BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯

TRẦN THỊ THANH HƯƠNG
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, NUÔI CẤY, BẢO QUẢN
VÀ BƯỚC ĐẦU THĂM DÒ KHẢ NĂNG BIỆT HÓA
TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ TỦY XƯƠNG NGƯỜI
THÀNH DẠNG TẾ BÀO CƠ TIM Chuyên ngành : Hóa sinh Y học
Mã số : 62.72.04.01
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC



CÓ THỂ TÌM HIỂU LUẬN ÁN TẠI

- Thư viện Quốc gia
- Thư viện Trường Đại học Y Hà Nội
- Viện Thông tin – Thư viện Y học Trung ương
MỘT SỐ CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN

1. Trần Thị Thanh Hương, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Đỗ Doãn
Lợi, Tạ Thành Văn, (2010), “Phân lập, nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ
tủy xương người”, Tạp chí Nghiên cứu Y học, Tập 66 - số 1, 36 - 41.
2. Trần Thị Thanh Hương, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Đỗ Doãn
Lợi, Tạ Thành Văn, (2010), “Nghiên cứu sử dụng 5-azacytidine để biệt
hóa tế bào gốc trung mô theo hướng cơ tim”, Tạp chí Nghiên cứu Y
học, Tập 69 - số 4,
3. Trần Thị Thanh Hương, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành
Văn, Đỗ Doãn Lợi, (2010), “Biểu hiện marker bề mặt tế bào gốc trung
mô nuôi cấy nguồn gốc tủy xương người”, Tạp chí Y học Việt Nam,
Tập 372, Tháng 8 - số 2, 143 – 148.
4. Trần Thị Thanh Hương, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Đỗ Doãn
Lợi, Tạ Thành Văn, (2011), “Nghiên cứu biểu hiện một số gen đặc
trưng cho tổ chức tim trên tế bào gốc trung mô nuôi cấy trong quá trình
biệt hóa theo hướng tế bào cơ tim”, Tạp chí Nghiên cứu Y học, Tập 72 -
số 1, 1 - 7.
5. Trần Thị Thanh Hương, Phạm Xuân Thắng, Trần Vân Khánh,
Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn, (2011), “Nghiên cứu sự biến đổi hình
thái cấu trúc của tế bào gốc trung mô trong một số điều kiện biệt hóa in
vitro”, Tạp chí Y học Việt Nam, Tập 378, Tháng 2 - số 1, 9 - 13.


TS. Lý Tuấn Khải, Trưởng Khoa Huyết học - Bệnh viện Quân đội
108, đã hỗ trợ cho tôi trong việc thu thập mẫu bệnh phẩm trong nghiên
cứu.
Các cán bộ nhân viên Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, bộ
môn Hóa sinh, bộ môn Y sinh học Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội
đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và sử dụng các trang thiết bị của
trung tâm, bộ môn để nghiên cứu và hoàn thành đề tài này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với bố mẹ và anh chị
em trong gia đình, đặc biệt là chồng và các con đã luôn là chỗ dựa
vững chắc của tôi, luôn thương yêu, khuyến khích, động viên và tạo điều
kiện tốt nhất về tình cảm, tinh thần và vật chất cho tôi để hoàn thành tốt
chương trình học tập và thực hiện thành công luận án này.

Hà Nội, tháng 6 năm 2011

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác
tim mạch 37
Bảng 2.1. Các cặp mồi của kỹ thuật PCR 40
Bảng 3.1. Tỷ lệ áp dụng thành công qui trình phân lập, nuôi cấy và qui trình bảo
quản, phục hồi nuôi cấy tế bào gốc trung mô tủy xương người 57
Bảng 3.2. Kích thước đường kính ngang của nhân tế bào nuôi cấy (n= 30) 62
Bảng 3.3. Biểu hiện marker bề mặt của tập hợp tế bào nuôi cấy, giai đoạn P1 71
Bảng 3.4. Mức độ biểu hiện marker bề mặt CD13, CD73, CD90 trên tập hợp tế
bào nuôi cấy, giai đoạn P1 bằng kỹ thuật FACS 71
Bảng 3.5. Kết quả so sánh mức độ biểu hiện của gen MEF2C giữa MSC không
biệt hóa và MSC biệt hóa theo phương pháp của Tomita và cs, sử dụng gen tham
chiếu là β-actin 86

