặp mồi chung cho
loài và cặp mồi riêng cho vùng mã hóa chuyên biệt của một serotype nào đó. Cặp

- 11 -
mồi chung được thiết kế dựa vào vùng bảo tồn của loài Pasteurella multocida,
không chuyên biệt cho serotype nào cả.



- KMT1T7: 5’-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3’
- 12 -
- KMT1SP6: 5’-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3’ III.3. Phân tích thành phần protein của vi khuẩn.
Việc phân tích thành phần protein của vi khuẩn được thực hiện trên gel
SDS-PAGE. Các chủng vi khuẩn được pha thành dung dịch huyền phù có nồng
độ khoảng 5x10
9
cfu/ml, trộn với dung dịch đệm 15% β-mecapthoethanol.

là một kỹ thuật mà trong đó trình tự ADN biến thể được xác định bằng cách
khuếch đại thông qua kỹ thuật PCR. Tiếp theo đó sản phẩm của quá trình PCR
sẽ được phân cắt bởi một endonuclease hạn chế. Các phân đoạn DNA khác nhau
về kích thước và sẽ được phân tách trên gel agarose / gel acrylamide.Việ
c phân
biệt được các serotype Pasteurella multocida dựa trên sự khác biệt nucleic acid
của các serotype Pasteurella multocida.
Kiến thức về serotype của Pasteurella multocida tham gia vào một ổ dịch
là điều rất cần thiết để tạo nên các biện pháp kiểm soát hiệu quả. Đặc tính kháng
nguyên của Pasteurella multocida được thực hiện bởi serogrouping capsular và
serotyping soma. Tuy nhiên những kỹ thuật này lại được thực hiện bởi các phòng
thí nghiệm tham khảo. Điều này thường d
ẫn đến sự chậm trễ trong việc xác định
các serotype cô lập được. Kỹ thuật gene dựa cho sự khác biệt về nucleic acid của
serotypes có thể thay thế cho các kỹ thuật thông thường. Một kỹ thuật PCR-REA
(Polymerase chain reaction-restriction enzyme analysis) đã được chuẩn hóa để
phân biệt Pasteurella multocida serotype A: 1, A: 3 và B: 2. Vật liệu và phương pháp:

Pasteurella multocida chủng DP1 và FP1 cô lập tại Kerala, Ấn Độ
serotyped là A: 1 do Viện Nghiên cứu thú y, Izatnagar, Ấn Độ cung cấp.
Pasteurella multocida chủng LKO serotypes A: 3, B: 2 do Viện Nghiên
cứu thú y, Izatnagar, Ấn Độ cung cấp nhằm hình thành các chủng tham khảo cho
nghiên cứu này.
Hai oligonucleotides dựa theo trình tự của P. multocida X-73 ompH gene,
U50907 (Luo et al ., 1997) được thiết kế bằng cách sử dụng phần mềm Primer3.

- 14 -


- 15 -

Phân tích hạn chế của các sản phẩm khuếch đại của serotypes A: 1, A: 3 và
B: 2 đã được tiến hành bằng cách sử dụng cùng một enzyme cắt giới hạn Dra I
và Hinf I. Enzyme Hinf I tạo ra mô hình tương tự như ở A: 3 và B: 2 nhưng khác
biệt từ A: 1, trong khi Dra I đã cho các cấu hình khác biệt với nhau cho ba
serotypes.

- 16 -
REA sản phẩm khuếch đại của OmpH-PCR với Dra I tạo ra các cấu hình
riêng biệt cho ba serotypes A: 1, A: 3 và B: 2, trong khi Enzyme Hinf I tạo ra mô
hình tương tự ở A: 3 và B: 2 nhưng khác biệt ở A: 1 . Vì vậy, REA sản phẩm
khuếch đại của OmpH-PCR với Dra I cung cấp một kỹ thuật lý thuyết cho sự
khác biệt giữa các serotype của Pasteurella multocida. Nếu mô hình duy nhất
cho tất cả các serotypes có thể được xác định một cách tương tự thì chúng ta có
thể
có một kỹ thuật serotyping đơn giản, nhanh chóng và có thể được thực hiện
trong bất kỳ phòng thí nghiệm có năng lực để thực hiện PCR. Sự phát triển của
ADN dựa trên một kỹ thuật cho biết sự khác biệt của serotypes có thể cung cấp
một thay thế cho hệ thống quy ước serotyping.

bệnh tụ cầu huyết) đã không còn là khó khăn nữa.

M
ột số kỹ thuật gene điển hình được sử dụng trong chuẩn đoán vi khuẩn
Pasteurella multocida:

- PCR (Polymerase Chain Reaction)

- nested-PCR

- RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

- PCR-RFLP (PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism)

11.

ngth Polymorphism…)

- 19 -
MỤC LỤC

I. ĐẶT VẤN ĐỀ 5
II. TỔNG QUAN.
II.1. Bệnh tụ huyết trùng 5
II.2. Vài nét lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng 5
II.2.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng trên thế giới 5
II.2.2. Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng ở Viêt Nam 7
II.3. Vi khuẩn Pasteurella multocida 8
II.3.1. Đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Pasteurella multocida 8
II.3.2. Đặc tính hình thái của vi khuẩn Pasteurella multocida 8
II.3.3. Tính bắt màu của vi khuẩn Pasteurella multocida 9
II.3.4. Đặc tính sinh hóa c
ủa vi khuẩn Pasteurella multocida 9
II.3.5. Đặc tính kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida 10
II.3.5.1. Kháng nguyên vỏ K (Kapsular antigen) 10
II.3.5.2. Kháng nguyên thân O (Somatic antigen) 10
II.3.5.3. Xác định type kháng nguyên của vi khuẩn
Pasteurella multocida 11
III. PHƯƠNG PHÁP – VẬT LIỆU
III.1. Giám định vi khuẩn Pasteurella multocida