Luận Văn Tốt Nghiệp
Đề Tài : Nghiên cứu hoàn thiện và thử
nghiệm công nghệ điều chế vindolin,
catharanthin và vinblastin từ lá Dừa cạn
Việt nam làm nguyên liệu sản xuất thuốc
chống ung thư
1
LỜI MỞ ĐẦU VÀ NHIỆM VỤ ĐỀ TÀI
Trên thế giới, đi tiên phong và thành công trong việc triển khai sản xuất thuốc
chống ung thư từ các ancaloid Dừa cạn và phải kể đến các công ty như: công ty Eli Lilly
- Mỹ với sản phẩm thuốc tiêm VELBAN

đi từ vinblastin sunfat chỉ định điều trị các
bệnh Hodgkin, ung thư máu, ung thư biểu mô tinh hoàn, u Kaposi, ung thư dạ con; công
2
ty Pharmacia Corporation Kalamazoo - Mỹ với sản phẩm thuốc tiêm VINCASAR PSF
đi từ vinblastin sunfat và vincristin sunfat chỉ định đặc hiệu điều trị bệnh bạch cầu ác
tính; công ty Pierre Fabre - Cộng hòa Pháp với sản phẩm thuốc tiêm và viên nén
NAVELBINE

đi từ vinorelbin tartrat được bán tổng hợp từ vindolin và catharanthin,
được chỉ định đặc hiệu điều trị ung thư vú và ung thư phổi, có thể sử dụng độc lập hoặc
phối hợp điều trị với cisplatin; .v.v
Ngày nay các quốc gia và vùng lãnh thổ có thể trồng được Dừa cạn đều đã chủ
động nghiên cứu và triển khai sản xuất vinblastin và các dẫn xuất như Trung Quốc, Ấn
Độ, Pakistan, Hàn Quốc, Nhật Bản và các nước Trung Á, Bắc Phi, .v.v Có thể nêu một
vài con số theo thống kê vào năm 2002 của FAO làm ví dụ: Madagasca xuất khẩu 1000
tấn (khô) lá và hoa Dừa cạn hàng năm; Ở Hungari, năng suất lá và hoa Dừa cạn đạt tới
1,5 - 2 tấn lá khô/ha/năm; Ở Ấn Độ, riêng tập đoàn Cipla hàng năm sản xuất khoảng 15 -
25 kg vinblastin sunfat và vincristin sunfat; Chúng ta đều biết, do độc tính cao, nên
vincristin được sử dụng trong điều trị ung thư máu ít hơn nhiều so với vinblastin, vậy mà

Xuất phát từ những thực tế nêu trên, được sự hỗ trợ của Tổng Công ty Hóa chất
Việt Nam, chúng tôi đã đề xuất và thực hiện đề tài “Nghiên cứu hoàn thiện và thử
nghiệm công nghệ điều chế vindolin, catharanthin và vinblastin từ lá Dừa cạn Việt nam
làm nguyên liệu sản xuất thuốc chống ung thư” nhằm đạt được các mục tiêu:
1. Có được quy trình công nghệ chiết tách các ancaloid Vindolin và Catharanthin
từ lá Dừa cạn Việt Nam làm nguyên liệu tổng hợp Vinblastin
2. Đề xuất được quy trình công nghệ bán tổng hợp vinblastin từ vindolin và
catharanthin phù hợp điều kiện Việt Nam.
Chương I
TỔNG THUẬT TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU
TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC
1.1 Các nghiên cứu công nghệ chiết xuất và bán tổng hợp trên thế giới
4
1.1.1 Vài nét về cây Dừa cạn và các Vinca ancaloid
Cây Dừa cạn Vinca rosea L. (Catharanthus roseus (L.) G. Donn.) thuộc họ Trúc
đào (Apocynaceae) phân bố rộng rãi trên nhiều nước nhiệt đới, đặc biệt ở Việt Nam và
Madagasca, ở các nước phương Tây cây này thường được biết đến dưới tên gọi là
Madagascan periwinkle. Trong dân gian, cao sắc nước của lá và hoa Dừa cạn được sử
dụng để chữa mắt, tiêu viêm, cầm máu và làm dịu vết đốt của côn trùng. Đặc biệt, theo y
học cổ truyền ở Ấn Độ, Madagasca và Việt Nam, các thầy lang còn dùng lá Dừa cạn để
trị bệnh tiểu đường [1, 2].
Năm 1952, khi nghiên cứu tác dụng của các ancaloid từ lá Dừa cạn lên chuột , R.
Noble và C. Noble đã phát hiện ra các hợp chất này có khả năng làm giảm số lượng bạch
huyết cầu trong máu chuột. Từ đó, theo định hướng nghiên cứu các chất gây độc tế bào
hoặc gây ức chế phân bào bạch cầu ác tính, các Vinca ancaloid có hoạt tính như
vinblastin, vincristin, vindesin và vinorelbin đã được phát hiện hoặc bán tổng hợp để ứng
dụng trong điều trị ung thư, đặc biệt là các bệnh Hodgkin và các bệnh ung thư máu.
Năm 1958, lần đầu tiên Noble và Beer đã phân lập được vinblastin - còn gọi là
vincaleukoblastin từ lá cây Dừa cạn; trong các năm 1959 đến 1962, Johnson và Svoboda
đã tìm ra vincristin - một ancaloid hàm lượng thấp trong cây Dừa cạn. Hợp chất muối

