Thành viên nhóm 7:
STT Họ và tên MSV Lớp
1 Nguyễn Thị Duyên 570960 K57CNSHC
2 Nguyễn Thị Anh Đào 560785 K56CNSHA
3 Phạm Thị Huệ 560808 K56CNSHA
4 Lê Ngọc Mai 560827 K56CNSHA
5 Phùng Tiến Quang 560853 K56CNSHA
6 Phạm Thị Thảo 560866 K56CNSHA
7 Đào Trần Trung 550413 K55CNSHA
8 An Thị Yến 560895 K56CNSHA
A. ĐẶT VẤN ĐỀ:
Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trong những công nghệ
quan trọng của Công nghệ Sinh học, nó là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng các
công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Nhờ đó mà người ta có
thể tạo ra được những giống cây trồng có năng suất cao, chống chịu với sâu bệnh,
mở ra khả năng lai khác loài và làm tăng nhanh tính đa dạng di truyền Hiện nay,
người ta đã bắt đầu ứng dụng khả năng nuôi cấy tế bào thực vật tách rời ở qui mô
công nghiệp để thu nhận các sản phẩm, các hoạt chất sinh học có giá trị kinh tế
cao.
Kỹ thuật nuôi cấy mô ra đời đã mở ra một cuộc cách mạng trong nhân
giống thực vật. Nhưng với phương pháp truyền thống nuôi cấy trên môi trường
thạch thì khó đáp ứng được nhu cầu giống cung cấp trên thị trường, giá thành lại
cao, do việc phải cấy chuyển, tách mẫu bên trong tủ cấy hầu như đều thực hiện
bằng tay, tốn nhiều lao động lại dễ bị nhiễm.
Chính vì vậy cần phải có một hệ thống nuôi cấy mới có thể tự động hóa.
Năm 1981, Taykayama và Misawa đã đề xuất một hệ thống nuôi cấy lỏng có thể
sục khí chủ động từ ngoài vào. Trong đó có ba loại là nuôi cấy lỏng tĩnh, nuôi cấy
lỏng lắc và nuôi cấy Bioreacter, tất cả đều được dùng để nuôi cấy huyền phù tế
bào. Nuôi cấy Bioreacter là một phương pháp đầy hứa hẹn cho nhân giống với só
lượng lớn tế bào, phôi soma hay các đơn vị phát sinh cơ quan (củ, chồi ), và sản
xuất các hoạt chất trao đổi thứ cấp bằng sử dụng tế bào thực vật.

VD: trong nhiều trường hợp, tăng tỷ lệ auxin/cytokinin sẽ sản sinh nhiều
khối tế bào xốp.
- Chu kỳ sinh trưởng của tế bào huyền phù: có dạng đường cong
chữ S với các pha sinh trưởng sau:
+Pha tiềm sinh (Lag-phase): ở pha này không xảy ra sự tăng về khối lượng
và số lượng tế bào (A).
+Pha số mũ (Exponential phase): ở pha này sự phân chia và sự tăng khối
lượng tế bào diễn ra với tốc độ lớn nhất. Ngoài ra sự sinh trưởng tế bào cũng tăng
nhanh (B).
+Pha tuyến tính (Linear log-phase): được đặc trưng bởi sự sinh trưởng của
tế bào diễn ra ổn định liên tục (C).
+Pha ổn định: ở pha này hoạt tính phân bào giảm mạnh, số lượng và khối
lượng tế bào ổn định (Stationary phase-D).
+Pha suy thoái (Dead phase): sự sinh trưởng của tế bào ra khỏi đỉnh cao,
giảm xuống và dần đến ngừng sinh trưởng nếu không được cấy chuyển (E).
- Để duy trì quá trình nuôi cấy, các tế bào cần được cấy truyền vào
giai đoạn đầu của pha ổn định và ở thời điểm khi sự kết tập của tế bào là lớn nhất.
Sự kết tập của tế bào là lớn nhất trong khoảng 18-25 ngày, với huyền phù sinh
trưởng mạnh có thể ngắn hơn, từ 6-9 ngày. Ở lần cấy truyền đầu tiên, dịch nuôi cần
được lọc nhằm loại bỏ cụm tế bào lớn. Lượng tế bào đem cấy truyền phải đủ lớn để
đảm báo mật độ tế bào, vì khi thấp quá các tế bào sẽ không sinh trưởng được.
VD: đối với tế bào cây sung dâu (Acerpseudoplatanus) mật độ thích hợp
9-15.10
3
tb/ml.
- Theo King (1980), những tế bào trải qua quá trình nuôi cấy,sinh
trưởng và trao đổi chất trong dịch huyền phù gọi là dòng tế bào, có đặc điểm sau:
+ Khả năng tách tế bào cao.
+Hình thái tế bào đồng nhất.
+ Nhân rõ ràng và tế bào chất đậm đặc.

