MỞ ĐẦU
Lúa là một trong những cây lương thực chính của hơn một nửa dân số trên thế
giới (IRRI, 1994). Sản xuất lúa gạo chủ yếu tập trung ở các nước châu Á. Với điều
kiện khí hậu nhiệt đới, Việt Nam cũng là cái nôi của nền văn minh lúa nước. Đã từ
lâu cây lúa trở thành cây lương thực chủ yếu, có ý nghĩa đáng kể trong nền kinh tế và
xã hội nước ta. Năm 2003, sản lượng xuất khẩu gạo Việt Nam đạt 4,2 triệu
tấn, tăng 11% so với năm 2000 [12].
Tuy nhiên, thực tế cho thấy có nhiều yếu tố làm giảm năng suất và chất lượng
lúa gạo. Trong số đó, bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây nên là
một trong những yếu tố hạn chế sự phát triển của lúa, bệnh có khả năng lây nhiễm
mạnh và rất khó khống chế. Ở những nơi bệnh phát triển mạnh, năng suất lúa có thể
giảm đến 60%. Để phòng trừ bệnh bạc lá vi khuẩn người ta thường sử dụng thuốc
hoá học, song việc dùng thuốc gây độc hại cho người sử dụng và làm ô nhiễm môi
trường. Hạn chế những độc hại trên thì việc gieo trồng các giống lúa kháng bệnh là
có triển vọng nhất. Nhưng thực tế, giống kháng chỉ tồn tại vài năm trong sản xuất sau
đó nông dân phải thay thế bằng giống mới hoặc phun thuốc diệt bệnh, vì nòi bệnh có
độc tính cao hơn phát triển [10].
Để khắc phục được bệnh bạc lá vi khuẩn một cách hiệu quả, các nhà chọn
giống đang sử dụng các giống kháng bệnh lai với các giống có năng suất, chất lượng
cao nhằm thu được các giống vừa kháng bệnh, năng suất cao và có chất lượng tốt.
Hiện nay, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã xác định được các giống lúa mang các
gen kháng với các nòi khác nhau của bệnh bạc lá vi khuẩn. Đây là những nguồn gen
quí trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh cũng như các trong nghiên cứu đa dạng di
truyền [4], [10].
Trong những năm 90, kỹ thuật sinh học phân tử đã trở thành công cụ rất có
hiệu quả trong phân tích đa dạng, bảo tồn và tiến hóa giống loài ở sinh vật. Nghiên
cứu đa dạng trên đối tượng lúa là vấn đề được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan
tâm và kết quả là có rất nhiều công trình chỉ ra mức độ đa hình ở lúa khi sử dụng chỉ
thị RAPD [14], [29] và RELP [18], [25]. Trong các loại chỉ thị, thì chỉ thị RAPD
(Random Amplified Polymorphic DNA) đơn giản, ít tốn kém nên được sử dụng rộng
rãi hơn các chỉ thị AFLP, RFLP, SSR. Sử dụng chỉ thị RAPD, các nhà khoa học có
Nam thuộc Chi Lê. Theo FAO (1999) diện tích đất canh tác lúa trên toàn thế giới
khoảng 150 triệu ha. Riêng Trung Quốc và ấn độ chiếm khoảng 50% diện tích trồng
lúa và 56% sản lợng lúa toàn cầu. Châu Phi có diện tích trồng lúa gần bằng diện tích
trồng lúa của Việt Nam, nhng sản lợng lúa lại thấp hơn từ 2 đến 3 lần [2], [7].
1.2. Bệnh bạc lá vi khuẩn ở lúa (Xanthomonas oryzae)
Bệnh bạc lá (còn gọi là bệnh cháy bìa lá) là
một trong những bệnh hại lúa nguy hiểm do vi khuẩn
Xanthomonas oryzae gây nên. là một trong những
bệnh hại lúa nguy hiểm. Bệnh xuất hiện lần đầu tiên
ở Nhật Bản năm 1884. Năm 1960, bệnh lan truyền
sang, sau nguồn bệnh đợc tìm thấy ở các vùng khác ở
châu Phi, Australia, Mỹ và một số nớc Mỹ La Tinh.
ở Việt Nam, bệnh phổ biến ở tất cả các vùng trồng
lúa trong cả nớc, từ vùng núi cao đến ven biển. Bệnh
có thể làm giảm năng suất từ 6 - 60%. Bệnh phá hại
trong cả vụ Đđông xuân, hè Hè thu và vụ mMùa.,
đặc biệt, bệnh gây hại nặng trong các tháng nhiệt độ cao. Ma bão là điều kiện để
Hình1: Triệu chứng của bệnh
bạc lá lúa vi khuẩn do
Xathomonas oryzae gây ra
3
bệnh lây lan và phát triển mạnh. Trong những năm 1970 - 1975, bệnh phát triển và
gây thiệt hại nặng cho ở lúa ở khắp các tỉnh phía Bắc [2].
1.2.1. Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa (Xanthomonas aryzae)
Vi khuẩn Xanthomonas oryzae có hình gậy ngắn, hai đầu tròn, là vi khuẩn
Gram (-) và không hình thành bào tử. Các tế bào vi khuẩn đợc bọc trong màng nhầy
và liên kết với nhau thành một khối tơng đối vững chắc ngay cả trong nớc. Trên môi
trờng nhân tạo, khuẩn lạc có màu vàng nhạt và có thể sống trong phạm vi pH 4,0 -

