Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
332
THU NHẬN VÀ BIỆT HOÁ TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ
TUỶ XƯƠNG CHUỘT (Mus musculus var. Albino)
Trương Định, Trương Hải Nhung, Phạm Văn Phúc, Phan Kim Ngọc
ĐH Khoa học Tự nhiên TPHCM
MỞ ĐẦU
Tuỷ xương chứa một nguồn tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cell-MSC)
dồi dào. Các tế bào MSC này được thu nhận và nuôi cấy trong môi trường DMEM/F12
(Sigma), 10% FBS (Invitrogen). Sau khoảng 10 ngày nuôi cấy, các tế bào MSC tăng
sinh mạnh và chiếm 70-80% diện tích bề mặt đáy bình Roux (25 cm
2
, Nunc), tiến hành
cấy chuyền với trypsin/EDTA (Sigma) 0,25% nhằm cung cấp chất din h dưỡng và không
gian phát triển cho tế bào MSC.
Tế bào MSC là tế bào gốc đa năng, chúng có khả năng biệt hoá th ành rất nhiều kiểu
tế bào chức năng khác nhau. Chúng có thể biệt hoá th ành tế bào xương khi nuôi trong
môi trường DMEM/F12, 10% FBS có bổ sung dexamethasone, glycerol phosphate,
ascorbate, EGF (nhân tố tăng trưởng biểu mô); thành tế bào mỡ khi nuôi trong môi
trường DMEM/F12, 10% FBS có bổ sung isobutyl -methylxanthine, dexamethasone,
insulin, indomethacin; thành tế bào giống tế bào thần kinh khi nuôi trong môi trường
DMEM/F12, 10% FBS có bổ sung dịch chiết não chuột.
Tế bào gốc nói chung và tế bào gốc trung mô nói riêng hiện đang là mối quan tâm
hàng đầu của nhiều nhà khoa học và những thầy thuốc lâm sàng bởi khả năng đặc biệt
duy nhất của chúng đó là khả năng biệt hoá thành nhiều kiểu tế bào khác nhau trong cơ
thể, như xương, sụn, mỡ, tế bào thần kinh Thêm vào đó chúng là một nguồn tế bào
đầy hứa hẹn cho việc cấy ghép và sinh dược phẩm, chúng cũng phục vụ như là một mô
hình tối ưu của sự phát triển của động vật có xương sống.
Trong các nghiên cứu về sự biệt hoá, các tế bào MSC biệt hoá thành xương, sụn và mỡ
được sử dụng nhiều nhất như là bằng chứng cụ thể về tiềm năng biệt hoá của tế bào gốc.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

nhưng vẫn chừa lại khoảng 1ml và tiếp tục ủ trong tủ ấm 37
0
C trong 2-3 phút. Sau
đó, lắc nhẹ bình Roux để tách tế bào ra khỏi bề mặt đáy. Sau khi tế bào tròn lên và
tách ra khỏi bề mặt nuôi, trung hoà trypsin thừa bằng 10-11ml môi trường DMEM
10% FBS. Huyền phù tế bào đó được chia đều cho 3 bình Roux mới.
Biệt hoá tế bào gốc trung mô
Biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tế bào tạo mỡ bằng môi trường nuôi
DMEM/F12 10% FBS bổ sung hỗn hợp 1 μM dexamethasone, 200 μM indomethacin,
1,7 μM insuline, 500 μM isobutyl-methylxanthine (tất cả đều của Sigma). Sự biệt hóa
được ghi nhận khi quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại X20, X40 thấy có sự xuất
hiện các giọt mỡ nhỏ. Ngoài ra, các tế bào mỡ còn được xác định dựa vào phương pháp
nhuộm với thuốc nhuộm Sudan black (Merck) l à thuốc nhuộm lipid, nó chỉ hòa tan
trong lipid và tạo màu đen.
Biệt hoá thành tế bào xương: Các tế bào MSC được nuôi trong môi trường
DMEM/F12 10% FBS với 100 nM dexamethasone, 50 μg/ml L-ascorbic acid 2-
phosphat (AsAP) và 100 mM β-glycerolphosphate (tất cả đều của Sigma). Sau 7-14
ngày, đánh giá sự biệt hoá thông qua khả năng tích tụ của calcium trong chất nền với
phương pháp nhuộm với thuốc nhuộm Alizarin Red (Sigma).
Biệt hoá thành tế bào giống tế bào thần kinh: Môi trường biệt hoá tế bào gốc trung
mô thành tế bào thần kinh là môi trường DMEM/F12 10% FBS, bổ sung 10% dịch chiết
não chuột. Xác định tế bào thần kinh sau khi được biệt hoá bằng hình dạng đặc trưng
của chúng.
Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
334
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Nuôi cấy chọn lọc tế bào MSC
Sau 24 giờ nuôi cấy, tế bào MSC có hiện tượng bám trên bề mặt bình Roux, trong
khi các tế bào tạo máu vẫn trôi lơ lửng trong dịch huyền phù tế bào.
Hình 1. Kết quả nuôi cấy chọn lọc MSC. (a) Tế bào MSC vừa mới thu nhận; (b) Tế bào MSC sau 24 giờ nuôi

thuốc nhuộm Sudan Black; (c) Các tế bào tạo xương: sau 7-14 ngày trong môi trường biệt hoá tạo
xương, các tế bào bắt đầu tròn lại và tích tụ calci trong chất nền. Sự tích tụ calci được xác định
bằng cách nhuộm với Alizarin Red; (d) Tế bào giống tế bào thần kinh: các tế bào MSC sau khi nuôi
trong môi trường biệt hoá thần kinh, MSC thay đổi hình dạng thành tế bào giống tế bào thần kinh
với exon dài ( ), thân tế bào thần kinh ( ).
Biệt hoá hành tế bào mỡ
Sau 48 giờ, các tế bào bắt đầu tích tụ các giọt mỡ trong tế bào chất. Các giọt mỡ
nhỏ góp lại dần thành các giọt lớn. Chúng chuyển từ dạng dài, trải rộng chuyển sang
dạng tròn. Các giọt mỡ có thể quan sát dễ dàng dưới kính hiển vi đảo ngược có độ
phóng đại X20.
Biệt hoá hành tế bào xương
Sau khi nuôi trong môi trường biệt hóa, các tế bào từ dạng dài chuyển sang dạng
tròn và hình hạt đậu. Về mặt hình thái học, có thể đánh giá sơ bộ là các tế bào này đã
biệt hóa thành công. Dạng thuôn dài, trải rộng là hình dạng của tế bào gốc trung mô và
dạng tròn hay hình hạt đậu là hình dạng của tế bào tạo xương (osteoblast).
Khi nhuộm với Alizarin red, các tế bào tròn hay hình hạt đậu sẽ nhuộm màu đỏ
cam. Điều này chứng tỏ các tế bào có nguồn gốc từ tế bào MSC này đã có sự lắng tụ
muối calci trong chất nền ngoại bào. Như vậy, các tế bào MSC đã biệt hóa thành các tế
bào tạo xương.
(a)
(b)
(c)
(d)
X20
X20
X20
X40
Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
336
Biệt hoá thành tế bào giống tế bào thần kinh

adipocytes in DMEM/F12, 10% FBS plus isobutyl-methylxanthine, dexamethasone,
insulin, indomethacin; to neuron-like cells in DMEM/F12, 10% FBS plus mouse brain
crude extract.