TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BÁO CÁO
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
Sơ bộ tìm hiểu vai trò của vi khuẩn lactic trong quá trình
sản xuất mắm tôm chua
Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS. Lương Đức Phẩm
Cố vấn Viện Công nghệ sinh học
TS. Nguyễn Văn Giang
Khoa Công nghệ sinh học
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội
Sinh viên thực hiện : Chu Đức Hà
Lớp : CNSH - K51
“Khóa luận đệ trình Khoa CNSH, Trường ĐH Nông Nghiệp Hà Nội là một phần yêu cầu của
trình độ đại học ngành Công nghệ sinh học".
HÀ NỘI - 2010
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này em xin bày tỏ sự biết ơn vô cùng sâu
sắc tới thầy PGS. TS. Lương Đức Phẩm – Nghiên cứu viên cấp cao thuộc Viện Công
nghệ Sinh học – Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam và thầy TS. Nguyễn Văn
Giang – Trưởng BM. Công nghệ Vi sinh & Sinh học phân tử – Khoa Công nghệ Sinh
học – ĐH Nông nghiệp Hà Nội về những hướng dẫn tận tình, chu đáo bên cạnh những
kiến thức xã hội bổ ích khác.
Bên cạnh đó, em cũng xin chân thành cám ơn sự giúp đỡ quý báu, nhiệt tình
của tập thể cán bộ thuộc:
2.2. Sơ lược về sản phẩm mắm tôm chua truyền thống Việt Nam 9
2.2.1 Giá trị dinh dưỡng của mắm tôm chua truyền thống Việt Nam 9
2.2.2. Các phương thức sản xuất mắm tôm chua truyền thống 10
2.2.2.1 Quy trình sản xuất mắm tôm chua miền Bắc 10
2.2.2.2 Quy trình sản xuất mắm tôm chua miền Trung: 11
2.2.2.3 Quy trình sản xuất mắm tôm chua miền Nam: 11
2.3. Cơ sở khoa học trong sản xuất mắm tôm chua – Lên men lactic 13
2.3.1. Quá trình lên men lactic 13
2.3.2. Vi khuẩn lactic 14
2.4. Tình hình nghiên cứu ở trong và ngoài nước 25
2.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 25
2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 26
PHẦN III
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
3.1. Vật liệu nghiên cứu 28
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 28
3.1.2. Hóa chất 28
3.1.3. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 29
3.1.4. Môi trường cơ bản sử dụng cho nghiên cứu 30
3.2. Địa điểm nghiên cứu 31
ii
3.3. Thời gian nghiên cứu: 15/02/2010 – 31/07/2010 31
3.4. Phương pháp nghiên cứu 32
3.4.1. Các thí nghiệm 32
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu 37
PHẦN IV
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 42
4.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic từ mắm tôm chua
42
4.1.1. Thí nghiệm 1.1 – Phân lập các chủng vi khuẩn trên môi trường MRS dựa theo khả
4.6.3. Quy trình sản xuất mắm tôm chua đề nghị 73
PHẦN V
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76
5.1. Kết luận 76
5.2. Đề nghị 76
TÀI LIỆU THAM KHẢO 78
iii
PHỤ LỤC 81
iv
DANH MỤC VIẾT TẮT
VSV Vi sinh vật
VK Vi khuẩn.
LB Lauria Broth
MRS de Man, Rogosa and Sharpe.
