BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Đỗ Minh Trung

NGHIÊN CỨU BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC
TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN NGƯỜI
THÀNH TẾ BÀO DẠNG TẠO XƯƠNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
HÀ NỘI – 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
Luận án này là sản phẩm khoa học thuộc đề tài “Nghiên cứu biệt hóa tế bào
gốc màng dây rốn thành tế bào xương” mã số: 106.99.174.09 do Học viện Quân y
chủ trì. Luận án cũng sử dụng một phần kết quả của đề tài “Nghiên cứu xây dựng
ngân hàng tế bào gốc dây rốn khu vực Miền Nam và ứng dụng vào điều trị bệnh ở
người” mã số ĐTĐL 2007-03 do Công ty cổ
phần hóa dược phẩm Mekophar chủ trì
và Học viện Quân y là đơn vị phối hợp thực hiện.
Là người tham gia trực tiếp thực hiện các nội dung thuộc đề tài được trình
bày trong luận án này, tôi xin cam đoan những số liệu và kết quả nghiên cứu trong
luận án là trung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố trong các luận
văn, luận án nào và đã được chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào luận án này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Nghiên cứu sinh


đã động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình công tác và thực hiện
nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, khích lệ và
tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng năm 2013
Nghiên cứu sinh
Đỗ Minh Trung MỤC LỤC

Trang
DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT i
DANH MỤC BẢNG iii
DANH MỤC HÌNH iv
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI 4
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 5
1.1. Tế bào gốc và công nghệ tế bào gốc 5
1.1.1. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc nước ngoài 5
1.1.2. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc trong nước 6

2.2.3.3. Khả năng tích tụ canxi của tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô 38
2.2.3.4. Xác định hoạt tính của Alkaline phosphates (ALP) 38
2.2.4. Tách chiết RNA và tiến hành phản ứng RT-PCR (Reverse Trancriptase -
Polymerase Chain Reaction) 39
2.2.5. Phương pháp xác định số lượng tế bào nuôi cấy 43
2.2.6. Thu hoạch và bảo quản tế bào 44
2.2.7. Phục hồi tế bào sau bảo quản lạnh sâu 44
2.2.8. Cấy ghép tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn lên
chuột nhắt đã gây suy giảm miễn dịch bằng hóa chất 45
2.2.8.1. Tạo mô hình chuột nhắt suy giảm miễn dịch 45
2.2.8.2. Cấy ghép tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn trên
chuột 45
2.3.9. Nhuộm hematoxylin và eosin 46
2.2.10. Phương pháp xử lý số liệu 46
2.2.11. Đạo đức trong nghiên cứu 46
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

3.1. Phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn người 47
3.1.1. Thu thập mẫu dây rốn 47
3.1.2. Khảo sát thời gian nuôi cấy mô tách màng dây rốn và khả năng bám dính 47
3.1.2.1. Thời gian nuôi cấy mô 47
3.1.2.2. Kết quả nuôi cấy màng dây rốn phân lập tế bào 49
3.1.3. Khảo sát môi trường cơ bản phân lập và nuôi cấy tế bào gốc 52
3.1.4. Thời gian nuôi cấy mô phân lập tế bào gốc trung mô 54
3.1.5. Khảo sát số lần cấy chuyển mô 60
3.1.6. Khảo sát thời gian c
ấy chuyển, nuôi cấy tăng sinh tế bào 62
3.2. Kiểm định sản phẩm tế bào gốc 64
3.2.1. Định danh tế bào bằng dấu ấn bề mặt 64
3.2.2. Kiểm tra tính gốc của tế bào gốc trung mô màng dây rốn 67

BSA Bovine Serum Albumin
BU Busulfan
CD
Cluster of Differentiation
cDNA Complementary deoxyribonucleic acid
COL I Colagene type I
CY Cyclophosphamide
DMEM Dulbecco
’
s Modified Eagle Medium
DMEM-LG Dulbecco
’
s Modified Eagle Medium Low Glucose
DMSO Dimethyl Sulfoxide
D-PBS Dulbecco's Phosphate buffer saline
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
F12 Nutrient Mixture F12
FBS Fetal brovine serum: Huyết thanh bào thai bê
FITC Fluorescein isothiocyanate
HBV Hepatitis B Virus
HCV Hepatitis C Virus
HIV
Human Immunodeficiency Virus
HLA Human leukocyte antigen: Kháng nguyên bạch cầu người
IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthin
ICM Inner Cell Mass: Khối tế bào bên trong
IMDM
Iscove's Modified Dulbecco's Medium
MSC Mesenchymal Stem Cell: Tế bào gốc trung mô
OC Osteocalcin

