Trờng đại học quốc gia
đại học khoa học tự nhiên
khoa sinh học
PCR
(Polymerase chain reaction)
(Tiểu luận Sinh học phân tử)
Sinh viên: Nguyễn Đức Nhự
Lớp K6-CNTNSH
Giảng viên hớc dẫn:
PGS.TS
Đỗ Ngọc Liên
1
Hµ néi, N¨m 2004
2
PCR
(Polymerase chain reaction)
I. Những kiến thức cơ bản về PCR.

PCR là từ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction trong tiếng Anh.
Có nhiều cách dịch cho cụm từ này. Có sách dịch là phản ứng tổng hợp dây chuyền
nhờ Polymerase, có tài liệu dịch là phản ứng chuỗi trùng hợp, hay đơn giản là kỹ
thuật PCR. ở đây chúng ta sẽ dùng đơn giản là kỹ thuật PCR.
Kỹ thuật này do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào giữa thập niên 80
của thế kỷ hai mơi đã đa lại một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử. Từ
đó đến nay, nó đã đợc sử dụng rộng rãi và trở thành phần không thể thiếu trong các
hầu hết các phòng thí nghiệm sinh học phân tử.
Kary Mullis nhận giải thởng Nobel năm 1993 về phát minh PCR
Kary Mullis đã viết trong tạp chí khoa học Mỹ: Bắt đầu bằng một phân tử
riêng lẻ có chứa chất liệu di truyền ADN, PCR có thể tạo ra 100 triệu phân tử t-
ơng tự trong một buổi chiều. Phản ứng dễ dàng thực hiện. Nó đòi hỏi không
nhiều hơn một ống nghiệm, một vài hoá chất đơn giản và một nguồn nhiệt. Mẫu

III. Cơ sở khoa học (nguyên lý) của kỹ thuật PCR:

PCR là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của
quá trình sao chép AND với sự tham gia của một loại enzyme AND polymerase
chịu nhiệt, có hai đoạn ngắn AND, một sợi làm mồi (primers) và dùng các đoạn
AND mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với nó. Vì vậy khởi
đầu quá trình tổng hợp AND cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotide (có độ dài từ
4
3-60 nucleotide). Đoạn này gắn kết với and khuôn tại điểm khởi đầu sao chép.
Đó là đặc điểm quan trọng đầu tiên của PCR vì ADN polymerase đợc điều khiển
để tổng hợp một đoạn ADN đặc thù. Quá trình này đợc enzyme adn polymerase
điều khiển để tổng hợp nên một sợi ADNđặc thù. Các sợi ADN mạch đơn làm
khuôn đợc tạo ra theo cách đơn giản là nâng nhiệt độ lên trên 90 độ C mà thờng là
94 độ C cho chuỗi xoắn kép ADN bung ra.
Cả hai sợi ADN đều đợc dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các
đoạn mồi (primer) đợc cung cấp để bám vào vị trí tơng ứng cho cả hai sợi. Trong
kỹ thuật PCR, các đoạn mồi đợc chọn nằm ở hai đầu đoạn ADN cần nhân lên sao
cho các sợi ADN tổng hợp mới đợc bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía
đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài nằm giữa hai đoạn mồi này.
Độ dài của sản phẩm PCR có thể từ vài trăm đến hàng ngàn, thậm chí hàng chục
ngàn cặp nucleotide. Nh vậy, sau mỗi chu kỳ, các điểm bám cho các đoạn mồi lại
xuất hiện cho mỗi ADN mới đợc tổng hợp . Hỗn hợp phản ứng lại đợc nâng nhiệt
độ lên thích hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này
sau đó đợc dùng làm khuôn cho chu kỳ tiếp theo, bao gồm các bớc: gắn mồi, tổng
hợp ADN và tách rời các đoạn.
Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ của phản ứng, tính
theo lý thuyết ta sẽ có 2
n
bản sao các phân tử ADN mạch kép nằm giữa hai đoạn
mồi. Đó là đặc điểm quan trọng thứ hai của kỹ thuật PCR. Nh vậy kết quả là một