Biểu đồ 2.1. Cường độ tín hiệu huỳnh quang phân tích biểu hiện marker bề mặt
của MSC bằng kỹ thuật FACS 49
Biểu đồ 3.1. Biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD34 bề mặt tế bào nuôi cấy
giai đoạn P0 và P1 63
Biểu đồ 3.2. Biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD34 bề mặt tế bào nuôi cấy
giai đoạn P0 và P1 65
Biểu đồ 3.3. Các biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD13 bề mặt tế bào nuôi
cấy giai đoạn P1 68
Biểu đồ 3.4. Biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD73 bề mặt tế bào nuôi cấy
giai đoạn P0 và P1 69
Biểu đồ 3.5. Biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD90 bề mặt tế bào nuôi cấy
giai đoạn P0 và P1 70

Sơ đồ 1.1. Phân loại tế bào gốc tương ứng theo các giai đoạn
hình thành và phát triển ở người 3
Sơ đồ 2.1. Thiết kế nghiên cứu 41
cảm ứng và thúc đẩy quá trình hình thành
tim của động vật có xương sống 30
Hình 1.9. Hình ảnh mô cơ tim dưới kính hiển vi điện tử truyền qua 34
Hình 2.1. Mô hình phân lớp tế bào đơn nhân tủy xương bằng kỹ thuật ly tâm
theo gradient tỷ trọng 42
Hình 2.2. Dụng cụ hạ nhiệt độ bảo quản tế bào nuôi cấy 45
Hình 2.3. Mô hình nguyên lý tạo dòng của thiết bị đếm tế bào dòng chảy 47
Hình 2.4. Mô hình khuyếch đại tín hiệu phát hiện bằng phức hệ
Enzym - Strepavidin - Biotin trong nhuộm hóa miễn dịch tế bào 50
Hình 3.1. Hình ảnh tế bào bám dính và phát triển trên bề mặt nhựa nuôi cấy,
ngày thứ 15, giai đoạn P0, HE x 100 58
Hình 3.2. Hình ảnh tế bào bám dính và phát triển trên bề mặt nhựa nuôi cấy,
ngày thứ 20, giai đoạn P0, HE x 100 59
Hình 3.3. Hình thái và mật độ tế bào sau khi cấy chuyển ở giai đoạn nhân nuôi,
HE x200 60
Hình 3.4. Hình ảnh tế bào nuôi cấy dạng hình sao, hình sợi. HE x100 61
Hình 3.5. Hình ảnh tế bào nuôi cấy dạng hình thoi. HE x 100 61
Hình 3.6. Nhuộm kháng thể đơn dòng kháng CD34 trên lát cắt mẫu tế bào nuôi
cấy ở giai đoạn P1, ICC x200 64
Hình 3.7. Nhuộm kháng thể đơn dòng kháng CD34 trên lát cắt mẫu tế bào nuôi
cấy ở giai đoạn P3, ICC x 200 64
Hình 3.8. Nhuộm kháng thể đơn dòng kháng CD45 trên lát cắt mẫu tế bào nuôi
cấy ở giai đoạn P1, ICC x200 66
Hình 3.9. Nhuộm kháng thể đơn dòng kháng CD45 trên lát cắt mẫu tế bào nuôi
cấy ở giai đoạn P3, ICC x 200 67
Hình 3.10. Tế bào nuôi cấy biệt hóa theo hướng tạo tế bào mỡ,
sau biệt hóa 10 ngày, nhuộm bằng phương pháp Oil – Red – O x 100 72
Hình 3.11. Tế bào nuôi cấy biệt hóa theo hướng tạo tế bào mỡ, sau 10 ngày biệt
hóa, nhuộm bằng phương pháp Oil – Red – O x200 73
Hình 3.12. Tế bào gốc trung mô phát triển sau bảo quản và phục hồi nuôi cấy, MỤC LỤC

Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Danh mục các chữ viết tắt
Mục lục
Danh mục các bảng, biểu đồ
Danh mục các hình vẽ, hình ảnh
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Những hiểu biết cơ bản về tế bào gốc 3
1.1.1. Tế bào gốc và cách gọi tên 3
1.1.2. Những đặc điểm chung của tế bào gốc 5
1.1.3. Tế bào gốc của tủy xương 7
1.2. Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells) 10
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu 10
1.2.2. Những đặc điểm cơ bản của tế bào gốc trung mô 11
1.2.3. Khả năng biệt hóa in vitro của tế bào gốc trung mô 16
1.2.4. Tiêu chuẩn tối thiểu của tập hợp tế bào gốc trung mô nuôi cấy 19
1.2.5. Tiềm năng tái tạo phục hồi mô cơ tim của tế bào gốc trung mô 20
1.3. Phương pháp phân lập và điều kiện nuôi cấy tế bào gốc trung mô tủy
xương người 23
1.3.1. Phân lập tế bào gốc trung mô 23
1.3.2. Nuôi cấy tế bào gốc trung mô 26
1.4. Liệu pháp tế bào đối với một số bệnh lý tim mạch 28