Cân để xác định khối lượng.
- Khối lượng khô:
Lấy một thể tích mẫu xác định.
Loại bỏ phần nổi, rửa phần tế bào trên giấy lọc Whatman.
Sấy khô trong 12h ở 800C đến khối lượng không đổi.
- Xác định chỉ số nguyên phân (chỉ số phân bào):
Huyền phù tế bào được cố định trong hỗn hợp Aceto-orcein : Acid Acetic
(3:1) sau đó chuyển sang lam kính. Nhỏ 1 giọt Aceto-orcein lên mẫu, hơ trên ngọn
lửa đèn cồn, để nguội trong 5 phút. Đậy mẫu bằng Lamel, làm khô mẫu, quan sát
dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 100. Xác định các kỳ trong khoảng 1000 tế
bào. Tỷ lệ % các tế bào đang phân bào gọi là chỉ số nguyên phân.
Tổng số tế bào phân bào x 100
Chỉ số phân bào(%) =
Tổng số tế bào kiểm tra
- Khả năng sống của tế bào: nhuộm bằng flurescein diacetate (0,01%) và
quan sát màu xanh dưới sự chiếu sáng tử ngoại (ultraviolet).
II.
Kĩ thuật sử dụng trong nuôi cấy huyền phù tế bào
1.
Nuôi cấy dịch thể động :
1.1. Nuôi cấy chìm liên tục :
- Các tế bào được tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng do chúng
được ngâm hẳn vào dung dịch môi trường. Khí đưa vào phải đảm bảo vô trùng.
Quá trình thông khí còn ngăn chặn và làm giảm sự kết dính của các tế bào với
nhau.
- Theo Thomas và Davey (1975), nuôi cấy huyền phù tế bào có
dung tích 25ml, tốc độ phù hợp nhất của máy lắc là 100 – 120 vòng/phút.
- Thể tích của môi trường lỏng cũng phải phù hợp với kích thước
bình nuôi cấy, thường chiếm 20% thể tích bình. Các nuôi cấy quy mô nhỏ và trong
những thời gian ngắn, có thể sử dụng máy khuấy từ ở tốc độ 250 vòng/phút và thời

nhân sinh khối rễ do khả năng chịu được sự ngập chìm trong môi trường.
+Thực tế hiện nay người ta đang sử dụng hệ thống này vào sản xuất giống
hay sinh khối như nuôi củ hoa Lily, hoa thu Hải đường hay nhân sâm của phân
viện sinh học Đà Lạt.
- Khuyết điểm:
+ Sự cung cấp Oxy không được đồng đều trong toàn bộ môi trường.
+ Hiện tượng thủy tinh thể do ngập chìm hoàn toàn và liên tục.
+ Khó áp dụng một cách đồng loạt cho nhiều giống khác nhau.
+ Nuôi cấy trong môi trường lỏng dễ bị nhiễm vi sinh vật như nấm, vi
khuẩn, côn trùng
II.3.
Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (TIS):
II.3.1.
Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản hệ thống:
Tất cả các hệ thống này đều tuân theo những điều kiện được đề ra bởi
Teisson và cộng sự năm 1999:
- Tránh sự ngập liên tục là yếu tố ảnh hưởng tiêu cực lên sự sinh
trưởng và phát sinh hình thái của mẫu cấy.
- Cung cấp sự trao đổi oxy một cách đầy đủ.
- Cung cấp sự hòa trộn đầy đủ.
- Có thể thay đổi môi trường và điều khiển tự động.
- Hạn chế sự nhiễm.
- Giá thành hạ.
Tất cả các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đều phải tuân theo một
nguyên tắc là phải có khả năng tạo ra sự ngập chìm không liên tục theo chu kỳ
xác định. Các hệ thống đều có ngăn chứa môi trường riêng, có thể chung một
bình chứa nhưng có hai ngăn khác nhau hay gồm một hệ thống bình chứa nối với
hệ thống chứa mẫu cấy bằng hệ thống ống dẫn và bơm điều khiển. Các mẫu cấy
thường được đặt trên những đĩa bằng nhựa polypropylene thành một cụm, điều này
giúp tiết kiệm được thời gian phải đặt mẫu lên trên giá thể thạch trong nuôi cấy