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 39
Bảng 2.4. Trình tự các cặp mồi sử dụng để nhận biết tế bào tạo xương bằng kỹ thuật RT-PCR 40
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy mô tách màng dây rốn 48
Bảng 3.2: Nuôi cấy mô phân lập tế bào 51
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát môi trường cơ bản để nuôi cấy phân lập tế bào 52
Bảng 3.4: Lượng canxi tích lũy trong tế bào cảm ứng biệt hóa bằng các chất cảm ứng khác
nhau ở những nồng độ khác nhau 72
Bảng 3.5: Kết quả OD khả năng tích tụ canxi của tế bào biệt hóa 77
Bảng 3.6: Hoạt tính Alkaline phosphatase 79
Bảng 3.7: Xác định khả năng tích tụ canxi trong 10 mẫu tế bào biệt hóa 82
Bảng 3.8: Hoạt tính Alkaline phosphatase của tế bào xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô
màng dây rốn 83
Bảng 3.8: Kết quả gây suy giảm miễn dịch chuột bằng Busulfan 20mg/kg và
Cyclophosphamide 50mg/kg 90


Hình 3.10: Kết quả phân tích biểu hiện một số marker bề mặt của tế bào thu nhận được sau
khi cấy chuyền 3 lần 65
Hình 3.11: Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tế bào mỡ 68
Hình 3.12: Hình ảnh tế bào biệt hóa sau 21 ngày nuôi cấy được nhuộm bằng alizarin red 70 v
Hình 3.13: Giếng nuôi cấy và tế bào được biệt hóa ở các thời gian khác nhau được nhuộm
với alizarin red 76
Hình 3.14: Kết quả xác định canxi theo thời gian biệt hóa tế bào 77
Hình 3.15: Hoạt tính Alkaline phosphatase ở các thời điểm cảm ứng biệt hóa khác nhau 78
Hình 3.16: Hình ảnh tế bào biệt hóa sau 21 ngày nuôi cấy được nhuộm bằng alizarin red 80
Hình 3.17: Xác định khả năng tích tụ canxi trong 10 mẫu tế bào biệt hóa 81
Hình 3.18: Xác định hoạt tính Alkaline phosphatase trong 10 mẫu tế bào biệt hóa từ tế bào
gốc trung mô màng dây rốn 83
Hình 3.19: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RNA của tế bào gốc trung mô 85
Hình 3.20: Xác định dấu ấn ß-Actin, OC, ON của 10 mẫu tế bào tạo xương biệt hóa từ tế
bào gốc trung mô màng dây rốn 87
Hình 3.21: : Xác định dấu ấn ALP, COL của 10 mẫu tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào 88
Hình 3.22: Hình ảnh sau 1 tháng cấy ghép tế bào tạo xương trên chuột suy giảm miễn dịch 90
Hình 3.23: Nốt can xi sau khi làm tiêu bản nhuộm hematoxylin và eosin 91
Hình 3.24: Quy trình biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn thành tế bào tạo xương 92
dịch tễ các bệnh
xương khớp đã được tiến hành: tỷ lệ loãng xương ở phụ nữ trên 50 tuổi tại Hà nội là 23%
và tại thành phố Hồ Chí Minh là 17%. Cùng với sự gia tăng về tuổi thọ, ngoài các bệnh
loãng xương và một số bệnh khác liên quan đến bệnh xương khớp, tổn thương sụn, thoái
hóa khớp và cột sống đang trở thành vấn đề quan trọng. Cùng với sự phát triển không
ngừng của khoa học kỹ thuật, công nghệ tế bào gốc đã mở ra một hướng mới trong điều trị
các bệnh về xương khớp và đã được ứng dụng ở nhiều quốc gia trên thế giới và một số
bệnh viện trong nước. Các kết quả điều trị cho thấy việc điều trị bằng tế bào gốc nói chung
và các tế bào gốc trung mô nói riêng có kết quả tốt trong tái tạo xương, sụn [30, 124, 138].
Ghép TBG từ tuỷ xương tự thân đã được dùng trên lâm sàng để điều trị thành công
các trường hợp gãy xương lâu liền và khớp giả [5,6,7,9,10,16]. Phương pháp điều trị
thường là tiêm trực tiếp các tế bào gốc từ tuỷ xương vào ổ gãy xương. Khi được tiêm vào ổ
gãy xương, các TBG trung mô của tủy xương biệt hoá in vivo thành các tế bào tạo xương
(TBTX) và tái tạo lại ổ gãy xương. Ngoài ra các TBG trung mô từ tuỷ xương có thể được
phân lập và biệt hoá ex vivo thành các tế bào tạo xương trước khi được ghép trở lại ổ
khuyết xương của bệnh nhân [11,13,14,16]. Tuy nhiên, qui trình thu thập TBG từ tủy
xương tương đối phức tạp và số lượng TBG thu được không nhiều, nhất là ở bệnh nhân
gãy xương lâu liền do nguyên nhân bệnh lý của xương và tủy xương.
Dây rốn trẻ sơ sinh là nguồn cung cấp TBG có nhiều ưu điểm cả về phương diện kỹ
thuật cũng như đạo đức. Dây rốn có nhiều loại TBG bao gồm TBG tạo máu, TBG biểu mô,
TBG trung mô, TBG nội mô chứa trong máu dây rốn, trong lớp gel Wharton hay trong lớp 2
màng bao dây rốn. TBG dây rốn được thu thập ngay khi sinh và có thể bảo quản đông lạnh
hay lưu giữ trong ngân hàng như một nguồn TBG dự trữ để sử dụng bất kỳ khi nào cho chủ
nhân sinh học của mẫu tế bào. TBG trung mô từ dây rốn tương tự như các TBG trung mô ở
tủy xương, do đó có thể sử dụng chúng như một nguồn TBG thay thế cho TBG ở tủy
xương [49,50,64].
Để ứng dụng điều trị vết thương xương sớm có kết quả, các TBG cần được biệt hóa

3NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 1. Nghiên cứu áp dụng qui trình phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung
mô từ màng dây rốn trẻ sơ sinh.

2. Nghiên cứu minh chứng kiểm định tế bào phân lập được từ màng dây rốn người
theo qui trình áp dụng là tế bào gốc trung mô.

3. Nghiên cứu các điều kiện thích hợp biệt hóa của tế bào gốc trung mô từ màng
dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương in vitro (môi trường cơ bản, chất
cảm ứng, thời gian ).

4. Nghiên cứu một số biến đổi của tế bào gốc trung mô màng dây rốn trong quá
trình biệt hóa thành tế bào dạng tế bào tạo xương.

5. Thử nghiệm cấy ghép tế bào dạng tạo xương thu được sau biệt hóa từ tế bào gốc
trung mô màng dây rốn người lên chuột nhắt đã gây suy giảm miễn dịch bằng
hóa chất.
TBG ở các mô của người trưởng thành.
Năm 1981, Evans và Kaufman và Martin phân lập được TBG phôi từ phối tế bào
bên trong của phôi túi (blastocyst) chuột nhắt [71].
Năm 1998, James Thomson và cộng sự ở đại học Wisconsin-Madison (Mỹ) đã thu
nhận dòng TBG phôi người [71].
Năm 2001, Tìm ra một số phương pháp định hướng TBG biệt hóa in vitro tạo ra
các mô có thể dùng cho ghép mô.
Năm 2003, Tạo được noãn bào từ TBG phôi chuột. Điều này gợi ý rằng TBG phôi
có thể có tính toàn năng, bằng thực nghiệm có thể làm một tế bào “trẻ lại”.
Năm 2005, các nhà nghiên cứu ở Đại học Kingston (Anh) đã tuyên bố phát hiện
trong máu cuống rốn một liên loại TBG giống TBG phôi, chúng được thu nhận và gọi là
TBG giống TBG phôi phân lập từ máu cuống rốn (CBEs - Cord-blood-derived Embryonic-
like stem cells) [43]. Nhóm nghiên cứu này cũng đã thành công khi thử nghiệm biệt hóa
các TBG nói trên thành các tế bào có chức năng sinh lý trưởng thành.
Tháng 7/2005, Phan Toàn Thắng tại Đại học Quốc gia Singapore đã phân lập được
nguồn tế bào gốc mới từ dây rốn người. Các tế bào gốc này có khả năng ứng dụng cao
trong điều trị.
Tháng 8/2006, Kazutoshi Takahashi và Shinya Yamanaka đã tạo ra các TBG vạn
năng cảm ứng iPS (induced pluripotent stem cells: Tế bào gốc vạn tiềm năng cảm ứng).
Tháng 10/2007, Mario Capecchi, Martin Evans và Oliver Smithies đã nhận giải
thưởng Nobel y sinh học cho các thành tựu nghiên cứu về TBG phôi trên chuột tạo ra các
cá thể con biến đổi di truyền mong muốn.
Tháng 2/2008, nhóm nghiên cứu của nhà khoa học Baetge, của hãng Novocell (San
Diego, Mỹ) đã thành công trong việc biệt hóa tế bào gốc phôi người thành tế bào sản xuất
insulin, các tế bào này đã được thử nghiệm điều trị tiểu đường trên mô hình chuột và đã có
kết tốt. 6
1.1.2. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc trong nước