1.1.2 Một số nét tiêu biểu của các công nghệ phân lập Vinca ancaloid
Vinblastin và vincristin là các ancaloid dimeric indol-indolin, tích tụ trong lá và
hoa của cây Dừa cạn với hàm lượng thấp (10
-5
- 10
-4
%), do đó việc phân lập tinh khiết
các chất này thường rất phức tạp và đòi hỏi kỹ thuật chiết tách ở trình độ cao. Mặc dầu
vậy, hiện nay các quy trình công nghệ chiết Dừa cạn vẫn được xây dựng dựa theo
phương pháp chung chiết xuất ancaloid, sử dụng kỹ thuật chiết phân bố bằng các dung
môi hữu cơ khác nhau cùng với việc thay đổi pH phù hợp với từng giai đoạn cụ thể.
Hình 1.1 nêu sơ đồ tóm tắt một số phương pháp chiết tách truyền thống và hiện
đại đang được áp dụng trong nghiên cứu và sản xuất các Vinca ancaloid [4, 5, 11 - 17]:
6
Hình 1.1: Sơ đồ tóm tắt các quy trình chiết và phân lập ancaloid
Theo Noble và cộng sự, lá Vinca rosea L. được chiết bằng hỗn hợp etanol với axít
axetic theo tỷ lệ thích hợp. Cao dịch chiết thu được sau khi cất loại dung môi được hòa
vào dung dịch HCl 2 % và lọc loại sạch tạp chất không tan. Dịch lọc được điều chỉnh tới
pH 4 và chiết rửa bằng benzen để loại bỏ các tạp chất màu và các chất ít phân cực không
có tính kiềm. Dịch nước axít còn lại được trung hòa bằng NH
4
OH rồi đem chiết lấy hỗn
hợp “ancaloid tổng số” (Total alkaloids) bằng benzen và clorofoc [3].
“Ancaloid tổng số” được phân tách bằng sắc ký cột trên chất hấp phụ là nhôm ôxit
hoạt độ 4 - 5 (Woehlem Al
2
O
3
grade IV-V) với hệ dung môi benzen - diclometan rửa giải
theo cách gradient. Các phân đoạn sắc ký được sàng lọc bằng cách kiểm tra hoạt tính gây