(3 bớc điều chỉnh nhiệt độ ) cho một chu kỳ:
1. Bung liên kết của ADN (denuteration):
Mục đích của việc này là làm biến tính ADN, khiến hai sợi ADN tách nhau ra.
Do đó, các đoạn mồi có thể gắn vào phần bổ sung trên ADN ở bớc sau. Cũng trong
bớc này, các phản ứng enzym đều ngừng lại (ví dụ nh sự mở rộng của chu trình tr-
ớc).
6
Đợc thực hiện ở nhiệt độ khoảng 94
0
trong vài giây đến vài phút. Tại nhiệt độ
này, các phân tử ADN mạch kép sẽ bị tách ra hoàn toàn tạo nên các sợi đơn dùng
để làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào và enzyme polymerase xúc tác tổng hợp.
2. Mồi bám ( hay còn gọi là ủ với mồi) (annealing):
Ngay lập tức nhiệt độ đợc hạ xuống 54
0
C để các đoạn mồi gắn với các trình tự
bổ xung tơng ứng trên các phân tử ADN làm khuôn.
Các đoạn mồi dịch chuyển lộn xộn dới chuyển động Brao (Brown). Liên kết
ion giữa các đoạn mồi đơn và các sợi khuôn đơn liên tục đợc tạo ra rồi lại đứt gãy.
Các liên kết bền vững hơn (do những mồi gắn đúng vào vị trí) kéo dài lâu hơn.
Trên những đoạn ngắn ADN mạch kép bao gồm khuôn và mồi này, ADN
polymerase có thể gắn vào và bắt đầu kéo dài chuỗi. Sau khi đã có một vài bazơ đ-
ợc gắn vào, liên kết hyđro giữa mạch khuôn và mồi trở nên đủ mạnh để nó không
bị đứt vỡ nữa.
Nhiệt độ gắn kết này góp phần quyết định tính đặc hiệu của phản ứng PCR.
Nhiệt độ và khoảng thời gian dùng ở đay thay đổi tuỳ thuộc vào chiều dài của
ADN cần nhân lên.
3. Tổng hợp (hay còn gọi là kéo dài)(extension):
Các đoạn mồi nào đã đợc kéo dài một vài bazơ thì có lực liên kết với khuôn
mạnh hơn lực phá vỡ chúng. Còn các mồi gắn không chính xác trở nên lỏng lẻo

đực nhuộm bằng Ethidium Bromide, một loại hoá chất có khả năng bám và làm
hiển thị ADN. Độ dài của ADN sản phẩm đợc tính bằng cách so sánh với chỉ thị
ADN (ADN marker), sử dụng thông dụng nhất là ADN của thực khuẩn thể Lamda
cắt bằng enzyme giới hạn Hindlll.
V- Phản ứng RT-PCR (PCR ngợc)
* Nguyên lý:
Phản ứng RT-PCR thực chất là phản ứng nhân một đoạn giới hạn của
khuôn ARN theo nguyên lý của phản ứng PCR, bao gồm hai giai đoạn: Giai đoạn
thứ nhất là chuyển đổi một sợi ARN làm khuôn thành ADN hai sợi, sau đó qua
giai đoạn thứ hai, dùng ADN hai sợi này tiếp tục làm khuôn để thực hiện phản ứng
PCR nh đã giới thiệu.
ARN là một sợi bao gồm 4 nucleotide liên kết vơi nhau, trong đó có Adenin,
Guanin, Cystosin và Uracin. Chuỗi nucleotide này phải đợc chuyển đổi thành AND
2 sợi mà thành phần Uracin đợc thay thế bằng Thymin. Phản ứng làm biến đổi
ARN hệ gen thành AND phải nhờ đến vai trò của một loại enzyme gọi là enzyme
sao chép ngợc (Reverse Transcriptase), do vậy giai đoạn này đợc gọi là chuyển ng-
ợc (RT), đợc thực hiện ở nhiệt độ 50-55 độ C trong 30 phút. Khi đã có ADN 2 sợi
làm khuôn chuyển đổi từ ARN ban đầu, phản ứng tiếp theo là PCR nh đã giới thiệu
và đợc thực hiện theo 3 bớc thay đổi nhiệt độ cho phù hợp ở mỗi chu kỳ. Toàn bộ
phản ứng nhân một đoạn ADN từ khuôn ARN qua hai giai đoạn nói trên đợc gọi là
phản ứng RT-PCR hay phản ứng PCR ngợc.
Do một số virus có hệ gen là ARN cho nên muốn nhân một đoạn gen của nó
thì ngời ta phải dùng phản ứng RT-PVR. Một số nghiên cứu về ARN thông tin
cũng cần đến phản ứng RT-PCR để chuyển đổi sợi ARN thành ADN cho quá trình
đồng hoá để giải trình tự hoặc tái tổ hợp trong nghiên cứu biểu thị protein.
Trớc khi tiến hành phản ứng PCR phải thực hiện giai đoạn chuyển ngợc RT,
sau đó thành phần ADN đợc chuyển đổi này làm khuôn tiếp tục mới đợc nhân lên
bằng phản ứng PCR. Quá trình này gồm hai giai đoạn:
- Phản ứng RT: Đó là giai đoạn chuyển ARN hệ gen thành ADN nhờ
enzyme sao chép ngợc biến ARN ở dạng sợi đơn sang dạng sợi kép ADN bằng