II.3.3.
Khuyết điểm:
+ Chưa khảo sát được mật độ nuôi cấy.
+ Giá thành của thiết bị rất đắt, chưa được tự chế tạo trong nước.
+ Các thông số kĩ thuật của hệ thống này cần được khảo sát kỹ lưỡng và tối
ưu hóa đối với từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây.
II.3.4.
Ảnh hưởng của hệ thống ngập chìm tạm thời lên chất lượng nuôi cấy:
Khi nuôi cấy chồi trong hệ thống TIS thì lá nhỏ hơn lá trong môi trường
nuôi cấy lỏng. Những cụm chồi phát triển từ các chồi bên trong Bioreacter thường
có hình cầu và chồi có xu hướng phát triển tỏa tròn xung quanh tâm. Do đó một
số chồi con có kích thước không lớn. Chồi cây có thân dài hơn và ra nhiều lá hơn
so với nuôi cấy trên môi trường thạch. Những ảnh hưởng có lợi từ hệ thống ngập
chìm tạm thời lên sự phát triển chồi có thể là kết quả của việc sử dụng những bình
chứa dung tích lớn.
III.
Ứng dụng của nuôi cấy huyền phù tế bào trong nhân giống vô tính
- Quy trình nuôi cấy:
Quy trình nuôi cấy huyền phù tế bào thường qua hai bước cơ bản là nuôi
cấy callus và nuôi cấy dịch huyền phù:
- Nuôi cấy callus: Callus là dòng tế bào ban đầu, tương tự mô sẹo
tạo ra để hàn gắn vị trí tổn thương của cây. Khi đã có callus, tiến hành cấy chuyển
nhiều lần trong môi trường thạch mềm vì nuôi cấy huyền phù tế bào cần một lượng
mô sẹo khá lớn.
- Nuôi cấy dịch huyền phù: Callus được cấy
chuyển sang môi trường lỏng chuyển động bằng cách lắc hoặc khuấy. Đây là giai
đoạn rất quan trọng, nghiên cứu khảo sát được môi trường và điều kiện nuôi cấy
thích hợp cho tế bào phát triển tốt nhất và có hàm lượng hoạt chất cao nhất có tính
chất quyết định thành công của quá trình nuôi cấy tế bào. Trong quá trình nuôi cấy,
các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những chuyển động xoáy của môi

chất lượng tốt hơn và dài hơn so với chồi trên môi trường rắn.
Sau khi thu hoạch, cây con được chuyển ra nuôi ở môi trường tự nhiên bình
thường như trên môi trường thạch.
IV.
Ứng dụng của nuôi cấy huyền phù tế bào trong sản suất sinh khối tế bào
thực vật và các hợp chất có giá trị cao
1.
Nhân sinh khối callus:
Trong những năm gần đây, việc nuôi cấy nhân sinh khối callus đang được
chú ý nhiều để sản xuất các hoạt thứ cấp.
Khi nuôi cấy callus trên hệ thống Bioreactor để thu nhận các sản phẩm
thứ cấp thì hiệu suất mang lại rất cao. Hiện nay cũng có một số sản phẩm sản xuất
từ hệ thống này như Alkaloid: morphinan alkaloid.berberine, tropane alkaloid,
cardinolides; các hợp chất kháng ung thư :amptorthecin, homoharringtonine,
podophyllotoxin, vinca alkaloid, taxol, saponin
Và cũng đã có một số thành công trong việc sử dụng Bioreactor nuôi cấy
huyền phù tế bào như cây thông đỏ, cây dừa cạn, cây sam Triều Tiên, cây lan
gấm với thể tích của bình nuôi cấy từ vài chục lít đến vài chục nghìn lít.
Saurbh C. và cộng sự (2001), khi nuôi cấy trong hệ thống Bioreactor 3L,
thì sinh khối và hợp chất podophyllotoxin thu được từ nuôi cấy huyền phù cây
Polophyllum hexandrum là 6,5g/l và 4,26mg/l trong 22 ngày.
2.
Một số hợp chất thứ cấp đã được sản xuất từ nuôi cấy huyền phù tế bào
thực vật:
- Diosgenin:
Có ở cây Củ nâu. Tác dụng chống viêm; chữa sốt, đái buốt, đái vàng, thấp
khớp, đau lưng, đau dây thần kinh. Việc nuôi cấy trong bioreactor đã thu được
năng suất diosgenin cao hơn so với hiệu suất có được từ nguyên liệu tự nhiên,
diosgenin chiếm 7.8 % khối lượng khô, trong khi chỉ chiếm 2 % với nguyên liệu
thực vật thu hái trong tự nhiên.

