TRƯỜNG ĐẠI HOC KHOA HỌC – HUẾ
KHOA SINH HỌC
Tiểu luận
Chủ đề : Sự tổng hợp và ứng dụng của Enzyme
protease
GVHD : ….Trần Thanh Phong
SVTH : Nguyễn Ngọc Phúc
Nguyễn Tuấn Anh
Hồ Thị Thùy Dung
Trần Quang Tuyến
LỚP : CNSH- K32
Huế 21/12/2012
LỜI MỞ ĐẦU

1
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế
phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh
vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm lượng enzyme
được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD,
được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau .
Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme
đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy
phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên.
Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản
xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung để làm
tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực
phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…
Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi
sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ
khuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme
ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống.

và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (60%) .
1.2. Tổng quan về enzyme Protease.
1.2.1. Giới thiệu chung.
Nhóm enzyme protease (peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên
kết liên kết peptit (-CO-NH-)
n
trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối
cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết
este và vận chuyển axit amin.
3

Hình 1.1. Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein.
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế
bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh
vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê ).
So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt.
Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme
rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới
dạng tinh thể đồng nhất.
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có
tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.
4
Hình 1.2. Cấu trúc không gian enzyme Protease.
Hình 1.3. Mô hình phân tử enzyme protease (papain)
1.2.2. Phân loại Protease
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) .
5

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt
động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một
vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase thường hoạt
động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin.
Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường
hoạt động mạnh ở pH trung tính.
+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi
khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường
hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
- Protease acid: pH 2-4
- Protease trung tính: pH 7-8
- Protease kiềm: pH 9-11
7
Phần II:
NGUỒN THU NHẬN ENZYM PROTEASE
2.1. Nguồn động vật:
- Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều
enzyme nhất. Trypsin là men phân giải các protein hỗn hợp, men này do tuyến
tụy tiết ra, tiền thân của nó là trypsinogen, được hoạt hóa bởi Enterokinaza của ruột.
Trypsin là một enzyme có chức năng phân cắt các protein ta ăn vào thành mảnh nhỏ
đồng thời tự phân cắt nó ra mảnh nhỏ.
- Ngoài ra ở tuyến tụy còn tiết ra enzyme Chymotrypsin, enzyme này góp phần
phân giải protein trong ruột non và được chiết xuất từ tụy bò.
- Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm
Protease tên là renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ
phomat. Renin làm biến đổi cazein thành paracazein có khả năng kết tủa trong môi
trường sữa có đủ nồng độ Ca

liên kết peptide trong phân tử protein .
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là
Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi
Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất (Nguyễn
Trọng Cẩn và cs, 1998). Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích
hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu.
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có
khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực
phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các protease
trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm. Chúng được
sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống
thuộc chi Clostridium.

Hình 2.2. Clostridium
10
Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ
20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7-
12 .

Hình 2.3. Bacillus
 Nấm
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng
dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A.
fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum)… Các loại nấm mốc này có khả năng
tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu
các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3.
Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng có
khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho mát.
11


Tuy nhiên trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc, gây
bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp.
Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh vật
có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng
hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó.
13
Phần III :
THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH ENZYM PROTEASE TỪ
VI SINH VẬT VÀ THỰC VẬT
3.1. Thu nhận và làm sạch enzyme Protease từ vi sinh vật.
Nguồn thu protease vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn.
Quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme vi sinh vật bao gồm các giai đoạn
chủ yếu
Hình 3.1. Các công đoạn sản xuất chế phẩm enzyme
14
Tuyển chọn và cải tạo giống
vi sinh vật
Phương pháp bảo quản giống
vi sinh vật
Tách và làm sạch chế phẩm
enzim
Môi trường nuôi cấy vi sinh
vật sinh tổng hợp enzim
3.1.1. Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật cho enzyme có hoạt lực cao.
Để chọn giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao, người ta có
thể phân lập từ môi trường tự nhiên hoặc có thể dùng các tác nhân gây đột biến tác
động lên bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền để tạo thành các biến
chủng có khẳ năng tổng hợp đặc biệt hữu hiệu một loại enzyme nào đó, cao hơn hẳn
chủng gốc ban đầu.
3.1.1.1. Phương pháp gây đột biến.