Ở nước ta, ước tính hàng năm riêng nhu cầu điều trị bệnh máu bằng ghép tế bào
gốc cũng đã khoảng 300 - 500 trường hợp. Nhu cầu điều trị các khuyết hổng mô và suy
chức năng tế bào/cơ quan rất lớn mà triển vọng có thể áp dụng trị liệu tế bào gốc càng là
con số lớn hơn. Tuy nhiên, lĩnh vực này vẫn còn biểu hiện nhiều hạn chế. Đó là nguồn tế 7
bào gốc còn hạn chế (mới chỉ dừng lại từ dây rốn, tủy xương) đặc biệt là các nghiên cứu áp
dụng tế bào gốc biệt hóa thành các dòng tế bào áp dụng điều trị còn chưa đạt hiệu quả cao.
Tại nước ta, vết thương khuyết hổng xương do chấn thương hoặc do các bệnh lý
khác nhau là vấn đề thường gặp trên lâm sàng. Hậu quả thường dẫn đến xương không liền,
khớp giả và các dị tật ảnh hưởng lớn đến vận động của bệnh nhân. Để điều trị các tình
trạng này đã có nhiều biện pháp điều trị khác nhau được tiến hành như ngoại khoa cố định
xương, ghép xương tự thân hoặc ghép xương khác gen đồng loài (xương tươi, xương đông
khô), ghép xương dị loài, ghép bột xương Tuy nhiên các biện pháp này không giải quyết
đượ
c triệt để và nhiều trường hợp vẫn để lại dị tật như chi ngắn chi dài. Gần đây Bệnh viện
Việt Đức Hà Nội và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 đã tiến hành đề tài sử dụng ghép
tuỷ xương tự thân (trong đó có các TBG) vào vết thương xương khó liền để điều trị, trong
đó có các trường hợp khớp giả xương chày [13,14]. Song song với hướng ứng d
ụng lâm
sàng đối với các TBG tự thân, các nghiên cứu biệt hoá TBG từ tuỷ xương, từ máu dây rốn
thành tế bào xương cũng đã được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Tế bào gốc của Trường
Đại học KHTN, ĐH Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh. Các tác giả đã tạo ra được các tế bào tích
tụ can-xi được hiển thị bằng các phương pháp nhuộm và kiểm tra các dấu ấn đặc hiệu.
1.1.3. Tế bào gốc
Tế bào gốc (TBG) là các tế bào chưa có chức năng chuyên biệt, có tiềm năng phát
triển thành nhiều loại tế bào khác nhau (hình 1.1) và có khả năng tự thay mới (Self-
Renewal) [2,11,12,20,21,44,50,59]. Các tế bào này là các tế bào chưa biệt hóa
(Unspecialized Cell) hoặc đang ở những giai đoạn khác nhau nhưng chưa kết thúc quá