gen hoàn toàn khác.
Kết quả của PCR đợc kiểm tra thông qua băng điện di. Ngời ta thờng sử dụng
phơng pháp điện di trên gel agarose. Nếu không có sản phẩm nào đợc tạo ra, trên
băng điện di sẽ không có vạch nào. Nếu có các sản phẩm khuếch đại không mong
muốn, chúng ta sẽ thu đợc băng điện di có nhiều vạch.
10
Xem trên băng điện di:
Cột ở bên trái là hỗn hợp các đoạn đã biết kích thớc để so sánh. Chú ý rằng
khoảng cách giữa các đoạn trên cột là cấp số mũ.
Cột 1: đoạn PCR dài khoảng 1850 bazơ.
Cột 2 và 4: các đoạn dài khoảng 800 bazơ.
Cột 3: không có sản phẩm nào đợc tạo thành, cho thấy PCR đã thất bại.
Cột 5: nhiều vạch đợc tạo ra do một trong những đoạn mồi đã gắn sai chỗ.
Kết quả cuối cùng có thể đợc kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrolamide,
các đoạn gen có độ dài khác nhau hiện rõ có thể đọc đợc bằng mắt thờng nhờ
so sánh với thang chuẩn.
11
VII. Các chỉ tiêu ảnh hởng đến phản ứng PCR
Một phản ứng PCR đòi hỏi nhiều thành phần tham gia: 1. AND mẫu làm
khuôn; 2. Enzyme ADN polymerase; 3. Mồi và nhiệt độ lai; 4. Dung dịch đệm
(Nồng độ ion Magiê); 5. Thành phần dNDPs; 6. Thời gian, số lợng chu kỳ phản
ứng; 7. Yếu tố chu trình nhiệt; 8. Nớc; 9. Thiết bị và dụng cụ nhiệt.
1. AND mẫu làm khuôn:
Phản ứng PCR tối u xảy ra trên ADN thật tinh sạch, nhng nhiều kỹ thuật
chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tối u với ADN thu nhận trực tiếp từ dịch chiết
tế bào. Lợng ADN mẫu sử dụng cũng có có khuynh hớng giảm (1 microgam xuống
còn 100 nanogam) với việc sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao. Hơn nữa
việc giảm lợng mẫu ban đầu còn có hạn chế đợc các khuếch đại ký sinh (các nhân
bản giả) tạo nên các sản phẩm phụ không mong muốn. Một u điểm khác của phản
ứng PCR là cho phép khuếch đại cả những mẫu ADN không đợc bảo quản tốt, đã