Xantomonas.
3.1.1.3. Phương pháp tiếp hợp gene.
Khác với biến nạp, ở đây vật liệu di truyền chỉ được truyền từ tế bào cho đến tế
bào nhận khi hai tế bào tiếp xúc với nhau. Do vậy các vi sinh vật có khả năng biến nạp
thì sẽ không có khả năng tham gia tiếp hợp gene nữa. Hiện nay quá trình tiếp hợp gene
đã được nghiên cứu ở một số loài vi khuẩn như E.coli, salmonella, Pseudomonas
aeruginosa.
3.1.1.4. Phương pháp tải nạp
Vật liệu di truyền (ADN) được chuyển từ tế bào cho sang tế bào nhận nhờ vai
trò trung gian của thực khuẩn thể (phage). Trong quá trình tải nạp, các đoạn AND được
chuyển từ tế bào cho đến tế bào tiếp hợp với AND của tế bào nhận. Do đó làm biến đổi
tính chất di truyền của tế bào nhận.
3.1.2. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật.
Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme cần chọn giống thuần chủng, đã
được kiểm tra đầy đủ về các đặc tính hóa sinh, vi sinh, nuôi cấy và cần đặc biệt lưu ý
đến điều kiện bảo quản giống. Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một thời gian có
thể tạo ra các biến dị ngẫu nhiên không mong muốn do đó định kỳ phải cấy chuyền và
kiểm tra lại các đặc tính ban đầu.
• Phương pháp cấy chuyền.
Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên môi
trường thạch (thạch nghiêng, hộp petri,…) với thành phần môi trường nuôi cấy và điều
kiện nuôi cấy thích hợp cho giống vi sinh vật đó. Sau khi giống đã mọc tốt cần bảo
quản ở nhiệt độ lạnh 3-4
0
C và sau mỗi tuần phải cấy chuyền lại. Khi cấy chuyền chỉ lấy
bào tử hoặc khuẩn lạc mà không nên lấy cả môi trường dinh dưỡng để đảm bảo không
16
chuyền các sản phẩm trao đổi chất vào môi trường mới (có thể gây biến đổi bất lợi
không thể lường hết được). Nếu là xạ khuẩn thì không nên bảo quản giống trên môi
trường thạch mà nên giữ trong đất để khử trùng.

°
C -> -80
°
C).
18
Hình 3.4. Bảo quản lạnh sâu
Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan
mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong
mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm
này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như
glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide). Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu này
được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như -20
°
C, -30
°
C, -40
°
C, -70
°
C, -140
°
C
và -196
°
C. Nói chung mức nhiệt độ cao hơn -30
°
C cho hiệu quả thấp do tế bào chịu
nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải. Phương pháp bảo quản này có hiệu quả
với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và
virut.

Đối với Asp. flavus 74: fructoza→ glucoza→ sacaroza→ ramnoza→ manoza→
galactoza→ arabinora→ lactoza.
Đối với Asp. awamori 200: fructoza→ manit→ sacaroza→ arabinoza→
manoza→ galactoza→ lactoza.
Đối với Asp. oryzae 79: fructoza→ sacaroza→ maltoza→ glucoza→ manit→
arabinoza→ galactoza.
Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme
Protease. Ví dụ: Vi khuẩn Bac. Subtilis có khả năng sinh tổng hợp Protease ở môi
trường tinh bột >8%.
Nhiều xạ khuẩn ưa nhiệt, trong đó Micromonospora vulgaris 42, mọc tốt và sinh
tổng hợp protease cao ở môi trường có tinh bột. Tăng nồng độ tinh bột từ 0,25- 1,5%
sinh khối cũng tăng đồng thời với hiệu xuất tổng hợp enzyme.Nếu tăng nồng độ tinh
bột hơn nữa sẽ không thu được kết quả dương tính. Tỷ số giữa cacbon và nitơ cần phải
là 4: 1. Trên môi trường có maltoza (0,5- 2%) vi sinh vật phát triển bình thường, nhưng
tổng hợp protease ngoại bào bị ức chế. Xạ khuẩn không phát triển được ở trên môi
trường có các nguồn cacbon duy nhất là sacaroza, lactoza hoặc arabinoza. Glucoza,
manoza, fructoza, xyloza có trong môi trường (0,2- 5%) làm ức chế sinh trưởng của xạ
khuẩn và sinh tổng hợp enzyme.
Ngoài ra một số loại hydrocacbon cũng có nguồn cacbon có 125 chủng vi sinh
vật. Chẳng hạn chủng Ps. Seruginosa có thể đồng hoá hydrocacbon và có khả năng
sinh tổng hợp protease có hoạt lực cao trên môi trường n- parafin với 12, 14 và 16
nguyên tử cacbon, dầu nặng hoặc propylenglycol. Chúng không chỉ đồng hoá được cả
hydrocacbon béo mà còn đồng hoá cả hydrocacbon thơm.
3.1.3.2. Nguồn nito.
21
Nguồn nito sử dụng rất phong phú, bao gồm 2 nhóm: vô cơ và hữu cơ.
Đối với một số loài nấm mốc thuộc họ (A. oryzae, A. awamori, A. niger, A.
flavus) trên môi trường có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp protease axit cao. Trên
môi trường kzapek NaNO
3

