BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ QUỐC PHÒNG ĐỀ TÀI ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH NUÔI CẤY, BIỆT HÓA
TẾ BÀO GỐC SINH TINH ĐỂ ĐIỀU TRỊ VÔ SINH
NAM GIỚI

MÃ SỐ: ĐTĐL2009T/27
Cơ quan chủ trì đề tài: Học viện Quân y - Bộ Quốc phòng
Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Nguyễn Đình Tảo

8999

HÀ NỘI - 2011


Địa chỉ : Trung tâm Công nghệ phôi – Học viện Quân y
Điện thoại
: NR: 04.33541653 Di động: 0902150873
E-mail:
II. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN
1. Thời gian thực hiện nhiệm vụ:
- Theo Hợp đồng đã ký kết: 36 tháng từ tháng 1/2009 đến tháng 12 /2011
- Thực tế thực hiện từ: 1/2009 đến tháng 12 /2011
2. Kinh phí và sử dụng kinh phí:
a. Tổng kinh phí thực hiện: 4.417,273 triệu đồng
- Kinh phí hỗ trợ từ SNKH: 4.170 triệu đồng
- Kinh phí từ nguồn tự có của tổ chức: 112 triệu đồng
- Kinh phí từ nguồn khác: 135,273 triệu đồng
b. Tình hình cấp và sử d
ụng kinh phí từ nguồn NSKH
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
Thời gian
(Tháng,
năm)
Kinh phí
(Triệu đồng)
Thời gian
(Tháng, năm
Kinh phí
(Triệu đồng)
Ghi chú
(Số đề nghị
quyết toán)
2009-2011 4417,273 2009-2011 4417,273 4417,273


4
3. Các văn bản chính trong quá trình thực hiện đề tài:
Số
TT
Số, thời gian ban hành văn bản Tên văn bản
1 QĐ số 1412/QĐ-BKH CN ngày
09 tháng 7 năm 2008
Quyết định về việc phê duyệt tổ chức
và cá nhân chủ trì đề tài, dự án sản xuất
thử nghiệm đốc lập cấp nhà nước thực
hiện trong kế hoạch năm 2009
2 Hợp đồng số 12/2009/HĐ-ĐT ĐL
ngày 17/2/2009
Hợp đồng nghiên cứu khoa học và phát
triển công nghệ.

4. Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài:
Số TT Tên tổ chức đăng
ký theo thuyết
minh
Tên tổ chức đã
tham gia thực
hiện
Nội dụng

- Đề cương
nghiên cứu
được thông
qua
- Đạt và
được
nghiệm thu 5
Tràng Thi - Hà
Nội - Việt Nam
Thi - Hà Nội -
Việt Nam
2 GS.TS. Stefan
Schlatt, Đại học
Munster, CHLB
Đức.
- Đào tạo cán
bộ
- Đánh giá
một số chỉ
tiêu tế bào
gốc sinh tinh
Đào tạo 01
cán bộ.
Nắm được
kỹ thuật
chuyên môn
về nuôi cấy

Số
TT
Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí,
địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số
đoàn, số lượng người tham gia)
Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn,
số lượng người tham gia)
A Đoàn ra
1 Năm 2009
Nội dung: Nghiên cứu phân lập
và nuôi cấy các TB gốc sinh tinh
Năm 2009
Nội dung: Nghiên cứu phân lập và
nuôi cấy các tế bào gốc sinh tinh

7
Thời gian: 02 tháng
Kinh phí: theo thuyết minh
Tên tổ chức tiếp nhận:
Đại học Seoul, Hàn Quốc
Tên cán bộ Việt Nam:
ThS. Dương Đình Hiếu
Thời gian: 02 tháng
Kinh phí: theo thuyết minh
Tên tổ chức tiếp nhận:
Đại học Seoul, Hàn Quốc
Tên cán bộ Việt Nam:

