1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LỚP: DH06SH
Yo0oZ
Bài tiểu luận môn Chẩn đoán bệnh gia súc, gia cầm bằng sinh học phân tử

Đề tài:

CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ

GVHD: PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI

Sinh viên thực hiện: ĐINH CÁT ĐIỀM


trọng lượng phân tử lớn nhỏ khác nhau, tính phân cực nhiều hay ít khác nhau nên không thể nào
có một kỹ thuật sắc ký chung cho các loại hợp chất khác nhau. Vì lý do đó, tôi thực hiện đề tài:
“Các kỹ thuật sắc ký” với sự hướng dẫn của thầy Nguyễn Ngọc Hải.

II) TỔNG QUAN

II.1) Lịch sử sắc ký

¾ Năm 1903, nhà bác học Nga Michael Tswett đã cho dung dịch các sắc tố thực vật trong
ete dầu hoả lên cột nhồi bột mịn canxi cacbonat, ông thấy các sắc tố bị hấp phụ lên trên
đầu cột. Khi cho ete dầu hoả lên cột, các sắc tố di chuyển trong cột từ trên xuống dưới,
mỗi sắc tố có một tốc độ riêng, tách thành những vùng hay vòng màu xếp chồng lên
nhau, hình thành một hệ mà Tvest gọi đó là sắc đồ. Ông đặt tên cho phương pháp tách
này là sắc ký (Chromatography). Trong tiếng Hy Lạp,“chroma” có nghĩa là chất màu,
graphein có nghĩa là viết. Tên gọi này ngày nay vẫn được sử dụng mặc dù phương pháp
này còn được dùng tách các chất không màu.
¾ Đến thập kỷ 1930-1940, phương pháp này được phát triển nhanh chóng với nhiều kỹ
thuật khác nhau như sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực,
¾ Năm 1954, Mould D.L phát triển sắc ký gel để tách các hợp chất mang điện tích theo
trọng lượng phân tử của chúng. Đến năm 1964, Moor gọi là “gel permeation
chromatography” hay gọi là sắc ký lọc gel.
¾ Năm 1906, sắc ký khí được biết đến nhưng đến 1952, kỹ thuật này mới phát triển mạnh
mẽ, nhất là trong thập niên 1960.
¾ Năm 1967, Horvath C. là tác giả tạo máy sắc ký lỏng cao áp.

II.2) Định nghĩa sắc ký

Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dừng để tách các thành phần của một hỗn
hợp. Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha
luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động (Trong thí nghiệm của

trình rửa giải và dung môi dùng được và dung môi rửa giải (eluent), dịch hứng được ờ
cuối cột gọi là dịch rửa giải (eluate).
9 Nếu các chất được tách trên pha tĩnh (sắc ký khai thêm ta có thể lấy từng phần pha tĩnh
có mang chất (phân đoạn bột trên cột) đem chiết lấy chất.
9 Nếu các chất được tách ra ngoài pha tĩnh (sắc ký rửa giải) ta có thể hứng thu lấy các phân
đoạn dịch rửa giải có các chất cần phân tích.
c) Phát hiện các chất: Các chất màu có thể phát hiện dễ dàng, các chất không màu có thể
phát hiện bằng đèn tử ngoại hay bằng các thuốc thử. Trong sắc ký rửa giải có thể phát hiện các
chất khi chúng đi ra khỏi cột bằng cách cho dung dịch rửa giải đi qua một bộ phận phát hiện gọi
là detector đặt sau cột.

II.4) Phân loại các phương pháp sắc ký

II.4.1) Theo bản chất vật lý các pha
9 Pha động có thể là một chấ
t lỏng hay chất khí
9 Pha tĩnh có thể là một chất rắn (hạt xốp hay bột mắn) hay một chất lỏng (được giữ trên
một chất mang rắn).
Ö Do đó, dựa vào bản chất các pha ta phân biệt các phương pháp (trong tên của phương
pháp, pha động được nêu trước pha tĩnh):
1. Sắc ký lỏng - lỏng (liquid - liquid chromatography LLC)
2. Sắc ký lỏng - rắn (liquid - song chromatography LSC)
3. Sắc ký khí - lỏng (gas - liquid chromatography GLC)
4. Sắc ký khí - rắn (gas - solid chromatography GSC)
9 Hai phương pháp đầu gọi chung là sắc ký lỏng (LC).
4
9 Hai phương pháp cuối gọi chung là sắc ký khí (GC).