hợp này).
Ngày nay nhiều polymerase chịu nhiệt khác đã đực đa ra thị trờng với nhiều
chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn. Tth polymerase, một enzyme tách chiết
từ vi khuẩn Thermus thermophilus có khả năng hoạt động nh một enzyme phiên
mã ngợc khi có mặt ARN khuôn và ion Mg
++
; nhng với sự hiện diện của ADN
13
khuôn và ion Mg
++
, Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch đại ADN. Enyme này cho
phép khuếch đại bản mẫu là ARN thông qua sự hình thành cADN.
3. Mồi và nhiệt độ lai
3.1. Chiều dài mồi
Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt đợc một sự nhân bản đặc trng và hiệu quả
cao nhằm thu nhận sản phẩm PCR chất lợng cao trên khuôn ADN biết trớc.
Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phơng pháp PCR và tuân thủ một số
nguyên tắc sau:
- Trình tự của mồi đợc chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ xung giữa mồi xuôi
và mồi ngợc, và cũng không có cấu trúc kẹp tóc (hair loop forming) do sự bắt cặp
bổ xung giữa các phần khác nhau trong chuỗi nucleotide của một mồi.
- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi xuôi và mồi ngợc không cách biệt quá xa
(thông thờng trong khoảng 4-5 độ C). Thành phần nucleotide của các mồi cân bằng
tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần.
- Các mồi phải chọn đặc trng cho trình tự ADN cần nhân bản, không trùng với
các trình tự lặp lại trên gen.
- Độ dài cần chọn cho một mồi đặc hiệu thông thờng là 18-30 nucleotide. Nếu
quá ngắn (dới 10 nucleotide), mồi sẽ bám không đặc hiệu; nếu quá dài (trên 30
nucleotide), chu kỳ nhiệt ở giai đoạn thứ 3 (giai đoạn tỏng hợp hay kéo dài) sẽ ảnh
hởng đến cơ chế bám của mồi. Nhiệt độ nóng chảy của mồi không đợc vợt quá chu

tránh điều này.
vi . Các đầu 3 của các mồi không nên bổ sung cho nhau (cụ thể hơn là không
nên bắt cặp bazơ với nhau), nếu không thì các dimer mồi sẽ đợc tổng hợp nhiều
hơn là các sản phẩm khác.
vii. Nên tránh dùng các mồi có thể tự bổ sung cho nhau (nghĩa là khả năng hình
thành cấu trúc 2
o
nh cái thòng lọng).
6.5 Dung dịch đệm cho phản ứng.
Dung dịch đệm thờng chứa:
+ Tris-HCl pH 8,3 10-50mM.
+ KCl không quá 50 mM; MgCl
2
1,5 mM hay cao hơn.
+ Mồi 0.2 - 1àM đối với mỗi mồi.
+ 50 - 200à đối với mỗi dNTP.
+ Gelatin hay BSA đến 100àg/ml.
+ Và/hoặc thuốc tẩy không mang tính ion ví dụ Tween-20 hay Nonidet P40
hay Triton x-100 (0,05 - 0.1% nếu dùng một loại nào đó). (Innis và Gelfan,
1990).
Các công thức hiện đại có thể khác một cách đáng kể, nhng chúng thờng có tỷ
lệ tơng đơng.
15
Ngời ta cho rằng PCR làm việc tốt nhất trong dung dịch đệm phiên mã ngợc
(Krawet và cộng sự, 19xx; Fuqua và ngời khác, 1990).
Nồng độ KCl hay NaCl cao hơn 50mM sẽ ức chế Taq, nhng với nồng độ thấp,
nó sẽ cần để giúp mồi gắn dễ dàng hơn.
Nồng độ ion Mg
2+
ảnh hởng đến việc gắn mồi, nhiệt độ Tm của khuôn, sự liên