Năm 2010
Nội dung: Bảo quản mô tinh hoàn
và các tế bào gốc sinh tinh.
Thời gian: 8 ngày

8
Kinh phí: theo thuyết minh
Tên tổ chức tiếp nhận: GS.TS.
Stefan Schlatt, Đại học Munster,
CHLB Đức.
Tên cán bộ Việt Nam:
PGS.TS. Vũ Huy Nùng,
PGS.TS. Nguyễn Đình Tảo,
TS. Nguyễn Viết Trung.
Kinh phí: theo thuyết minh
Tên tổ chức tiếp nhận:
GS.TS. Stefan Schlatt, Đại học
Munster, CHLB Đức.
Tên cán bộ Việt Nam:
PGS.TS. Vũ Huy Nùng,
PGS.TS. Nguyễn Đình Tảo,
TS. Nguyễn Viết Trung.
B Đoàn vào
Năm 2011
Nội dung: Chuyển giao kỹ thuật
phân lập, nuôi cấy, bảo quản mô tinh
hoàn và các tế bào gốc sinh tinh.
Thời gian: 8 ngày
Kinh phí: Nguồn khác
Tên cán bộ nước ngoài:

8. Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:
(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra
khảo sát trong nước và ngoài nước)

Thời gian
Số
TT
Các nội dung, công việc
chủ yếu cần được thực hiện
(Các mốc đánh giá chủ yếu)
Theo kế
hoạch
Thực tế
đạt được
Cá nhân,
tổ chức
thực hiện
1 Xây dựng đề cương nghiên
cứu chi tiết
8/2008 -
10/2008
8/2008 -
10/2008
PGS.TS. Nguyễn
Đình Tảo,
PGS.TS Quản

10
Hoàng Lâm và
nhóm nghiên cứu

ThS.Dương Đình
Hiếu, ThS. Đoàn
Thị Hằng
- Tiến hành thăm khám tinh
hoàn, mào tinh, ống dẫn tinh
và làm các kỹ thuật MESA
hoặc PESA để xác định bệnh
nhân không có tinh trùng do
tắc hay không do tắc
1/2009-
12/2010
1/2009-
12/2010
PGS.TS. Nguyễn
Đình Tảo,
PGS.TS. Nguyễn
Viết Tiến, TS
Nguyễn Viết
Trung, TS. Trịnh

11

Thế Sơn, ThS.
Trịnh Quốc
Thành,
ThS.Dương Đình
Hiếu
- Sinh thiết tinh hoàn và làm
tiêu bản cấu trúc và siêu cấu
trúc các mẫu mô tinh hoàn để

trình phân lập tế bào gốc sinh
tinh từ mào tinh hoàn và ống
sinh tinh
1/2009-
6/2011
1/2009-
6/2011
PGS.TS. Nguyễn
Đình Tảo,
PGS.TS. Quản
Hoàng Lâm, TS.
Nguyễn Thanh Tùng

12
4 Nội dung 3

- Nghiên cứu xây dựng qui
trình nuôi cấy, biệt hoá tế bào
gốc sinh tinh
1/2009-
6/2011
1/2009-
6/2011
PGS.TS. Nguyễn
Đình Tảo,
PGS.TS. Nguyễn
Viết Tiến,
PGS.TS. Quản
Hoàng Lâm, TS.
Trịnh Thế Sơn

Viêt báo cáo 8/2011-
11/2011
8/2011-
11/2011
PGS.TS. Nguyễn
Đình Tảo,

13
PGS.TS. Quản
Hoàng Lâm
8
Báo cáo nghiệm thu đề tài 12/2011 12/2011 PGS.TS. Nguyễn
Đình Tảo,
PGS.TS. Quản
Hoàng Lâm

III. SẢN PHẨN KH CN CỦA ĐỀ TÀI
1. Sản phẩm KH CN đã tạo ra
a. Sản phẩm dạng I:
Số
TT
Tên sản phẩm và chỉ tiêu
chất lượng chủ yếu
Đơn vị đo Số lượng Theo kế
hoạch
Thực tế
đạt được
1 Tinh trùng được nuôi cấy,
biệt hoá từ tế bào gốc có
nguồn gốc từ ống sinh tinh.