thấp hơn so với các phương pháp truyền thống; nhưng có thể tập trung từng nhóm Vinca
ancaloid vào những phần chiết xác định và từ đó tiết kiệm được chi phí phân lập tinh
khiết những ancaloid mong muốn [15, 16, 17].
Nhìn chung, các phương pháp chiết xuất và phân tách ancaloid đang được áp dụng
để nghiên cứu phân lập các ancaloid từ cây Dừa cạn đều có thể thực hiện được trong các
pilot và các phòng thí nghiệm Hóa Dược, Hóa Hữu cơ và Hóa Hợp chất thiên nhiên.
Nhưng các phương pháp này đều có nhược điểm chung là phân chia thành nhiều giai
đoạn thực hiện phức tạp, khó kiểm soát, dễ gây thất thoát sản phẩm, điều này mang ý
nghĩa tiêu cực đối với việc triển khai ở quy mô công nghiệp chiết xuất các hoạt chất có
hàm lượng thấp như các Vinca ancaloid [4 - 17].
Do vậy, để có thể đưa công nghệ ra sản xuất, các quy trình chiết và phân tách nên
được xây dựng thành các chu trình công nghệ hoàn chỉnh khép kín; thay thế các dung
môi độc hại như benzen bằng các dung môi tương đương ít độc và ít ảnh hưởng môi
trường; tối ưu hóa và hiện đại hóa các phép đo kiểm soát quá trình chiết và tách sắc ký.
1.1.3 Bán tổng hợp Vinblastin và các dẫn xuất
Vinblastin và các dẫn xuất là các ancaloid dimeric có hàm lượng thấp (~ 0,01 %
trong lá Dừa cạn khô), trong khi ancaloid chủ yếu của Dừa cạn là vindolin - một trong
hai phần monomer cấu thành vinblastin - có hàm lượng trong lá Dừa cạn lớn hơn 4 đến 5
lần so với vinblastin. Trong quá trình phân tách “ancaloid tổng số” của Dừa cạn bằng sắc
ký hấp phụ, thông thường vindolin và catharanthin được rửa giải ra trước so với
8
vinblastin. Để hạ giá thành thuốc, tận dụng phụ phẩm vindolin, catharanthin cũng như
các Vinca ancaloid khác, các nghiên cứu bán tổng hợp vinblastin và các dẫn xuất từ
vindolin và catharanthin đã được phát triển mạnh mẽ và đưa vào áp dụng trên thế giới từ
cuối những năm 1970 [18 - 25].
Năm 1978, Barnett và cộng sự bằng các phản ứng hidrazin hóa và hidro hóa đã
chuyển hóa vinblastin thành vindesin, ngay lập tức chất này đã được áp dụng trong hóa
trị liệu các bệnh ung thư vú và ung thư phổi dưới tên biệt dược là Eldisine
®
[13]; nhưng

khử là các dẫn xuất dihydronicotinamid. Với tỷ lệ nồng độ các chất phản ứng phù hợp,
hiệu suất vinblastin có thể đạt tới hơn 40 % (Sơ đồ 1) [20].
9
Sơ đồ 1: Tóm tắt các phương pháp điều chế Vinblastin tiừ Vindolin và Catharanthin
3’,4’-Anhydrovinblastin (AVLB) được tạo ra 18 % trong quá trình one-pot tổng
hợp vinblastin từ catharanthin và vindolin. Trong khi đó, nếu chọn lọc thực hiện phản
ứng khử - 1,2 hợp chất trung gian hoạt động iminium bằng tác nhân NaBH
4
, hiệu suất
tạo thành 3’,4’-anhydrovinblastin đạt tới trên 80 % (Sơ đồ 1). Do đó các nghiên cứu bán
tổng hợp vinblastin từ AVLB cũng được đẩy mạnh nhằm tận dụng sản phẩm này và
nâng cao năng suất VLB [23].
10
Sakamoto và các cộng sự (1990) đã phát triển phương pháp ôxy hóa AVLB bằng
FeCl
3
/amoni oxalat và phương pháp này đã được áp dụng tại Công ty Công nghệ Hóa
dầu Mitsui để sản xuất vinblastin. Hiệu suất chuyển hóa AVLB ~ 90 %, hiệu suất tạo
thành vinblastin đạt tới hơn 40 % [23].
Theo hướng sử dụng xúc tác nguồn gốc sinh học làm tác nhân chiral, năm 2006,
Tatsuya và các cộng sự đã công bố kết quả sử dụng kháng thể monoclon anti-vinblastin
MAb-10-A9 làm xúc tác, oxy không khí và NaBH
3
CN được sử dụng làm các tác nhân
oxy hóa - khử hóa; sau 24 giờ, hiệu suất chuyển hóa 3’,4’-anhydrovinblastin tạo thành
vinblastin đạt tới 82,2 %, trong sản phẩm hoàn toàn không có mặt 20’-epi-vinblastin
(leurosidin). Tuy nhiên, việc tổ hợp MAb-10-A9 trên động vật hiện vẫn còn đang ở trong
giai đoạn nghiên cứu và phát triển cho tương lai [6].
1.2 Tình hình nghiên cứu và triển khai trong nước
Ở Việt Nam, cây Dừa cạn mọc tự nhiên suốt từ Bắc vào Nam và cũng được trồng