II.4.2) Theo hiện tượng sắc ký


chạy và tách trên pha tĩnh (Sắc đồ nằm trên pha tĩnh).
2. Sắc ký rửa giải (elution chromatoglaphy) cho pha động chạy và kép các chất l
ần
lượt ra ngoài pha tính (ra khỏi cột, ra khỏi giấy).

II.5) Tốc độ di chuyển của một chất, peak và hình dáng peak

II.5.1) Tốc độ di chuyển của một chất

Tốc độ di chuyên của một chất có thể được đặc trưng bởi hệ số phân bố của nó giữa hai
pha hoặc bởi các đại lượng về sự lưu giữ của chất đó trên pha tĩnh (thời gian lưu, th
ể tích lưu)
a. Thời gian lưu và thể tích lưu
Thời gian lưu là thời gian cần để một chất di chuyển qua cột sắc ký, khi ra khỏi cột nhờ
thiết bị detector ghi nhận tín hiệu và xuất hiện rực trên sắc đồ (tính từ lúc bơm mẫu đến khi xuất
hiện peak).
5
Tm là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ, nghĩa là tốc độ di chuyển của nó bằng
tốc độ di chuyển trung bình của dung môi, thời gian này được gọi là thời gian chết. tR càng lớn,
chất càng bị lưu giữ mạnh và tốc độ di chuyển của nó càng nhỏ. Hình: Sắc ký đồ của một
chất

c. Hiệu lực của cột: Hiệu lực của cột thường được đo bằng hai thông số: số đĩa lý thuyết
N và chiều cao đĩa lý thuyết H. Ta có thể coi như cột sắc khí được chia thành N lớp hay N tầng
mỏng, ở m
ỗi một lớp sự phân bố chất tan vào hai pha đạt trạng thái cân bằng. Những tầng mỏng
giả định này được gọi là địa lý thuyết. Nếu cột sắc khí có chiều dài là L thì: H = N/L. Cột có N
lớn là cột có hiệu lực cao.
6
d. Độ phân giải: Độ phân giải Rs là tỉ số khoảng cách giữa hai peak và độ rộng trung bình
của peak.
9 Rs = 0,75 hai pic tách không tốt, còn xen phủ nhau nhiều;
9 Rs = 1,0 hai pic tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%;
9 Rs = l,5 hai pic tách hoàn toàn (chi xen phủ 0,3%).
9
II.6) Các kỹ thuật sắc ký

II.6.1) Sắc ký giấy

Sắc ký giấy là một phương pháp phân tách dễ dàng các thành phần của một hỗn hợp (acid
amin). Trong sắc ký giấy, pha tĩnh là một tờ giấy bằng cellulose ( thí dụ như tờ giấy thấm, giấy
lọc trong phòng thí nghiệm). Các lọai giấy này có tính ái nước nên trên thực tế, pha tĩnh là một
lớp nước (H2O) thật mỏng đã được che phủ lên trên bề mặt của tờ giấy, chính vì thế sắc ký giấy
là lọai sắc ký phân chia. Pha động là chất lỏng( có thể là chất lỏng hay một hỗn hợp dung môi).
Phương pháp này thường được sử dụng để tách các chất ưa nước như amino acid, đường,
Trong giấy, cellulose có dạng sợi, các sợi này khi nằm cạnh nhau sẽ tạo thành mạng lưới với các
lỗ rỗng to. Khi ly giải, dung môi di chuyển dọc theo bề mặt sợi và các lỗ rỗng sẽ được phủ đầy
dung môi. Như thế, các chất tan bị phân tán nhiều trong lỗ rỗng khiến các vết sắc ký to hơn. Bột
giấy hấp thu nước, nước bị giữ lại trong cấu trúc glucopyranose bằng cầu nối hydrogen, vì thế
quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế phân chia.
nhau một cách tự nhiên, và một hệ thống mạng như thế chắc chắn có các lỗ hỗng. Khi dung môi
giải ly di chuyển (mang theo các chất tan, solute) dọc theo bề mặt của sợi, các lỗ rỗng này sẽ
được dịp phủ đầy dung môi, và các chất tan có dịp khuếch tán vào các lỗ rỗng này, khiến các
chất tan càng lúc càng to dần so với vết chấm tạo mức xuất phát ban đầ
u. Còn nếu sợi cellulose
được nén chặt quá dòng chảy sẽ rất khó di chuyển.