sinh. Đối với các giống cảm nhiễm, vết bệnh lan rộng tới bẹ lá và có thể phát triển
xuống tận phần dới của bẹ lá, làm phiến lá bị héo và cuộn lại trong khi lá vẫn còn
xanh, sau đó toàn bộ phiến lá có thể bị héo rồi khô đi.
ở các ruộng lúa bị bệnh nghiêm trọng, hạt cũng có thể bị nhiễm bệnh. Trên
vỏ hạt xuất hiện các đốm màu nhạt, xung quanh có mép viền dạng giọt dầu. Khi hạt
4
còn non và xanh các vết bệnh lộ rõ, khi bông chín vết bệnh sẽ có màu xám,, hoặc
trắng hoặc vàng nhạt [6], [19].
1.2.3. các yếu tố ảnh hởng đến sự phát triển của bệnh
Trong dự báo bệnh bạc lá, yếu tố khí hậu là đối tợng để phân tích. Các nhà
khoa học phát hiện thấy rằng mức độ nhiễm bệnh tơng quan với tổng lợng ma, mức
độ ngập lụt, gió mạnh và độ sâu nớc tới. Nhiệt độ tơng đối cao trong thời kỳ lúa sinh
trởng có thể làm tăng bệnh, song mùa hè quá nóng và khô là điều kiện hạn chế bệnh.
Kỹ thuật trồng trọt cũng là một trong những điều kiện quan trọng ảnh hởng
đến sự phát sinh, phát triển bệnh, song cũng rất phức tạp vì một mặt nó ảnh hởng tới
sự phát sinh phát triển của cây lúa - làm tăng hay làm giảm tính chống chịu, mặt
khác nó ảnh hởng tới tiểu khí hậu đồng ruộng. Trong các yếu tố kỹ thuật chăm sóc
thì phân bón có ảnh hởng rõ rệt nhất tới sự phát sinh, phát triển của bệnh. Cụ thể là
bón đạm quá nhiều, bón thúc muộn, thiếu lân, kali và magie đều làm tăng bệnh. ở
những nơi đất chua, úng ngập đặc biệt ở những vùng đất nhiều mùn, hàng lúa bị
chắn nắng thì bệnh bạc lá có thể phát triển mạnh hơn [6].
Trong tất cả các giai đoạn sinh trởng, cây đều có thể bị nhiễm bệnh nhng ở
mức độ khác nhau tuỳ từng giai đoạn sinh trởng. Nói chung, từ thời kì mạ đến khi
lúa đẻ nhánh là thời kỳ bệnh tơng đối ít hơn so với giai đoạn cuối đẻ nhánh. Giai
đoạn lúa làm đòng - trỗ - chín sữa là giai đoạn rất mẫn cảm với bệnh, hiện tợng này
thể hiện khá rõ nét trên các giống lúa ngắn ngày, chịu phân, có năng suất cao, cấy
trong vụ Chiêm xuân và vụ Mùa [11].
1.2.4. Tác hại của bệnh bạc lá lúa vi khuẩn
Bệnh bạc lá vi khuẩn đã làm giảm năng suất lúa gạo hằng năm ở Châu á
xuống 60%. Ví dụ ở Nhật những năm gần đây, có khoảng 300.000 - 400.000 hecta