TB Trung bình
R Số lần nhắc lại
CT Công thức
v
DANH MỤC BẢNG
ĐỀ TÀI: 1
Bảng 2.1: Tóm tắt đặc điểm địa lý và khí hậu của Việt Nam (Phạm Thược, 1995) 3
Bảng 2.2: Phân loại khoa học của tôm 6
Bảng 4.1: Kết quả phân lập 6 chủng VK từ mắm tôm chua 42
Bảng 4.2: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 2 chủng NB1 và NB5 44
Bảng 4.3: Khả năng đồng hóa các loại đường của 2 chủng NB1 và NB5 48
Bảng 4.4: Đặc điểm phân loại học 2 chủng NB1 và NB5 49
Bảng 4.5: Khả năng sinh trưởng của 2 chủng VK lactic xác định qua trị số đo OD-
620 nm 50
Bảng 4.6: Kết quả theo dõi sự hình thành vòng tròn hoạt tính sinh acid lactic của 2
chủng NB1 và NB5 54
Hình 4.7: Vòng tròn hoạt tính sinh acid lactic khuếch tán trên lỗ thạch
của chủng NB1 57
Hình 4.8: Vòng tròn hoạt tính sinh acid lactic khuếch tán trên lỗ thạch
của chủng NB5 57
Hình 4.9: Khả năng sinh bacterioxin của chủng NB1 kháng Bacillus sp 60
Hình 4.10: Khả năng sinh bacterioxin của chủng NB1 kháng Pseudomonas sp. 61
Hình 4.11: Vòng tròn kháng khuẩn của chủng NB1 với Bacillus sp 65
Hình 4.12: Vòng tròn kháng khuẩn của chủng NB1 với Staphylococcus “vàng”
65
Hình 4.13: Vòng tròn kháng khuẩn của chủng NB5 với E.Coli 65
Hình 4.14: Sự khác nhau giữa màu sắc tôm của 3 công thức lên men sau 5 ngày
68
Hình 4.15: Sự khác nhau giữa màu sắc dịch mắm của 3 công thức lên men
sau 10 ngày 69
Hình 4.16: Lọ mắm tôm chua được lên men theo công thức cải tiến 72
vii
TÓM TẮT
Mắm tôm chua là một món ăn đặc sản truyền thống, mang đậm đà bản sắc dân
tộc của Việt Nam. Đây là một món ăn đã có từ lâu đời, được làm từ nguồn nguyên liệu
tôm phong phú ở Việt Nam. Bên cạnh những giá trị văn hóa và tinh thần mà nó mang
lại, mắm tôm chua còn cung cấp đầy đủ dinh dưỡng, có khả năng bổ sung cho hệ tiêu
hóa những VSV có lợi, tăng cường khả năng tiêu hóa của cơ thể và tránh một số bệnh
ở người. Chính vì vậy, từ 3 nguồn mẫu mắm tôm chua thu thập được, chúng tôi đã tiến
hành phân lập và đánh giá thành công 2 chủng VK lactic NB
1
thuộc chi Streptococcus
và NB
5
thuộc chi Lactobacillus. Qua đó, chúng tôi bước đầu tìm hiểu các đặc tính sinh
acid lactic và khả năng sinh bacterioxin của chúng. Bên cạnh đó, tìm hiểu ảnh hưởng
cứu kỹ và phát triển thành sản phẩm công nghiệp mà chỉ được sản xuất ở quy mô gia
đình với sản lượng khiêm tốn.
Nước ta có nguồn lợi tôm rất lớn, tôm ngoài tiêu thụ trong nước còn được xuất
khẩu ra nước ngoài dưới dạng tôm lạnh đông. Sản lượng tôm tuy lớn nhưng thực tế
lượng tôm có đủ phẩm chất để làm lạnh đông chiếm một tỷ lệ không quá 40 % sản
lượng tôm nói trên. Số tôm còn lại phải xếp vào thứ phẩm, chất lượng bị giảm đi rất
nhiều trong quá trình bảo quản và chuyên chở. Lượng tôm không đủ tiêu chuẩn để
xuất khẩu lạnh đông, cũng như phân phối tươi được đưa vào các sản phẩm tôm chế
biến, trong đó có mắm tôm chua.
Với lợi thế ở thời gian bảo quản dài, dễ dàng cho việc lưu thông và phân phối,
hương vị thơm ngon, sản phẩm tôm chua nếu được đầu tư cho nghiên cứu và sản xuất
có thể trở thành mặt hàng đáng giá trong tương lai. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài:
“Sơ bộ tìm hiểu vai trò của vi khuẩn lactic trong quá trình sản xuất mắm tôm
chua.”