II.6.2) Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng là hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu
vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển
ngang qua một pha tĩnh là một chất trơ (thí dụ như: silicagel hay oxid alumin). Pha tĩnh được
tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên nền phẳng như tấ
m kiếng, tấm nhôm hay tấm plastic. Do
chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng.
¾ Bình sắc ký: Một chậu, hũ, lọ bằng thủy tinh,
hình dạng đa dạng, có nắp đậy.
¾ Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 nm của
một loại hợp chất hấp thu (silicagel, alumin, )
được tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên tấm
kiếng, t
ấm nhôm, hay tấm plastic. Chất hấp thu
trên nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bột hay
một lọai polymer hữu cơ.
¾ Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm
nhiều chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng
khoảng 1ul dung dịch mẫu với nồng độ pha
lõang 2-5%, nhờ một vi quản để chấm thành
một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phái trên
cao hơn một chút so với mặ

-Hiện hình các vết sau khi giải ly: Các hợp chất có màu sẽ được nhìn thấy bằng mắt thường,
nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên nếu muốn nhìn thấy các vết, cần sử
dụng phuơng pháp vật lý (Phát hiện bằng tia tử ngoại UV: đèn chiếu tia UV 254nm ánh sáng này
nhận ra các hợp chất có thể hấp thu tia UV, các hợp chất có màu tối sẫm trên nền sáng; đèn chiếu
tia UV 366nm ánh sàng này phát hiện nhữgn hợp chất có phát hùynh quang, các vết sẫm của chất
mẫu có màu sáng trên nền bản mỏ
ng sẫm màu) hay dùng phương pháp hóa học (Bằng cách dung
thuốc thử hiện hình như hơi iod, 2,7-fluorescein phát hiện đa số hợp chất hữu cơ, ninhydrin phát
hiện aminoacid hay amin, 2,4-dinitrophenylhydrazin phát hiện aldehyde hay caton, clorur
antimony phát hiện steroid hay vitamin hay carotenoid,…)
- Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính
bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:

Trong đó: a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính
bằng cm, b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên
cùng đường đi của vết, tính bằng cm.
Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l.
9

và một dung môi kém phân cực thí dụ như ete dầu hỏa: etyl acetate.
-Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột: dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng
trên giá, cho dung môi loại kém phân c
ực nhất vào khoảng 2/3 chiều cao
cột. Cho chất hấp thu dạng khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần
một lượng nhỏ, vừa cho vừa khỏ nhẹ vào thành cột. Khi lớp chất hấp thu
đạt được chiều cao khoảng 2cm trong cột, thì mở nhẹ khoá ở bên dưới
để cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để bên dưới
cột, dung môi này dẽ được rót lại lên đầu cột. Sau khi nạp xong, cho
dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần đến khi chất hấp thu trong cột
đồng nhất.
-Nạp mẫu: Mẫu ở dạng lỏng cho trực tiếp lên đầu cột sắc ký. Nếu mẫu ở
dạng rắn thì hoà tan mẫu chất vào trong một lượng nhỏ dung môi, loại
dung môi cho khởi đầu sắc ký.
Thực hiện nạp mẫu lên cột như sau:
10
+Mở khoá cho dung môi chảy ra khỏi cột để hạ mức dung môi trong cột xuống sao cho vừa sát
với mặ thoáng của chất hấp thu trong cột.
+Đóng khoá lại, nạp dung dịch mẫu vào đầu cột. Muốn nạp mẫu, sử dụng một pipet hút dung
dịch mẫu chất, đặt đầu pipet gần sát mặt thoáng cảu chất hấp thu trong cột, vừa bóp vừa rây pipet
dọc quanh thành cột cho dung dịch chảy ra theo thành trong của cột, chạm xuống bề mặt chất
hấp thu.
+mở khoá bên dưới cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm cho dung dịch mẫu được thấm hết vào
chất hấp thu trên đầu cột, cần canh chừng không cho chất hấp thu đầu cột bị khô.
+Dùng pipet cho một luợng nhỏ dung môi mới lên đầu cột, đồng thời dùng dung môi này để rửa
sạch ống mà dung dịch dính trên thành cột.
+Mở khoá cho dung môi chảy ra. Lặp laị vài lần giúp cho dung dịch mẫu thấm sâu vào chất hấp
thu, dung môi trong suốt không lây màu của chất mẫu.
+Sử dụng bông thủy tinh, bông gòn, cát hay giấy lọc đặt nhẹ lên mặt thoáng chất hấp thu để bảo
vệ mặt cột.