dễ dẫn đến sự tạo nên sản phẩm PCR giả. Sự mất cân bằng trong thành phần các
nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của enzyme ADN polymerase.
16
6. Thời gian
6.1. Thời gian và nhiệt độ biến tính:
Hai trình tự bổ sung liên kết với nhau bởi liên kết hydro giữa các bazơ bổ
sung của chúng (G với C và A với T hay U), hình thành phân tử mạch kép ổn định.
Phản ứng PCR cần các sợi ADN mạch đơn làm khuôn, do đó nếu ADN khuôn ban
đầu không phải là dạng sợi đơn, nh hầu hết các virus ARN, thì cần phải làm nóng
17
nó đến trên nhiệt độ nóng chảy (melting temperature) của dạng sợi kép hoặc
nhiệt độ nóng chảy của một phần dạng sợi kép. Rồi sau đó làm lạnh nhanh nó.
Việc làm lạnh nhanh là để chắc chắn các sợi đã đợc làm biến tính, tức là các sợi đã
tách nhau ra, không còn liên kết lại với nhau nữa. Ngoài ra, nếu acide nucleic đợc
đun nóng trong dung dịch đệm chứa các ion có nồng độ thấp hơn 150mM NaCl thì
nhiệt độ nóng chảy thông thờng sẽ thấp hơn 100
o
C. Đây chính là khoảng nhiệt độ
làm việc của PCR, nhiệt độ biến tính nằm trong khoảng từ 91
o
C đến 97
o
C.
Taq polymerase có thời gian bán huỷ ở 95
o
C là 30 phút. Đây chính là lý do
tại sao không nên thực hiện quá 30 chu trình khuếch đại. Tuy nhiên cũng có thể
giảm nhiệt độ biến tính xuống sau khoảng 10 chu trình, khi mà chiều dài trung
bình của ADN đích đã giảm xuống. Ví dụ, đối với khuôn dài khoảng 300 cặp bazơ
hay ngắn hơn, nhiệt độ biến tính có thể đợc giảm xuống đến 88

o
C so với nhiệt độ Tm thấp nhất của cặp mồi đợc sử dụng
(Innis và GelfDNA, 1990). Rychlik và nhiều ngời khác (1990) đã chỉ ra cách xử sự
của Ta. Họ cho rằng nếu tăng nhiệt độ Ta lên 1
o
C sau mỗi chu trình thì tính đặc
hiệu của quá trình khuếch đại và số lợng sản phẩm (1kb chiều dài) đều tăng lên.
Một hệ quả của việc sử dụng nhiệt độ Ta quá thấp là một hay cả hai đoạn mồi lại
gắn vào các trình tự khác chứ không phải trình tự đích, do các bắt cặp sai một bazơ
hay sự gắn mồi một phần. Điều này không gây ảnh hởng gì nếu ta chỉ khuếch đại
các trình tự đích thân thuộc hoặc tơng tự nhau. Tuy nhiên, điều này có thể dẫn đến
việc khuếch đại không đặc hiệu và hậu quả là số lợng các sản phẩm mong muốn
bị giảm xuống.
Một hậu quả của việc sử dụng nhiệt độ Ta quá cao là rất ít sản phẩm đợc tạo
ra do khả năng gắn mồi bị giảm xuống. Một điều quan trọng khác cần cân nhắc là
một cặp mồi với nhiệt độ Ta không thích hợp sẽ không bao giờ cho sản phẩm duy
nhất với số lợng đáng kể, và còn có thể dẫn đến sự khuếch đại không đối xứng có
nghĩa là sự khuếch đại sợi đợc gắn mồi hiệu quả hơn.
Sự gắn mồi không thể diễn ra trong thời gian dài: hầu hết các mồi chỉ gắn
hiệu quả đợc trong 30 giây hay ít hơn, trừ trờng hợp nhiệt độ Ta rất gần nhiệt độ
Tm hoặc các mồi dài bất thờng.

Hình trên minh hoạ ảnh hởng của nhiệt độ gắn mồi dến tính đặc hiệu và hiệu
suất khuếch đại của papillomavirus ngời type 16 (Human papillomavirus type 16,
HPV-16) (Williamson và Rybicki, 1991: J Med Virol 33: 165-171).
19