ancaloid sẽ không được trích ly một cách triệt để ra khỏi các mô thực vật do chúng khá
khó tan trong dung môi cồn nước. Một nét cải tiến trong quá trình chiết so với Noble là
sử dụng axít sunfuric để đẩy các vinca ancaloid trong cao dịch chiết thành dạng muối
sunfat tan trong nước. Đây là dạng muối khá bền và không tan ngay cả trong cồn tuyệt
đối, do đó có thể dễ dàng chiết rửa loại tạp chất lipophin trong dịch chiết bằng
tricloetylen. Nhưng ở đây bộc lộ một nhược điểm là các muối này cũng không hoàn
nguyên trở lại ancaloid hoàn toàn khi sử dụng amoniac để kiềm hóa dịch axít, nên hỗn
hợp “ancaloid tổng số” được chiết từ đây cũng sẽ có mặt cả các muối phân ly trong nước
của ancaloid. Các thành phần này nếu không được loại bỏ trước bằng sắc ký trao đổi ion
sẽ ảnh hưởng mạnh tới độ chọn lọc của quá trình tách sắc ký “ancaloid tổng số” trên cột
nhôm ôxit. Từ đó sản phẩm vinblastin và vinblastin sunfat sẽ không được làm giàu tới
mức độ cần thiết để có thể tinh chế bằng cách kết tinh mà buộc phải điều chế ở dạng
đông khô, rất dễ hút ẩm và bị phân hủy.
Trong nỗ lực tổng hợp toàn phần các Vinca ancaloid, năm 1990, các tác giả Phan
Đình Châu (Đại học Dược Hà Nội), Csaba Szántay (Đại học kỹ thuật Budapest -
Hungary) và các cộng sự đã điều chế thành công các dẫn xuất Vinca ancaloid
monomeric như vincadifformin, (+/-)-3-oxominovine và tabersonin. Tuy nhiên, ngoài
tabersonin thể hiện hoạt tính làm giảm nhẹ huyết áp (khoảng 25 % khi so sánh với
reserpin), các chất này đều chưa tìm được ứng dụng trong điều trị lâm sàng.
Cũng trong những năm 1990, các tác giả Mai Ngọc Tâm (Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam), Bogomil Pyuskyulev (Viện Hàn lâm khoa học Bungari) và các cộng sự đã
sử dụng sắc ký lỏng hiệu lực cao phân tích xác định sự biến đổi hàm lượng vindolin,
catharanthin và vinblastin trong lá Dừa cạn vào các thời kỳ sinh trưởng khác nhau. Đóng
góp vào các hiểu biết về bán tổng hợp, chuyển hóa và cấu trúc của các Vinca ancaloid kiểu
vinblastin, tác giả Mai Ngọc Tâm cùng các cộng sự cũng đã thực hiện những biến cải hóa
học ở các vị trí C-16, C-17 và C-20’ của vinblastin tạo ra dẫn xuất mới ∆
15(16)
-17-deaxetoxy-
20’-deoxy-vinblastin và dẫn xuất tri-O-axetylguanosin ở C-17 của hợp chất này.
Cho tới nay, việc tiếp thu các kỹ thuật phân lập hiện đại và nghiên cứu hoàn thiện

/CH
3
OH thích hợp,
đây là phương pháp có độ chọn lọc cao nhất khi phân tách các Vinca ancaloid.
Ancaloid là các bazơ, bị lưu giữ mạnh trên pha tĩnh silica gel (có tính axít yếu).
Do đó, để giảm thời gian phân tách và tăng tuổi thọ sử dụng của cột tách - giảm tiêu hao
vật tư sắc ký, theo các phương pháp mới hiện nay [13, 16, 17, 24], chúng tôi khử hoạt
tính silica gel bằng NH
4
OH/CH
2
Cl
2
/CH
3
OH (pH ~ 8 - 8,5). Với cột tách được nạp loại
silica gel này, cân bằng tách sắc ký sẽ được thiết lập hoàn toàn theo cơ chế hấp phụ/giải
hấp, có thời gian tách nhanh và dễ điều khiển hơn.
13
1.3.2 Bán tổng hợp vinblastin từ vindolin và catharanthin
Công nghệ bán tổng hợp vinblastin được nghiên cứu dựa trên quy trình của
Sakamoto [23] đã hiệu chỉnh rút ngắn lại theo Verma và các cộng sự [26]. Mặc dù đây
không phải là quy trình cho hiệu suất cao nhất (~ 30 %, trong khi phương pháp
Sakamoto đạt hiệu suất hơn 40 %), nhưng dễ triển khai trong điều kiện Việt Nam. Từ hai
giai đoạn, quá trình tổng hợp được rút ngắn thành phản ứng một nồi (one-pot), các tác
nhân Ôxy hóa - H
2
O
2
, FeCl