1.2. Mục đích – Yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Bước đầu tìm hiểu cơ sở khoa học trong công nghệ sản xuất mắm tôm chua và
mạnh dạn đề xuất một quy trình công nghệ cho sản phẩm này ở quy mô công nghiệp.
1.2.2. Yêu cầu
1
o Sơ bộ xác định hệ VK lactic có trong sản phẩm.
o Tìm hiểu một số đặc tính sinh học của các chủng sinh acid lactic.
o Sử dụng các chủng đã thu được vào ứng dụng sản xuất quy mô phòng thí
nghiệm.
o Đề ra một quy trình công nghệ sản xuất mắm tôm chua ở quy mô công nghiệp.
2
PHẦN II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về nguồn nguyên liệu tôm ở Việt Nam
2.1.1. Nguồn lợi và tình hình thương mại tôm ở Việt Nam
mặn, vịnh, đầm phá, vùng triều …
700.000 (ha)
Sông ngòi Chiều dài hàng nghìn km
Các hệ thống sông chính
Sông Cửu Long, sông Hồng và rất nhiều
các hệ thống sông nhỏ hơn.
Phân tích đơn giản như ở vùng đồng bằng Sông Cửu Long có nền nhiệt độ điển
hình từ 20 – 35
o
C, cho phép người dân nuôi hai vụ tôm trong năm. Tại khu vực miền
Bắc, do có một mùa đông lạnh rõ rệt kéo dài từ tháng 11 đến tháng 3 năm sau, nhiệt độ
3
dao động từ 9 – 39
o
C nên nông dân chỉ có thể nuôi một vụ tôm trong năm (Phạm
Thược và cộng sự, 2003).
Qua khảo sát và thống kê cho thấy, vùng Đồng bằng Sông Cửu Long là nơi có
diện tích nuôi tôm nước lợ lớn nhất cả nước, chiếm 87.2 % tổng diện tích nuôi tôm
nước lợ của cả nước tương đương 75.95 % diện tích nuôi thủy sản của Đồng bằng
Sông Cửu Long (Phạm Thược, 1995).
Có thể nói rằng, với điều kiện tự nhiên thuận lợi như vậy, được sự chỉ đạo đúng
đắn của Nhà nước, tôm đang là một nguồn lợi được chú trọng phát triển và nâng cao
cả về số lượng và chất lượng, chiếm tỷ trọng lớn trong nền kinh tế quốc dân.
2.1.1.2. Tình hình thương mại tôm ở Việt Nam
Ngành thủy sản ở Việt Nam, cũng như ở các nước trên thế giới, đã và đang
đóng góp một phần quan trọng cho việc đảm bảo an ninh lương thực, nguồn chất dinh
dưỡng, sinh kế, tạo thu nhập và việc làm cho người dân. Theo số liệu của các cuộc
điều tra về tiêu dùng thực phẩm, ước tính các sản phẩm thủy sản đã cung cấp 50 %
lượng protein trong bữa ăn của người Việt Nam. Lượng tiêu dùng các sản phẩm thủy
sản tính trên đầu người đã tăng từ 13.2 (kg) vào năm 1990 lên 18.7 (kg) vào năm 2000
các đầu vào và mức độ thâm canh như sau (Vũ Huy Thủ, 2003)
• Nuôi tôm quảng canh: Sản lượng tối đa tới 0.5 (tấn/ha/năm).
• Nuôi tôm bán thâm canh: Sản lượng 1 – 2 (tấn/ha/năm).
• Nuôi tôm sú thâm canh: Sản lượng 5 – 6 (tấn/ha/năm).
• Nuôi tôm chân trắng thâm canh: Sản lượng đạt từ 15 – 20 (tấn/ha/năm).
Hiện nay, phần lớn sản lượng tôm nuôi, đặc biệt là tôm sú, được sản xuất từ các
ao nuôi quảng canh (90 % diện tích ao nuôi vẫn còn ở hình thức nuôi này) (Nguyễn
Thanh Phương, 2004). Tuy nhiên, theo xu hướng của các hệ thống nuôi tôm, các cơ
quan của Nhà nước, chính quyền địa phương và đội ngũ cán bộ khuyến ngư đang
tích cực thúc đẩy là ngày càng tăng cường mức độ thâm canh.