01
Đủ về số
lượng

2 Qui trình: Thu gom, phân
lập tế bào dòng tinh từ mào
tinh.

01

01
Đủ về số
lượng
3 Qui trình: Nuôi cấy, biệt
hóa tế bào gốc sinh tinh từ
ống sinh tinh.01

01
Đủ về số
lượng

4

Qui trình:
Nuôi cấy, biệt
hóa tế bào dòng tinh từ mào
tinh.
15
c. Sản phẩm dạng III
Yêu cầu khoa học cần đạt
Số
TT
Tên sản phẩm
Theo kế
hoạch
Thực tế đạt
được
Số lượng, nơi
công bố
(Tạp chí, nhà
xuất bản)
* Bài báo trong nước 02 9
1 Kết quả điều trị vô
sinh nam do không
có tinh trùng trong
dịch tại Trung tâm
Công Nghệ Phôi-
HVQY
Tạp chí Y
Dược học
Quân sự,
2010, 35(3),
tr. 183-186.
2 Nghiên cứu siêu cấu
trúc tế bào Sertoli

Quân y

N7/2011
tr 40-42.
5 Đánh giá mất đoạn
nhỏ NST Y ở 269
Bệnh nhân vô sinh
nam do không có
tinh trùng bằng kỹ
thuật Multiplex
PCR

Tạp chí Y
Dược học
Quân sự,
9(5)-2011.
tr 125-130.
6 Phát hiện vi đứt
đoạn NST Y ở bệnh
nhân vô sinh nam
do không có tinh
trùng bằng kỹ thuật
Multiplex PCR

Tạp chí Y
Dược học QS
số 8(6)-2011.
tr 110-115.
7 Nghiên cứu hình
thái tế bào gốc sinh

TT
Tên sản phẩm đăng ký
Theo kế
hoạch
Thực tế
đạt được
Ghi chú
(Thời gian
kết thúc)

1
Phương pháp phân lập tế
bào gốc sinh tinh từ ống
sinh tinh của tinh hoàn

0

01

Đã có QĐ
chấp nhận
đơn hợp lệ
của Cục Sở
hữu trí tuệ

hóa chất.
19
3. Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài:
Số
TT
Nội dung Thời gian
thực hiện
Ghi chú
(Tóm tắt kết quả, kết luận
chính, người chủ trì)
I Báo cáo định kỳ
Lần 1 15/9/2009 Đã thực hiện đủ nội dung
đặt ra theo tiến độ và hợp
đồng.
Lần 2 15/03/2010

Đã thực hiện đủ nội dung
đặt ra theo tiến độ và hợp
đồng.
Lần 3 15/9/2010 Đã thực hiện đủ nội dung
đặt ra theo tiến độ và hợp
đồng.
Lần 4 15/03/2011

Đã thực hiện đủ nội dung
đặt ra theo tiến độ và hợp
đồng.

IV Nghiệm thu cơ sở 30/11/2011 Đạt yêu cầu 7/7 = 100%

Chủ nhiệm đề tài Thủ trưởng tổ chức chủ trì
(Họ tên, chữ ký) (Họ tên, chữ ký và đóng dấu)
PGS. TS. Nguyễn Đình Tảo 21
MỤC LỤC

Nội dung Trang
CHƯƠNG I. MỞ ĐẦU 28

CHƯƠNG II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 31
2.1. Tổng quan về phân lập tế bào dòng tinh 31
2.2. Tổng quan về tế bào nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc sinh tinh 41
2.3. Về tiêu chuẩn đánh giá tế bào gốc sinh tinh trong quá trình nuôi cấy. 57
2.4. Về bảo quản tế bào dòng tinh 73
CHƯƠNG III. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 85
3.1. Đối tượng nghiên cứu: 85
3.2. Phương pháp nghiên cứu 86
3.3. Trang bị, hóa chất 102
CHƯƠ
NG IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 105