ở Nhật Bản, gần đây các nhà khoa học đã chọn đợc nhiều giống lúa kháng
bệnh đợc sử dụng để lai tạo ra các giống mới nh giống Sengoku 4, Magatama,
Zensho 26, Norin 27... Tuy nhiên, kết quả kiểm tra ngoài đồng ruộng cho thấy cha
chọn đợc giống có tính chống chịu cao với các nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá mới đợc
giám định gần đây.
Năm 1968, Sakaguchi và CS đã khảo nghiệm 863 giống lúa đợc trồng phổ
biến ở nhiều nơi trên thế giới và phát hiện giống lúa Lead của Miến Điện, TKM6 và
Nigeria 5 chống chịu khá với hầu hết các nhóm vi khuẩn gây bệnh bạc lá thuộc các
nòi khác nhau [9], [11].
ở việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu để chọn tạo giống lúa mang gen kháng
bệnh bạc lá. Nh ở Viện Lúa Đồng bằng sông Ccửu lLong, bằng phơng pháp đánh
giá kiểu gen nhờ chỉ thị phân tử đối với 148 giống lúa địa phơng có nguồn gốc
6
Duyên hải Trung Bộ cho thấy các giống lúa: Cà Đung, Ba Túc, Thơm Lung, Vệ
Phích, Lúa Trắng, Nếp Hoa Vàng, Lúa Thớc, Quinkes 85 và Seraup kechil 30 có gen
kháng Xa13; gen kháng Xa5 đợc tìm thấy trên giống Nàng Tri, Trắng Lùn, Be Ren,
Giàu Dumont; giống Lúa Sóc, Lúa Mùa 2, Trắng Quãng, Trắng Phớc, Tàu Hơng,
Nàng Sậu có gen kháng Xa4 [4].
1.3. ứng dụng kỹ thuật RAPD - PCR trong nghiên cứu đa hình ADN
1.3.1. Phản ứng PCR
Kỹ thuật nhân bản ADN đặc hiệu dựa vào phản ứng chuỗi trùng hợp
(Polymerase Chain Reaction) đợc Karry Mullis hoàn thiện vào giữa những năm 80
đã góp phần tạo ra một cuộc cách mạng trong sinh học phân tử. Kỹ thuật PCR là
một phơng pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu và phân tích các gen. Sử dụng
kỹ thuật PCR có thể tạo ra một số lợng lớn các bản sao của đoạn ADN cần tổng hợp
mà không phải tách và nhân dòng. Thực chất PCR là một phơng pháp in vitro
vi tro cho phép nhân bản nhanh một đoạn ADN nào đó mà chỉ cần một khối lợng
mẫu ban đầu hạn chế [8], [5]. Phản ứng PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu
kỳ lặp lại, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:
+ Giai đoạn 1 (Biến biến tính): ADN đợc biến tính ở nhiệt độ khoảng 95

Một chu kỳ gồm 3 bớc trên đợc lặp đi lặp lại nhiều lần và qua mỗi lần làm
tăng gấp đôi số mẫu lần trớc. Sự tăng lợng mẫu này theo cấp số nhân, nên sau n chu
kì số mẫu thu đợc là:
A = x.2
n
Trong đó A: Tổng số bản sao ADN
x: Số lợng phân tử ADN làm khuôn ban đầu
n: Số chu kỳ
Các thành phần cơ bản của một phản ứng PCR gồm: ADN khuôn, hai đoạn
mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN, Taq polymerase, hỗn hợp bốn tiền
chất deoxynucleotit, dung dịch đệm chứa một số cation hóa trị 1, ion Mg
2+
và dung
môi (nớc khử ion khử trùng).
- Enzym Taq polymerase:
Enzym Taq polymerase là enzym chịu nhiệt, đợc tách từ vi khuẩn suối nớc
nóng Thermus aquaticus. Enzym Taq có trọng lợng phân tử là 94 kDa và không mất
hoạt tính ở nhiệt độ cao trong giai đoạn gây biến tính ADN, nhng hoạt tính của
enzym Taq giảm 50% sau 150 phút ở nhiệt độ 92,5
0
C; sau 40 phút ở nhiệt độ 95
0
C
và sau 5 - 6 phút ở nhiệt độ 97
0
C. Nếu nhiệt độ tăng lên tới 95
0
C trong 20 giây để
biến tính ADN kép thành sợi đơn thì hoạt tính enzym Taq còn lại 65% sau 50 chu kì
phản ứng.