3.2.2. Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô theo quy trình của Shim và cs 87
CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 88
Phân lập, nuôi cấy, nhận biết và bảo quản tế bào gốc trung mô từ tủy
xương người 89
Phân lập, nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ tủy xương người 89
Định danh tế bào gốc trung mô sau phân lập và nuôi cấy từ tủy xương người 94
Bảo quản tế bào gốc trung mô sau phân lập và nuôi cấy từ tủy xương người 102
Biệt hóa tế bào gốc trung mô nuôi cấy theo hướng dạng tế bào cơ tim 102
Quy trình biệt hóa invitro tế bào gốc trung mô nuôi cấy theo hướng tạo dạng tế
bào cơ tim 103
Kết quả biệt hóa theo hướng dạng tế bào cơ tim 105
KẾT LUẬN 113
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤCs

1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, y học tái tạo (regenerative medicine) đã và đang trở thành một
lĩnh vực mũi nhọn của y học hiện đại. Một trong những phương hướng của y
học tái tạo là nghiên cứu việc cấy ghép mô, tế bào vào cơ thể trưởng thành nhằm
phục hồi một phần hay toàn bộ chức năng của mô, tế bào sau những thương tổn
bệnh lý hay lão hóa, sau những sang chấn cơ học hay do những khuyết tật bẩm
sinh. Cùng với những tiến bộ về sinh học tế bào, y học tái tạo đang hướng tới
các nghiên cứu nhằm khai thác tiềm năng của tế bào gốc trưởng thành đối với
quá trình phục hồi của các mô có tính biệt hóa cao (thần kinh, mô cơ tim). Liệu
pháp tế bào gốc trưởng thành (adult stem cell) đã và đang được sử dụng trong
điều trị các loại bệnh lý khác nhau, trong đó có một số bệnh tim mạch [90]. Tế
bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cell - MSC) là một trong ba loại tế bào

chứng minh khả năng đa biệt hóa của MSC, vừa góp phần giải thích cơ chế tác
dụng cải thiện chức năng tim thu được sau liệu pháp tế bào gốc trên 6 bệnh nhân
NMCT như đã trình bày ở trên.
Mục tiêu của đề tài:
1. Áp dụng quy trình phân lập, nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc trung mô
từ tủy xương người.
2. Nghiên cứu áp dụng một số quy trình biệt hóa tế bào gốc trung mô
thành dạng tế bào cơ tim. 3
CHƢƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. MỘT SỐ VẤN ĐỀ CƠ BẢN VỀ TẾ BÀO GỐC VÀ SỰ BIỆT HÓA
1.1.1. Tế bào gốc và phân loại
Tế bào gốc đầu tiên của cơ thể xuất hiện từ khi trứng được thụ tinh với tinh
trùng. Các tế bào gốc được hình thành tương ứng với từng thời kỳ phát triển của
cá thể. Quá trình hình thành và phát triển của cá thể khiến cho các tế bào gốc
giảm dần về khả năng biệt hóa, từ tổng năng (totipotent) của hợp tử, toàn năng
(pluripotent) của các tế bào gốc phôi, đến đa năng (multipotent) của tế bào gốc
trưởng thành và cuối cùng là đơn năng (unipotent) của các tế bào tiền thân.
Sơ đồ 1.1. Phân loại tế bào gốc tương ứng theo các giai đoạn
hình thành và phát triển ở người