Có thể nói thêm rằng, với 3 hình thức nuôi tôm như hiện nay, với chủ trưởng
tăng cường thâm canh của Đảng, sản lượng tôm đang ngày càng tăng về cả số
lượng và chất lượng. Tuy nhiên, chúng ta cũng cần có sự quản lý chặt chẽ và nhận
thực về bảo vệ môi trường để sản lượng tôm tăng trong sự phát triển bền vững.
2.1.2. Đặc điểm phân loại học và sinh vật học của tôm
5
2.1.2.1. Phân loại khoa học của tôm
Theo hệ thống phân loại sinh giới, ta có thể xác định đơn vị phân loại học
của tôm như sau (Nguyễn Thanh Phương và cộng sự, 2009)
Bảng 2.2: Phân loại khoa học của tôm
Đơn vị phân loại
Tiếng Việt
Đơn vị phân loại
Tiếng Anh
Tên Tiếng Việt Tên Tiếng Anh
Giới Kingdom Động vật Animalia
Ngành Phylum Chân khớp Arthropoda
Lớp Class Giáp xác Malacostraca
Bộ Order Mười chân Decapoda
Họ Family Tôm he Penaeoidae
thuộc họ Penaeid nói chung có thành phần hóa học cấu tạo cơ thể đều như nhau, bao
gồm các thành tố cơ bản phải kể đến như nước, protein, lipid, hydratecacbon, khoáng
chất, vitamine … Trong đó, nước, protein, lipid và các khoáng chất chiếm hàm lượng
tương đối nhiều, trong khi hàm lượng hydratecacbon trong tôm chỉ chiếm tỷ lệ rất ít và
thường tồn tại dưới dạng glycogen [5], [8].
Thành phần, hàm lượng và tỷ lệ các chất trong cơ thể tôm nói chung luôn ở
7
mức cân bằng động, sự thay đổi của chúng phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của cơ thể.
Đối với cùng một loài thì các yếu tố vô sinh như các điều kiện tự nhiên (nhiệt độ, độ
mặn của nước biển, thời tiết …) và các yếu tố hữu sinh như điều kiện về thức ăn …
cũng có ảnh hưởng nhất định đến sự thay đổi hàm lượng các chất trong cơ thể tôm [8].
a. Nước
Tôm là động vật sống dưới nước, vì vậy, tỷ lệ nước trong cơ thể của chúng khá cao.
Người ta ước tính rằng, trong cơ thịt của tôm chứa khoảng 70 – 80 % nước [5], [6].
Hàm lượng nước thay đổi phụ thuộc vào giống, loài tôm và tình trạng dinh
dưỡng của tôm (nghĩa là phụ thuộc vào điều kiện thức ăn …).
Trong giai đoạn đẻ trứng, tôm thường trải qua giai đoạn nhịn đói nhiều lần, làm
giảm số năng lượng dự trữ trong mô cơ, và dẫn đến làm tăng hàm lượng nước trong cơ
thể tôm.
Về vai trò của nước đối với sinh vật dưới nước nói chung và tôm nói riêng,
nước đóng vai trò vô cùng quan trọng và thiết yếu. Một cách cơ bản, nước làm dung
môi hòa tan cho các chất vô cơ và hữu cơ, tạo ra môi trường cho các phản ứng sinh lý,
sinh hóa, hóa sinh xảy ra trong tế bào, dẫn đến các hoạt động sinh lý của cơ thể tôm.
Đồng thời, nước cũng tham gia vào rất nhiều các phản ứng hóa học và có ảnh hưởng
lớn đến các phản ứng của protein (đặc biệt là protein cấu thành nên enzyme) [6].
Trạng thái của nước trong cơ thể tôm phụ thuộc nhiều vào sự tương tác giữa cấu
trúc của nước và các chất dinh dưỡng khác trong tế bào, đặc biệt là với các đại phân tử
protein.