, KNO
3
,
Ca(NO
3
)
2
làm giảm hoạt lực protease tới 30- 50% , còn amylaza giảm 7- 10 lần. Còn
trong môi trường chỉ có nguồn nitơ hữu cơ hoạt lực protease và amylaza cũng thấp hơn
trong môi trường đối chứng (NH
4
)
2
HPO
4
và nước chiết đậu tương.
Đối với xạ khuẩn ưa nhiệt Actynomyces Vulgaris U2 thì pepton là chất cảm
ứng để sinh tổng hợp enzyme protease là tốt nhất.
Các axit amin có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme bằng vi sinh vật.
Glyxin, alanin, metionin và lơxin có tác dụng làm tăng hoạt lực protease của chủng đột
biến A. oryzae 251- 90 đến 6- 9% và nguyên chủng A. oryzae 132- 63 tới 7- 24%.
Nhiều axit amin có tác dụng ức chế đến sinh tổng hợp enzyme, Valin, axit glutamic,
izolơxin và valin ức chế tổng hợp enzyme ở B. megaterium 60%. Còn đối với B.
subtilis các axit amin ức chế trong quá trình này là glyxin, metionin, axit glutamic,
alanin, lơxin,…
Ngoài ra, các bazơ purin như A (adenin), G (guanin) và các dẫn xuất của
chúng, ARN và các sản phẩm thuỷ phân cũng làm tăng đáng kể sinh tổng hợp
proteinza vi sinh vật.
22
3.1.3.3. Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố (chất) kích thích sinh trưởng

chế phẩm enzyme từ vi sinh vật. Các nguyên liệu để chuẩn bị làm môi trường tự
nhiên bao gồm: cám và bột hạt cốc, nước chiết ngô, dịch ép hoa quả, rau, khô dầu,
23
bã rượu, rĩ đường, sản phẩm phân huỷ nấm, men bia, trấu, lõi ngô. Khi lựa chọn sử
dụng môi trường cần chú ý đến các chất có tác dụng điều hoà sinh tổng hợp
enzyme, đặc biệt các chất cảm ứng.
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy. Nhiệt độ nuôi cấy
thông thường từ 25 - 30
0
C. Trị số pH ban đầu của môi trường (chủ yếu ở môi
trường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo thành enzyme, nhưng
khi đó cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ số đó bởi vi sinh vật.
3.1.5. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật.
• Nuôi cấy bề mặt:
Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát
triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt
hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đâm sâu vào lòng môi trường đã
được tiệt trùng, làm ẩm. Đối với một số mục đích đặc biệt, người ta nuôi vi sinh vật
trực tiếp trên bề mặt hạt gạo (sản xuất tương), hạt đậu tương (đậu tương lên men- misô)
đã được nấu chín trộn hạt cốc còn sống (làm men thuốc bắc, men dân tộc, làm tương).
Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… có chất phụ gia là trấu.
Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, mông, tạo được độ xốp nhiều, không có những chất
gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỉ lệ các chất phụ gia phải bảo đảm
sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp hơn 20%, có thể
bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ ((NH
4
)
2
SO
4

Phương pháp nuôi cấy bề sâu đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các khâu vệ
sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy, không khí cung
cấp cho quá trình nuôi cấy.
Các giai đoạn của quá trình nuôi cấy chìm 1 bước gồm: chuẩn bị môi trường
nuôi cấy, nuôi cấy nấm men giống, nuôi cấy nấm mốc sản xuất.
 Ưu nhược điểm
Phương pháp nuôi cấy hiện đại dễ cơ khí hoá, tự động hoá, năng suất cao, dễ tổ
chức sản xuất.
Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến có khả năng sinh tổng
hợp enzyme cao và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điều kiện nuôi cấy,
enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bao điều kiện vệ sinh, vô trùng.
Tuy nhiên do thu được canh trường và nồng độ enzyme thấp nên khi tách thu
hồi enzyme sẽ có giá thành cao. Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô
trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, toàn bộ gây tổn thương lớn.
25