TẾ BÀO GỐC NGƯỜI
Phôi
Thai
Sơ sinh
Trưởng thành

Tinh trùng
Tế bào
máu
Mắt
Thần kinh
Biểu bì
(Da, tóc)
Gan
Tế bào
trung mô
Tụy

4
1.1.1.1. Theo khả năng biệt hóa
- Tế bào gốc toàn năng (totipotent): là loại tế bào gốc xuất hiện đầu tiên của cơ
thể sinh vật khi trứng được thụ tinh với tinh trùng, ở giai đoạn phôi dâu
(blastomeres). Các tế bào này có tiềm năng biệt hóa cao nhất, là nguồn gốc hình
thành tất cả các loại tế bào của một bào thai hoàn chỉnh.
- Tế bào gốc toàn năng (pluripotent): là các tế bào được phân lập từ lớp sinh
khối tế bào bên trong (inner cell mass) ở giai đoạn phôi nang (blastocyst). Trừ tế
bào màng nuôi, tế bào gốc toàn năng có khả năng biệt hóa thành những tế bào
thuộc ba lá phôi (trung bì, nội bì và ngoại bì) - nguồn gốc của tất cả tế bào có
chức năng chuyên biệt của cơ thể sau này. Các tế bào gốc toàn năng không biệt
hóa tạo ra tế bào màng nuôi, nên từ các tế bào gốc này không có khả năng hình
thành một bào thai hoàn chỉnh.
- Tế bào gốc đa năng (multipotent): là các tế bào có khả năng biệt hóa thành
nhiều loại tế bào khác nhau, được phân lập từ mô đã biệt hóa nguồn gốc thai
hoặc cơ thể trưởng thành, ví dụ: tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc trung mô
- Tế bào gốc tiềm năng (oligopotent), tứ năng (quartpotent), đơn năng
(unipotent): là các tế bào gốc định cư hoặc các tế bào tiền thân tồn tại trong các

1.1.2. Những đặc điểm chung của tế bào gốc
Tế bào gốc là những tế bào chưa biệt hóa hoặc biệt hóa chưa hoàn toàn ở
các mức độ khác nhau, vì vậy có khả năng hình thành các dòng tế bào chuyên
biệt. Ngày nay, người ta đã phân lập được các tế bào gốc từ các mô đã biệt hóa
của cơ thể trưởng thành - tế bào gốc trưởng thành. Nếu như tế bào gốc phôi và tế
bào gốc của bào thai đóng vai trò hình thành cá thể thì tế bào gốc trưởng thành
có vai trò chính trong hệ thống tái tạo, sửa chữa mô; tạo ra các tế bào có chức
năng thay thế cho các tế bào bị thiếu hụt do các quá trình sinh lý cũng như bệnh
lý của mô sau khi cá thể chào đời. Các tế bào gốc trưởng thành do vậy có khả
năng tự làm mới (renewal) và tồn tại trong suốt quá trình sống của cá thể.
1.1.2.1. Tế bào gốc là những tế bào chưa biệt hóa
Một trong những đặc tính căn bản của tế bào gốc là không có cấu trúc đặc
hiệu mô, cấu trúc mà nhờ đó các tế bào thực hiện các chức năng chuyên biệt của

6
từng mô (ví dụ: chức năng co bóp để bơm máu từ tim ra các động mạch của tế
bào cơ tim, chức năng vận chuyển các phân tử oxy của tế bào hồng cầu, chức
năng dẫn truyền tín hiệu của tế bào thần kinh ).
1.1.2.2. Tế bào gốc có khả năng tự làm mới và bảo tồn kiểu hình không biệt hóa

Hình 1.1. Sự khác biệt giữa tế bào gốc và tế bào tiền thân
(Nguồn © 2001 Terese Winslow, Lydia Kibiuk stemcells.nih.gov)
Không giống như các tế bào đã biệt hóa cao (tế bào cơ tim hay tế bào thần
kinh), tế bào gốc trưởng thành có khả năng tăng sinh và tự làm mới (self-
renewal) mà vẫn giữ được đặc tính không biệt hóa trong suốt quá trình tồn tại
của mô, cơ thể. Quá trình tự làm mới thông qua sự phân chia tế bào một cách
đối xứng (symmetric) tạo ra hai tế bào gốc hoặc phân chia không đối xứng
(asymmetric) tạo ra một tế bào gốc và một tế bào tiền thân bắt đầu có xu hướng
biệt hóa. Trong khi đó, các tế bào tiền thân không có khả năng này, chúng phân
chia hình thành hai tế bào biệt hóa có chức năng chuyên biệt (Hình 1.1). Khả