lặp.
- Các nucleotit (dNTPs):
Là hỗn hợp của bốn loại deoxyribonucleotit (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) làm
nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp ADN. Tuỳ thuộc vào mục đích nghiên cứu, các
nhà khoa học còn có thể sử dụng một số nucleotit đã đợc thay đổi nh gắn thêm
biotin hoặc digoxigenin... Nồng độ phản ứng của các dNTP thờng dùng vào khoảng
200 mM mỗi loại, tuy nhiên ở nồng độ dNTP thấp (10 - 100 mM) Taq ADN
polymerase hoạt động chính xác hơn. Hơn nữa, nồng độ tối u của chúng phụ thuộc
vào rất nhiều yếu tố nh:
+ Nồng độ Mg
2+

+ Nồng độ chất mồi
+ Độ dài của sản phẩm đợc khuyếch đại
+ Số chu kỳ của phản ứng
- Dung dịch đệm (buffer)
Thành phần của dung dịch đệm phụ thuộc vào loại enzym polymerase đợc sử
dụng. Trong dung dịch đệm quan trọng nhất là ion Mg
2+
. Ion Mg
2+
làm tăng nhiệt độ
nóng chảy (Tm) của ADN mạch đôi, tạo ra phức chất tan với dNTPs để hình thành
cơ chất mà enzym polymerase có thể nhận ra, điều này rất cần thiết cho quá trình
liên kết của các dNTP. Nồng độ Mg
2+
trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng biến đổi từ
0,5 - 5,0 mM (nồng độ này có thể thay đổi khi cần thiết). Nồng độ ion Mg
2+
quá

dụng kỹ thuật RFLP có thể tạo nên các đoạn cắt khác nhau đợc phân biệt bằng ph-
ơng pháp điện di. Nhợc điểm của kỹ thuật này là quy trình phức tạp, cồng kềnh, khó
tự động hoá, tốn kém và sử dụng chất đồng vị phóng xạ gây nguy hiểm cho ngời
thao tác [3], [8].
- Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats) hay còn gọi là vi vệ tinh
(microsatellites), là một đoạn ADN có sự lặp lại của một trật tự nucleotit đơn giản
nào đó. Kỹ thuật SSR cho phép phát hiện đợc tính đa hình về độ dài các trật tự
nucleotit đơn giản. Nhợc điểm của kỹ thuật SSR là tốn kém về tiền của, công sức
trong việc xây dựng cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình (để xây dựng các cặp
mồi đặc hiệu cần tách dòng và đọc trình tự một số lợng lớn các đoạn ADN hệ gen
chứa đoạn lặp lại) [8], [3].
10
- Kỹ thuật RAPD (còn đợc gọi là kỹ thuật phân loại phân tử): đợc sử dụng để
phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các giống cây trồng hay giữa các
cá thể, phục vụ cho công tác lai tạo giống hoặc phân loại. Ưu điểm của kỹ thuật này
là nhanh, rẻ, đơn giản và giúp xác định tính đa dạng sinh học, nguồn gốc di truyền
của các giống động vật, thực vật, vi sinh vật.
Năm 1990, William và CS đã phát triển kỹ thuật RAPD (Random Amplified
Polymorphic ADN) trên cơ sở PCR. Về cơ bản, kỹ thuật này sử dụng những đoạn
mồi ngắn khoảng 4 - 10 nucleotit không đặc trng để tiến hành phản ứng PCR. Nhng
đối với mỗi đối tợng, ta phải tiến hành sàng lọc để chọn lọc đợc một số mồi thích
hợp [1]. Sản phẩm PCR khi dùng với mồi ngẫu nhiên thờng đa dạng, có chiều dài từ
100 - 5000 nucleotit và khi điện di trên gel agarose đợc phân tách thành các phân
đoạn khác nhau. Tính đa dạng thu đợc nhờ kỹ thuật RAPD là đáng tin cậy vì khi có
sự thay đổi một bazơ nitơ nào đó thì nó sẽ ngăn cản sự tiếp hợp của mồi với ADN
khuôn. sự mất đoạn nhiễm sắc thể hoặc sự thêm bớt điểm gắn mồi cũng nh sự xen
vào một gen nào đó sẽ làm thay đổi kích thớc của đoạn ADN đợc nhân bản. mỗi
đoạn mồi có thể tạo ra một hoặc một vài sự đa dạng, có thể phát hiện đợc và cho ra
phổ điện di đặc trng. Kỹ thuật RADP đợc sự dụng trong các mục đích nghiên cứu đa
hình di truyền, lập bản đồ gen liên kết và phân tích con lai F1.