Ứng dụng trong nuôi cấy thông đỏ đê thu nhận Taxol:
1.
Một số giá trị từ cây thông đỏ:
- Thông đỏ (Taxus) được coi là một nguồn dược
liệu quan trọng sau việc khám phá một hợp chất diterpene amide chống ung thư
mới với tên thương mại là “Taxol” từ vỏ rễ, hạt phấn, hạt, lá, thân non, thân gỗ của
cây thông đỏ Thái Bình Dương (Taxus brevifolia). Nó còn là nguồn dược liệu rất
quý trong y học, từ lâu trong dân gian đã dùng lá của loài cây này để trị hen suyễn,
viêm phế quản, nấc, tiêu hoá… cành và vỏ dùng trị bệnh thực tích giun đũa, nước
sắc của thân non dùng trị đau đầu…đặc biệt vào năm 1994 một số nhà khoa học
trên thế giới công bố: “từ cây thông đỏ có thể tìm thấy các hoạt chất để chữa trị
bệnh ung thư cụ thể là Taxol chiết suất từ vỏ các loài: T. brevifolia, T. cuspidata,
T.yunnanensis, T. baccata và T. wallichiana,… đều có chất lượng và hiệu suất cao
được dùng để chữa trị ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư đầu, cổ và có triển
vọng xử lý hắc tố (melenomas)
- Taxol đã được Cục quản lý thực phẩm & dược phẩm Hoa Kỳ
(FDA) chứng nhận khả năng chữa ung thư buồng trứng và ung thư vú, chống
các khối u ác tính, ung thư phổi và một số dạng khối u rắn khác. Nuôi cấy mô
Taxus spp. được coi như một cách tiếp cận rất khả quan trong việc cung cấp nguồn
nguyên liệu quý này vì nó có thể tạo ra một lượng lớn cây trong thời gian ngắn ở
điều kiện có thể kiểm soát được.
2. Quy trình nuôi cấy
- Mẫu nuôi cấy: có thể lấy phần ngọn, lá,…mẫu dùng để nuôi cấy phải có
những tính chất sau:
+Mẫu tế bào phải được lấy từ cây biết chắc chắn có khả năng sinh tổng hợp
chất cần thiết và có khả năng được tổng hợp hay chuyển hoá cao nhất.
+Mẫu phải sạch bệnh và đang trong giai đoạn phát triển mạnh nhất.
- Khi mẫu cấy tạo thành mô sẹo, cấy mô sẹo này vào trong môi trường
lỏng dùng để nuôi cấy tế bào đơn, môi trường nuôi cấy ở đây là:
+ Khoáng MS (Murashige-Skoog)

dụng các kỹ thuật chiết tách để thu nhận các hợp chất cần thiết. Nuôi cấy huyền
phù tế bào đang mở ra nhiều định hướng phát triển cho tương lai.
Tuy nhiên, do cơ sở vật chất cơ bản cho một phòng thí nghiệm nuôi cấy
huyền phù tế bào còn cao nên ở Việt Nam, hướng nuôi cấy huyền phù tế bào chỉ
dừng lại ở mức nghiên cứu.
Trong những năm gần đây, Việt Nam đã thành công trong những quy trình
áp dụng các phương pháp của nuôi cấy huyền phù tế bào để sản xuất ra các chế
phẩm sinh học, y học
Tài liệu tham khảo:
/>hoc-thuc-vat-22650/
/>ginseng-ca-meyer-168630