Vì vậy, những thay đổi về hàm lượng nước trong tôm được gây ra bởi quá trình
chế biến sẽ có ảnh hưởng mạnh, tác động hai mặt đến tính thẩm thấu, giá trị dinh
Nhóm vi khuẩn hiếu khí trong nước: Pseudomonas liquefacciens sp. …
Nhóm vi khuẩn yếm khi trong nội tạng (đầu tôm): Clostridium sp.,
Escherichia coli, Samonella. Các vi khuẩn này tham gia vào quá trình ươn thối ở tôm.
Mặt khác, đầu tôm là nơi chứa cơ quan nội tạng, trong đó có bộ máy tiêu hóa.
Hai enzyme protease thuộc hệ VSV trên ảnh hưởng đến quá trình làm mắm tôm chua
sau này là enzyme tripsin và pepsin.
2.2. Sơ lược về sản phẩm mắm tôm chua truyền thống Việt Nam
2.2.1 Giá trị dinh dưỡng của mắm tôm chua truyền thống Việt Nam
9
Mắm tôm chua là một món ăn có từ lâu đời, được làm từ nguồn nguyên liệu
tôm phong phú. Mắm tôm chua là một thứ mắm hấp dẫn có thể ăn kèm với nhiều món
khác nhau.
Mắm tôm chua là một sản phẩm truyền thống, mang đạm đà bản sắc dân tộc,
vùng miền của Việt Nam. Nó đã trở thành một trong những món ăn khoái khẩu của
nhiều người, ở nhiều vùng miền trong cả nước. Nó không những mang phong cách dân
giã như trước đây, mà đã trở thành một món ăn đặc sắc, sang trọng. Chẳng hạn như ở
Huế, món Tôm chua là một đặc sản được nhiều người biết đến, hầu hết các du khách,
khách vãng lai … khi một lần đến Huế thì không thể không thưởng thức món đặc sắc
này. Trong các bữa tiệc sang trọng, bữa cơm thân mật trong gia đình hoặc tiếp đãi
khách thường có món Tôm chua. Thậm chí nó còn phổ biến ở một số cộng đồng người
Việt Nam sống ở nước ngoài [29].
Xét về mặt y sinh học, mắm tôm chua còn cung cấp cho hệ tiêu hóa các VSV có
lợi (ở đây là các VK lactic), giúp tăng cường sự tiêu hóa và tránh một số bệnh ở người.
2.2.2. Các phương thức sản xuất mắm tôm chua truyền thống
Trước đây, ở nước ta chỉ có hai cách làm mắm tôm chua truyền thống – hay còn
gọi là muối tôm chua, một ở Huế và một ở Đồng Hới. Hiện nay, do nghề sản xuất mắm
tôm chua đã được mở rộng và phát triển rộng khắp cả nước, mỗi địa phương có những
phương pháp với quy trình công nghệ khác nhau. Tựu chung lại, người ta chia các quy
trình sản xuất mắm tôm chua truyền thống thành 3 miền: Miền Bắc (đại diện là Thái
Bình), Miền Trung (đại diện là Huế), Miền Nam (đại diện là ở đồng bằng Sông Cửu
2.2.2.2 Quy trình sản xuất mắm tôm chua miền Trung:
Quá trình muối tôm chua ở miền Trung (Huế, Đồng Hới) có khác một ít so với muối
tôm chua ở miền Bắc, người ta thường thay và sử dụng thính, một ít đường thay cho cơm
nếp. Tôm chua được muối theo tỷ lệ như sau: 10 chén tôm, 1 chén muối rang, 1 chén thính
gạo tẻ, 1 thìa đường, 1 chén gia vị (tỏi, riềng, gừng), 1 chén rượu nhỏ. Trước khi gài nén,
người ta dùng lá ổi rải lên bề mặt tôm. Sau 18 – 20 ngày tôm chua bắt đầu ăn được. Màu của
thính làm cho màu của tôm chua thành phẩm tối đi [29], [30].