đồ RAPD (RAPDLOT). Thực chất kỹ thuật này gồm 3 bớc:
+ Bớc 1: So sánh từng cặp đối tợng trong nghiên cứu bằng cách tính toán
khoảng cách quan hệ giữa chúng
+ Bớc 2: Lập một ma trận gồm tất cả những giá trị tính toán đợc trớc đó
+ Bớc 3: Giải ma trận và biễu diễn thành một biểu đồ đặc trng [17]
Ngày nay, các nhà nghiên cứu đã thiết lập đợc phần mềm máy tính để tự
động vẽ nên biểu đồ mối quan hệ hay độ tơng đồng di truyền của các đối tợng
nghiên cứu sau khi nhập dữ liệu về các phân đoạn đợc nhân bản của các cá thể.
NTSYS pc version 2.0 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) là tên của một chơng
trình thuộc kiểu trên để lập ra biểu đồ hình cây. Biểu đồ hình cây thu đợc sẽ thể hiện
mức độ gần nhau của các cá thể cho phép đánh giá đợc mối quan hệ di truyền giữa
các cá thể đợc nghiên cứu. Chơng trình này cho phép giảm bớt thời gian nghiên cứu
và có độ chính xác cao nên nó là một phần mềm có hiệu quả trong việc phân tích kỹ
thuật RAPD.12
Chơng 2. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
2.1. Đối tợng nghiên cứu
2.1.1. Đối tợng nghiên cứu
Đối tợng nghiên cứu tính đa dạng ADN là 36 giống lúa có nguồn gốc, tính
kháng khác nhau với kháng bệnh bạc lá vi khuẩn có nguồn gốc và tính kháng bệnh
khác nhau do do Bộ môn Di truyền Miễn dịch, Viện Khoa học Kkỹ thuật Nnông
nghiệp Việt Nam cung cấp (trình bày nh trong bảng 1, điểm đánh giá tính khángchỉ
mới d/nhiễm của các giống lúa chỉ với một nòi vi khuẩn phổ biến ở vùng Đồng bằng
sông Hồng).
Bảng 1. Danh sách tập đoàn giống lúa kháng bệnh bạc lá vi khuẩn
STT Tên giống Nguồn gốc Điểm
1 OM3499-5 Việt Nam 4,0
2 OM3242-50 Việt Nam 5,0

ấn độ
1,0
28 BBL72-99
ấn độ
3,0
29 KBL75-99
ấn độ
3,0
30 KBL53-99
ấn độ
5,0
31 Khang dân Trung Quốc 57,0
32 Chiêm hơng Trung Quốc 9,0
33 Q5 Trung Quốc 7,70
34 DÔ115 Việt Nam 57,0
35 KB1 Việt Nam 7,70
36 TN1 Việt Nam 7,70
Ghi chú 1: Kháng cao 3: Kháng 5: Kháng vừa 7: Nhiễm vừa 9: Nhiễm nặng
13
2.1.2. Hoá chất và thiết bị sử dụng:
- Hoá chất và thiết bị máy móc: Hoá chất và thiết bị sử dụng đợc ghi kèm tên hãng
sản xuất cho tiện theo dõi: Taq ADN polymerase (Perkin-Elmer); Máy tổng hợp
oligonucleotit tự động - Gene Assemble (Pharmacia, Thụy Điển); Máy đo quang
phổ: Diode Array Spectrophotometer (Hewlett Parkard, Mỹ); Máy ly tâm
Avanti
TM
30 (Beckman, Mỹ)
- Các mồi sử dụng trong phản ứng RAPD: Các mồi ngẫu nhiên sử dụng cho việc
phân tích genom của 36 giống lúa kháng bệnh bạc lá lúa vi khuẩn do Phòng Công
nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp. Trình tự các mồi dài 10

14