Trong trường hợp thiếu máu hoặc thiếu oxy trong máu, tủy vàng nhanh chóng
chuyển thành tủy đỏ. Tủy xương gồm hệ thống những xoang mạch (mao mạch
kiểu xoang) xen kẽ với những khoang tạo máu. Những khoang tạo máu có nền là
mô võng và các thành phần gian bào.
Trong các lỗ lưới của mô võng chứa một tập hợp các loại tế bào rất đa dạng,
chiếm phần lớn là quần thể các tế bào máu ở các giai đoạn phát triển và biệt hóa
khác nhau, cùng với đó là các tế bào gốc của tủy xương. Cho đến nay đã xác
định được ba loại tế bào gốc tuỷ xương, bao gồm: tế bào gốc tạo máu
(Hematopoietic Stem Cell - HSC), tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem
Cell - MSC) và tế bào tiền thân nội mô (Endothelial Progenitor Cell, EPC) [11].
HSC và MSC là hai quần thể tế bào gốc của tủy xương được nhiều nghiên cứu

8
đề cập tới. Sự phân bố và khả năng biệt hóa của chúng trong tủy xương được mô
tả ở hình 1.2.
Mô võng gồm những tế bào võng hình sao tựa trên lưới sợi võng. Những tế
bào này có khả năng thực bào và điều tiết quá trình sinh sản, biệt hóa của các
dòng tế bào tạo máu. MSC tủy xương được xác định là thuộc loại tế bào võng.
Thành phần gian bào ở tủy xương gồm collagen, glycosaminoglycan và
những glycoprotein cấu trúc. Glycosaminoglycan ở tủy xương là hyaluronic
acid. Hai protein cấu trúc được xác định là fibronectin và laminin.
1.1.3.1. Tế bào gốc tạo máu
Ở người trưởng thành, HSC được sản sinh và cư trú chủ yếu tại tủy xương.
Chúng có thể được huy động và có mặt trong máu ngoại vi, nhưng trong các mô
khác (gan, lách) thì rất hiếm. HSC chiếm tỷ lệ 1:10.000 các tế bào của tủy
xương và nhanh chóng hình thành tất cả các tế bào tiền thân thuộc dòng tế bào
máu in vivo và in vitro [132]. HSC được chia thành HSC dài hạn (long-term
repopulating HSC), là tập hợp HSC có tiềm năng tự làm mới cao và HSC ngắn
hạn (short- term repopulating HSC), là tập hợp HSC có khả năng hình thành một
cách nhanh chóng các tế bào thuộc dòng tế bào máu sau quá trình cấy ghép tủy

10
phân lập biểu hiện một số marker của tế bào tiền thân hay tế bào gốc như CD34,
VEGFR-2

(vascular endothelial growth factor receptor -2). VEGFR-2 có nhiều
tên gọi khác

như: KDR (kinase insert domain receptor), Flk-1 (fetal liver kinase-
1) và CD309. Sau một thời gian nuôi cấy, EPC biểu hiện các marker đặc trưng
cho tế bào nội mô như: CD34, CD309, CD31, Tie-2 (tyrosine kinase with
immunoglobulin and EGF homology domains) hay CD202 và E- Selectin hay
CD62E [10].
1.2. TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ (MESENCHYMAL STEM CELLS)
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu
Tế bào gốc trung mô đã được giới khoa học biết đến trước khi tên gọi
“MSC” ra đời.
- Năm 1867, Cohnheim phát hiện trong tủy xương có các tế bào gốc không
thuộc tế bào gốc tạo máu (non-Hematopoietic Stem Cell).
- Từ 1966 – 1987, Friedenstein và cs được coi là một trong những nhà khoa học
có các nghiên cứu tiên phong về MSC, mở ra một thời kỳ bùng nổ các báo cáo
về loại tế bào gốc này. Từ tủy xương chuột, Friedenstein đã phân lập được một
loại tế bào dạng nguyên bào sợi [44], có khả năng bám dính và tăng sinh mạnh
trong môi trường nuôi cấy. Các tế bào này có khả năng biệt hóa thành tạo cốt
bào (osteoblasts), tế bào mỡ (adipocytes), tế bào sụn (chondrocytes) và được gọi
là tế bào gốc của tủy (marrow stem cells).
- Năm 1991, Caplan đề xuất tên gọi tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem
Cells - MSC) để mô tả các tế bào không đồng nhất, có nguồn gốc tủy xương, có
khả năng bám dính vào bề mặt nhựa nuôi cấy thông thường, các tế bào này tăng
sinh khi nhân nuôi ngoài cơ thể và có thể biệt hóa để tạo ra các loại tế bào liên
kết đa dạng [28]. Tuy nhiên theo một số tác giả khác, các tế bào này thuộc loại