cột: mở khóa để hạ mức dung dịch đệm xuống vừa sát mức nhựa ở trên đầu cột, khóa lại. dùng
pipet hút và đặt dung dịch mẫu lên đầu cột, mở khóa cho dung dịch mẫu hút vào lớp nhựa ở trên
đầu cột. Để yên 10-20 phút để cho mẫu chất tiếp xúc cân bằng với nhựa.
11
-Khi tất cả mẫu đã được gắn lên đầu cột nhựa, cho vài ml dung dịch đệm ban đầu chảy qua, nối
cột với bình cung cấp dung dich giải ly.
-Giải ly bằng cách tắng dần nồng độ dung dịch giải ly: hỗn hợp mẫu đang gắn vào nhựa trao đổi
ion trong dung dịch đệm có nồng độ thấp. Để có thể tách mẫu chất ra khỏi nhựa thường, cần phải
gia tăng lực ion của dung dịch đệm bằng cách cho thêm NaCl. Khi có thêm NaCl trong dung
dịch đệm, ion của dung dịch đệm sẽ cạnh tranh với hỗn hợp mẫu chất, để giành lấy những nhóm
chức họat động cảu nhựa, đẩy hợp chất ra khỏi nhựa, rồi theo dòng chảy đi ra khỏi cột.
¾ Trong phương pháp sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích
nhất định, nhữ
ng hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với
chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến
trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích
dương. Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-
cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang
điện tích âm. Vì thế,
những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột.
Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân
tử protein tương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm
muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột
với các protein có điện tích dương, do đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích
ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích.

II.6.5) Sắc ký gel

Trong sắc ký gel, pha tĩnh là mạng polymer có lỗ rỗng và các lỗ rỗng này
được phủ đầy dung môi dùng làm pha động. Một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất có

nhất định. Các chất tan sẽ ra khỏi cột theo thứ tự TLPT giảm dần.
¾ Ứng dụng: kỹ thuật này dùng để tách các đại phân tử có nguồn gốc sinh học như: protein,
polysaccharide, acid nuleic, enzyme, Người ta ứng dụng vào việc đóan TLPT của một
hợp chấ
t chưa biết.
II.6.6) Sắc ký ái lực

Sắc ký ái lực hấp thụ phát hiện các ái lực sinh học mà một phân tử
sinh học có với một phân tử khác được cố định trên một pha ổn định. Có
nhiều phương pháp để rửa giải các phân tử ái lực vì có nhiều loại sắc ký ái lực
khác nhau, các bước theo gradient vẫn thường được sử dụng. Thường sử dụng
trên các hệ thống có áp suất thấp. Các giá thể (thường là agarose) thường chịu
được áp suất dưới 50psi.
Nhược điểm: đắt tiền, khó tẩy rửa, chọn lọc ligand (phối tử), gắn kết
ligand lên giá thể hoạt hóa thường gặp nhiều khó khăn.
Ưu điểm: phát triển phương pháp tinh sạch trên protein A (protein A
là antigen cho IgG), bước bắt giữ tốt, cho phép phân tách protein dạng
nguyên thủy còn họat tính với dạng biến tính. 13  Sử dụng sắc ký ái lực cho tương tác giữa kháng nguyên kháng thể: ta có thể tinh sạch
một kháng nguyên bằng chách cho mẫu đi qua cột có chứa giá thể liên kết với kháng thể
để thu nhận protein. Ngược lại, một giá thể có liên kết với một kháng nguyên chuyên biệt
sẽ bắt giữ kháng thể chuyên biệt cho kháng nguyên đó. Ứng dụng nhiều nhất là gắn kết
protein A vào gel để gắn kết với các globulin miễn dịch.
-
II.6.7) Sắc ký tương tác kỵ nước

khí phân bố.
Sử dụng phương pháp sắc ký khí có khả năng tách được
hoàn toàn những chất hữu cơ tương tự, ví dụ như o-; m-; p-xilen
không thể tách được bằng phương pháp chưng cất phân đoạn
nhưng tách được khá đơn giản bằng sắc ký khí, cũng như sử
dụng đề tách những hỗn hợp rất phức tạp như khí thải ô tô chứa
trên 300 hợp chất. Với việc ra đời của nhiều loại detector nhiều
phương pháp mới xuất hiện như: sắc ký khí - khối phổ (GS -
MS), sắc ký khí - hồng ngoại (GC - IR) đã làm tăng khả năng
phân tích của sắc ký khí.