2.2.2.3 Quy trình sản xuất mắm tôm chua miền Nam:
Tôm rửa sạch, bỏ đầu (tránh hiện tượng bị biến đen) muối với muối ăn, mật
ong, gia vị. Sau 7 ngày cho thêm một ít đường vào. Tôm chua muối theo phương pháp
này sau 20 ngày thì ăn được. Thành phẩm đóng trong các chai xá xị. Điểm đặc biệt của
phương pháp muối tôm chua này là dùng các thanh mía chẽ mỏng để cài nén tôm khi
muối[33].
Quy trình được khái quát như sau [29], [30]: Tôm rảo lựa con nhỏ, rửa sạch cát,
11
hớt một chút trên đầu và dưới đuôi, ướp muối một đêm (một chén tôm với một thìa
muối sống). Lúc ướp tôm, muốn cho tôm dai thì cho vài một ít phèn chua tán nhỏ. Lấy
một ít nếp vo sạch, nấu chín. Măng vòi, tỏi, riềng, ớt các thứ đều nhau, 2 thìa rượu
trắng, 1 thìa mật ong hoặc 1 thìa đường, 1 lít nước muối (10 %), các thứ trộn chung
với tôm cho đều, cho toàn bộ nguyên liệu vào chum, lấy lá riềng đậy lên, gài kín, bịt lá
ra ngoài.
Phương pháp muối tôm chua trong dân gian, tùy địa phương có những điểm
khác nhau nhưng nhìn chung tôm được muối với muối ăn (muối rang, dạng bột), gia vị
(gồm có tỏi, ớt, riềng non …).
2.2.2.4 Quy trình sản xuất chung
Như vậy, chúng tôi tổng kết ra quy trình sản xuất mắm tôm chua theo công thức
chung như sau:
12
2.3. Cơ sở khoa học trong sản xuất mắm tôm chua – Lên men lactic
Trong quy trình làm mắm tôm chua nói chung có nhiều quá trình chuyển hóa
O
6
CH
3
-CHOH-COOH + HOOC-CH
2
-CH
2
-COOH + CH
3
-COOH
(glucose) (acid lactic) (acid xuccinic) (acid axetic)
+ CH
3
-CH
2
OH +CO
2
+ H
2
rượu etylic
2.3.2. Vi khuẩn lactic
2.3.2.1. Lịch sử phát hiện vi khuẩn lactic
VK lactic được con người sử dụng từ rất lâu rồi để bảo quản và chế biến thực
phẩm. Năm 1780 acid này mới được phát hiện và tách ra từ sữa bò lên men do nhà
khoa học người Thụy Điển Carl Wilhelm tìm ra và gọi tên là “acid sữa”. Trở lại lịch sử
của những năm trước thế kỷ 20, thuật ngữ “vi khuẩn lactic” sử dụng để chỉ những VK
làm chua sữa. Năm 1857, Louis Pasteur đã tìm ra từ sữa bị chua (lactic có nghĩa là
sữa) tất cả các VSV lên men lactic thuộc họ Lactobactericeae (ngày nay gọi là
Lactobacterium). Năm 1873 J. Lister lần đầu tiên phát hiện được một loài VK đặt tên
2
. Có 2 loài đặc trưng là L.
mensenteroides và L. lactis [22].
15
Hình 2.4: Ảnh chụp tế bào của Leuconostoc sp.
c. Pediococcus
Cầu khuẩn, tồn tại dưới dạng bát cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn, hoặc xếp song đôi.
Lên men đường glucose theo con đường EMP, axit tạo thành có dạng DL, D(-) hay
D(+). Có ba loài đặc trưng là P. acidilactici, P. dextranicum, P. halophilus [22].
Hình 2.5: Ảnh chụp tế bào của Pediococcus sp.
d. Streptococcus và Lactococcus
Cầu khuẩn, xếp đôi hoặc chuỗi. Có khả năng lên men đường hexoza thành acid
lactic và các loại đường khác. Có ba loài đặc trưng được sử dụng trong sữa: S. lactis,
S. cremoris, S. thermophilus [22].
16