Y 157
5.2. Về quá trình phân lập tế bào gốc sinh tinh 163
5.3. Nuôi cấy các tế bào dòng tinh thu được từ mào tinh 164
5.4. Nuôi cấy các tế bào gốc sinh tinh 165
5.5. Vai trò của tế bào Sertoli trong nuôi cấy 166
5.6. Phương pháp nuôi cấy 166

5.7. Ý nghĩa của phương pháp nuôi cấy 167
5.8. Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu bảo quản tế bào gốc sinh tinh 168
5.9. Thể tích tinh hoàn và tế bào gốc sinh tinh lập 168
5.10. Trữ lạnh các tế bào dòng tinh thu nhận từ mào tinh 169
5.11. Trữ lạnh tế bào gốc sinh tinh trong mô tinh hoàn của bệnh nhân 176
KẾT LUẬN 182
KIẾN NGHỊ 184
TÀI LIỆU THAM KHẢO 185

PHỤ LỤC 201
- Danh sách bệnh nhân PESA, MESA
- Danh sách bệnh nhân trữ lạnh tinh trùng từ mào tinh và mô tinh hoàn
23
DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT

ART Assisted Reproductive Technology (Kỹ thuật hỗ trợ sinh sản)
AID Artificial insemination by donor (Thụ tinh nhân tạo bằng tinh
trùng của người cho)
CPA Cryoprotective agents: Các chất bảo vệ tế trong quá trình đông lạnh
AZF Azoospermic factor

Bảng 4.3. Kết quả thu gom, phân lập các tế bào dòng tinh 106
Bảng 4.4. Tuổi và thời gian vô sinh của bệnh nhân nghiên cứu 111
Bảng 4.5. Tỷ lệ di động của tinh trùng và tinh tử tại mào tinh qua các thời điểm
nuôi cấy trong môi trường không bổ sung các hormone 113

Bảng 4.6. Tỷ lệ di động của tinh trùng và tinh tử tại mào tinh qua các thời điểm
nuôi cấy trong môi trường có bổ sung các hormone 114

Bảng 4.7. So sánh kết quả nuôi cấy các tế bào ở mào tinh trong môi trường nuôi
cấy có bổ sung và không bổ sung các hormone 114

Bảng 4.8. Biến đổi số lượng các tế bào dòng tinh chuột trong môi trường nuôi
cấy 116

Bảng 4.9. Biến đổi số lượng các tế bào dòng tinh người trong môi trường nuôi
cấy 118

Bảng 4.10. Khả năng thụ tinh của tinh tử chuột sau nuôi cấy 126
Bảng 4.11. Sự phát triển phôi chuột ngày 2 với tinh tử sau nuôi cấy 126
Bảng 4.12. Sự phát triển phôi chuột ngày 3 với tinh tử sau nuôi cấy 127
Bảng 4.13. Khả năng thụ tinh của tinh tử sau nuôi cấy 127
Bảng 4.14. Sự phát triển phôi ngày 2 với tinh tử sau nuôi cấy 128
Bảng 4.15. Sự phát triển phôi ngày 3 với tinh tử sau nuôi cấy 129
Bảng 4.16. Tuổi, thời gian vô sinh của bệnh nhân 130
Bảng 4.17. Đặc điểm thể tích tinh hoàn của bệnh nhân nghiên cứu 130
Bảng 4.18. Kết quả độ di động của tinh trùng thu nhận từ mào tinh trước, sau trữ
lạnh và nuôi cấy. 131

Bảng 4.19. Tỉ lệ sống của tinh trùng trước trữ lạnh và sau rã đông 131