¾ Máy sắc ký khí

Hình: Sơ đồ của một máy sắc ký khí 1. Khí mang
Khí mang là một khí trơ như nhờ, hen, ngon, hidro trong đó hai là khí mang phổ biến
nhất. Khí được chứa trong bom khí có gắn van giảm áp và đi
ều chỉnh. Khí mang cần có độ tinh
khiết cao và phải không tương tác với mẫu, chỉ mang mẫu đi qua cột: Tín hiệu đetectơ có phụ
thuộc vào sự khác nhau về tính chất giữa khí mang vàchất cần phân tích.
2. Bộ bơm mẫu
Thường dùng bơm tiêm đề bơm trực tiếp mẫu qua một vách polime silicon chịu nhiệt cao
vào cột hoặc vào phòng đun nóng mẫu để mẫu lỏng có thể bay hơi nhanh chóng. Yêu cầu cần
15
thiết là mẫu phải có đủ áp suất hơi để có thể được làm bay hơi trong phòng mẫu. Nhiệt độ phòng
mẫu có thể cao hơn nhiệt độ trong cột một chút để quá trình bay hơi được thực hiện dễ dàng.
3. Cột sắc ký
Cột được đặt trong lò có thể điều chỉnh nhiệt độ trong quá trình thực hiện. Cột thông

như
3
H hoặc
63
Ni, khí mang bị ion hoá tạo nên một "dòng nhất định" trong mạch
detector. Khi một chất phân tích hấp thụ electron được giải hấp nó sẽ làm giảm
dòng này, đặc biệt khi hợp chất có chứa nguyên tố có độ âm điện cao. Dòng sẽ
giảm đi, tạo ra tín hiệu ghi để. Detector đặc biệt nhạy cảm với những hợp chất
chứa halogen. Detector hấp thụ electron rất thuận lợi cho việc phân tích môi
trường. Độ nhạy cao, đạt tới 10-12g.
5. Thông tin GC
Sắc ký đồ thông thường biểu thị trên hai trục x và y, trong đó tín hiệu detector ghi trên
trục y và thời gian ghi trên trục x. Khi một hợp phần của mẫu được giải hấp và phát hiện nhờ
detector thì tín hiệu đó sẽ được ghi lại. Thời gian ghi được ở lúc tín hiệu là hàm của KD và vì thế
nó cung cấp thông tin định tính về mẫu giống như thế bán sóng trong cực phổ, và sẽ nhận biết
đượ
c một hợp phần trong mẫu. Thông tin định lượng từ sắc đồ được rút ra từ chỗ tín hiệu
detector là hàm của thời gian. Diện tích dưới lúc tỷ lệ với lượng chất phân tích. Lượng này có thể
biểu thị bằng đơn vị mol hoặc đơn vị khối lượng, tuy nhiên hằng số tỷ lệ sẽ khác nhau:
SA = diện tích dưới pic - R A
Trong đó R là diện tích trên một một khí A được biểu thị b
ằng một hoặc là diện
tích trên một gam khí A biểu thị bằng gam.
 Sắc ký khí ghép khối phổ (GC_MS: gas chromatography mass spectrometry):
Một trong những phương tiện hữu ích cho các nhà hóa học xác định cấu trúc hóa học của hợp
chất cần khảo sát là máy sắc ký khí ghép khối phổ. Dòng khí thoát ra khỏi máy sắc ký khí được
16
cho đi qua một khóa đễ vào ống, nơi mà có một lỗ phân tử và dẫn đến buồng ion hóa của máy
khối phổ.