của chúng, các nhà khoa học có thể chủ động tạo ra các tế bào giống hệt nhau và ở các giai
đoạn sinh lý, bệnh lý khác nhau rất gần với thực tế lâm sàng, điều này rất có ý nghĩa trong
việc nghiên cứu cơ chế tác dụng cũng như độc tính của các loại thuốc hay các chế phẩm
sinh học.
Có thể nói ứng dụng quan trọng và rộng lớn nhất của công nghệ TBG là trong điều
trị. Trên cơ sở các TBG có thể biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, chúng ta có thể
chủ động nuôi cấy TBG trong ống nghiệm sau đó biệt hóa chúng thành các tế bào như tế
bào cơ, tế bào xương, tế bào thần kinh, tế bào sụn, tế bào tuyến tụy, tế bào cơ tim (hình
1.3) rồi ghép vào cơ thể người bệnh để điều trị một số bệnh như các bệnh lý tim mạch,
điều trị Parkinson, tiểu đường, trong lĩnh vực thẩm mỹ hay thúc đẩy quá trình liền
xương… [31,35].

Hình 1.3: Ứng dụng của công nghệ TBG [31]
10
1.1.4. Phân loại tế bào gốc
Hiện nay có nhiều cách phân loại TBG, tùy theo các tiêu chí khác nhau cũng như sự
tiếp cận công nghệ TBG ở các góc độ khác nhau.
Theo mức độ tiềm năng biệt hóa có: TBG toàn năng (các tế bào của phôi dâu), TBG
vạn tiềm năng (các tế bào tách từ khối tế bào bên trong của phôi nang), TBG đa tiềm năng
(các tế bào tách từ ba lá phôi…), TBG ít tiềm năng (TBG tạo máu…), tế bào đơn tiềm năng
(tế bào tiền thân hồng cầu…) [3,4].
Theo cách thức tạo ra các TBG có các TBG tự nhiên và các TBG nhân tạo (các
TBG tạo ra từ công nghệ chuyển nhân và các TBG tạo ra từ công nghệ gen).
- Tế bào gốc phôi (embryonic stem cell), chính xác là các tế bào gốc từ phôi, được
phân lập từ phôi (bất kỳ phần nào của phôi, không giới hạn chỉ vào các tế bào của khối tế
bào bên trong phôi nang), là các tế bào gốc toàn năng hoặc vạn tiềm năng. Để có được các
tế bào này thường phải hủy phôi. Đã có những thông báo sinh thiết phôi lấy ra một số tế

bào đã biệt hoá của cơ thể trở lại trạng thái giống như tế bào gốc phôi hay còn gọi là tế bào
gốc nhân tạo. Đây là kỹ thu
ật chủ yếu thao tác trong phòng thí nghiệm, người cho tế bào để
cảm ứng (ví dụ tế bào da) bị ảnh hưởng rất ít, có thể là sinh thiết để lấy một miếng da nhỏ.
- Tế bào gốc ung thư (cancer stem cell) được phân lập từ các khối u. Các tế bào gốc
này được coi là nguồn gốc của khối u. Trong chiến lược trị liệu miễn dịch chống ung thư,
tế bào này đang được chú ý để làm vaccine chố
ng ung thư với hy vọng điều trị được “tận
gốc” ung thư. Các tế bào gốc ung thư từ khối u của chính bệnh nhân hoặc khối u cùng loại
của bệnh nhân khác được dùng làm vaccine kích thích hệ thống miễn dịch của bệnh nhân
chống lại các thành phần của khối u.

12
Hình 1.4: Phân loại TBG theo loại mô hay theo nguồn gốc (theo Lee E. H. và Hui J. H. P, 2006) [85]13
Theo nguồn gốc hay theo loại mô có hai nhóm lớn đó là các TBG phôi (Embryonic Stem
Cell) và các TBG trưởng thành (Adult Stem Cell), trong mỗi nhóm lại được chia nhỏ hơn
thành nhiều loại TBG khác [33]. Đây là cách phân loại hay sử dụng và trong khuôn khổ
nghiên cứu.
TBG phôi là các tế bào được tách ra từ khối tế bào bên trong (Inner Cell Mass – ICM)
của nụ phôi. Phôi nang này có thể là các phôi thừa của quá trình thụ tinh trong ống nghiệm (In
Vitro Fertilization) hoặc được tạo ra từ công nghệ chuyển nhân (Nuclear Transfer). Trong
những điều kiện nhất định, các t
ế bào này có thể biệt hóa thành bất kì loại tế bào nào trong cơ
thể, về tiềm năng biệt hóa thì đây chính là các tế bào vạn tiềm năng [31]. Hơn nữa các tế bào