dùng cho SEC đường rộng hơn và dài đến 100cm). Loại cột này có hiệu lực rất cao, có số (ra lý
thuyết lên đến 100.000 đĩa cho 1m chiều dài cột)
5) Detector
Là bộ phận phát hiện các chất khi chứng ra khỏi cột và ghi nhận các tín hiệu ghi trên sắc ký
đồ. Hiện đang sử dụng các loại detector sau:
Detector tử ngoại (UV): Dùng đèn thuỷ ngân cho vạch 254nm. Nhiều chất hấp thụ ở bước
sóng này.
Detector tử ngoại và khả kiến (UV-VIS): Dùng phổ quang kế lựa chọn bước sóng từ 195 đến
750 nm. Loại này hiện nay được dùng nhiều nhất.
Detector điện hoá và detector huỳnh quang có độ nhạy và độ chọn lọc cao dùng trong phân
tích vết. Dùng detector điện hoá có thể phát hiện được những lượng picrogam (10-12g)
 Các phương pháp sắc ký hiệu năng cao
a) Sắc ký phân bố hiệu năng cao
Gồm hai loại: Sắc khí lỏng - lỏng và sắc ký pha liên kết.
- Sắc ký lỏng - lỏng (LLC): Pha tĩnh là chất lỏng được bao trên bề mặt của các hạt chất mang,
tức là được hấp phụ trên chất mang.
- Sắc ký pha liên kết (BPC): Pha tĩnh được gắn hoá học với chất mang tạo ra liên kết siloxan nối
nhóm cơ - silic với silicagen.
b. Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao (sắc ký lỏng - rắn LSC)
Pha tĩnh là chất rắn mà trên bề mặt có chứa các nhóm hiđroxil phân cực, pha động là một dung
môi không phân cực.
c) Sắc ký trao đối ion hiệu năng cao (IEC)
Pha tĩnh rắn chứa các nhựa trao đổi lớn dưới dạng bột mịn, pha động thường là dung dịch nước.
d. Sắc ký lỏng hiệu năng cao trên gel (sốc ký loại cỡ SEC)
Phương pháp này được ứng dụng chủ yếu cho các chất có phân tử lượng lớn. Chất nhồi cho SEC
là những hạt xốp của silicagent hay các polyme có kích thước nhỏ ( 10 μm). Pha tĩnh là dung
môi nằm trong các lỗ xốp của hạt, pha động là dung môi chảy giữa các hạt. Ch
ỉ những phân từ
nhỏ mới khuếch tán vào lớp xốp, khi rửa giải các phân tử sẽ lần lượt ra theo cỡ từ lớn đến nhỏ.


+ GC: Thông dụng là FID, dùng cho phân tích các chất hữu cơ
19
III. KẾT LUẬN:
Sắc ký là một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực trên thế giới. Việt
Nam tiếp cận kỹ thuật này vào những năm của thập niên 80. Vì điều kiện cuộc sống ngày càng
cao, nên đòi hỏi phải có những công nghệ kỹ thuật hiện đại để đáp ứng nhu cầu. Bên cạnh đó
cũng có một số ít người, vì lợi nhuận cá nhân mà bất chấp tất cả. Ngày nay, để kiểm soát kiểm
tra tình hình chất lượng hàng hoá để đáp ứng nhu cầu cuộc sống như: thực phẩm, dược phẩm,
hoá chất… Vì thế kỹ thuật sắc ký càng có vai trò lớn trong công tác kiểm tra, giám sát chất lượng
mà kỹ thuật này hoàn toàn đảm đương được nhưng yêu cầu trên. Ví dụ như: kiểm tra dư lượng
kháng sinh (nitrofuran, tetracycline…) trong thuỷ sản, kiểm tra dư lượng hoocmon (clenbuterol,
salbutamol…) kích thích tăng trưởng, tạo nạc cho gia súc, kiểm tra dư lượng màu đã bị cấm có
trong thực phẩm và mỹ phẩm như: Sudan có trong trứng gia cầm và trong son môi, 3 MCPD
(3_monoclo_propan_1,2_diol) có trong nước tương, formone có trong bánh phở, xác định một số
phương pháp chế biến bảo quản nhằm loại trừ sự phát triển của các nấm mốc gây độc (có độc tố
Aflatoxin) trong các lô hàng nông sản dự trữ và xuất khẩu đặc biệt đậu tương và lạc …Trong
công nghiệp dược phẩm, sơn: Kiểm tra hàm lượng hoạt chất chính trong dược phẩm, dư luợng
chất có thể gây độc hại… Ngoài ra còn ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như quan trắc, môi
trường… Vì vậy, với từng mục đích sử dụng mà ta có thể chọn một phương pháp sắc ký phù
hợp để phân tích mẫu tương ứng.

IV) TÀI LIỆU THAM KHẢO

1) Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương pháp cô lập chất hữu cơ, NXB ĐHQGTPHCM, 2007,
Trang 151-451.
2) Trần Nhật Phương, Học phần kỹ thuật Công Nghệ Sinh Học- Proteomic/Sắc ký, 2008,
12trang.