Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Trờng đại học quốc gia
đại học khoa học tự nhiên
khoa sinh học
PCR
(Polymerase chain reaction)
(Tiểu luận Sinh học phân tử)
Sinh viên: Nguyễn Đức Nhự
Lớp K6-CNTNSH
Giảng viên hớc dẫn:
PGS.TS
Đỗ Ngọc Liên
1
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Hµ néi, N¨m 2004
2
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
PCR
(Polymerase chain reaction)
I. Những kiến thức cơ bản về PCR.

PCR là từ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction trong tiếng Anh.
Có nhiều cách dịch cho cụm từ này. Có sách dịch là phản ứng tổng hợp dây chuyền
nhờ Polymerase, có tài liệu dịch là phản ứng chuỗi trùng hợp, hay đơn giản là kỹ
thuật PCR. ở đây chúng ta sẽ dùng đơn giản là kỹ thuật PCR.
Kỹ thuật này do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào giữa thập niên 80
của thế kỷ hai mơi đã đa lại một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử. Từ
đó đến nay, nó đã đợc sử dụng rộng rãi và trở thành phần không thể thiếu trong các
hầu hết các phòng thí nghiệm sinh học phân tử.
Kary Mullis nhận giải thởng Nobel năm 1993 về phát minh PCR
Kary Mullis đã viết trong tạp chí khoa học Mỹ: Bắt đầu bằng một phân tử

chính xác. Mặt khác sự phân tích thành phần và trật tự nucleotide trên phân tử
ADN trong hệ gen có giá trị rất lơn trong phân loại các loài sinh vật. Chính nhờ
tính thực tiễn to lớn đó mà tác giả của PCR, Kary Mullis đã đợc tặng giải thởng
Nobel năm 1993.
III. Cơ sở khoa học (nguyên lý) của kỹ thuật PCR:

PCR là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của
quá trình sao chép AND với sự tham gia của một loại enzyme AND polymerase
chịu nhiệt, có hai đoạn ngắn AND, một sợi làm mồi (primers) và dùng các đoạn
AND mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với nó. Vì vậy khởi
đầu quá trình tổng hợp AND cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotide (có độ dài từ
4
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
3-60 nucleotide). Đoạn này gắn kết với and khuôn tại điểm khởi đầu sao chép.
Đó là đặc điểm quan trọng đầu tiên của PCR vì ADN polymerase đợc điều khiển
để tổng hợp một đoạn ADN đặc thù. Quá trình này đợc enzyme adn polymerase
điều khiển để tổng hợp nên một sợi ADNđặc thù. Các sợi ADN mạch đơn làm
khuôn đợc tạo ra theo cách đơn giản là nâng nhiệt độ lên trên 90 độ C mà thờng là
94 độ C cho chuỗi xoắn kép ADN bung ra.
Cả hai sợi ADN đều đợc dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các
đoạn mồi (primer) đợc cung cấp để bám vào vị trí tơng ứng cho cả hai sợi. Trong
kỹ thuật PCR, các đoạn mồi đợc chọn nằm ở hai đầu đoạn ADN cần nhân lên sao
cho các sợi ADN tổng hợp mới đợc bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía
đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài nằm giữa hai đoạn mồi này.
Độ dài của sản phẩm PCR có thể từ vài trăm đến hàng ngàn, thậm chí hàng chục
ngàn cặp nucleotide. Nh vậy, sau mỗi chu kỳ, các điểm bám cho các đoạn mồi lại
xuất hiện cho mỗi ADN mới đợc tổng hợp . Hỗn hợp phản ứng lại đợc nâng nhiệt
độ lên thích hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này
sau đó đợc dùng làm khuôn cho chu kỳ tiếp theo, bao gồm các bớc: gắn mồi, tổng
hợp ADN và tách rời các đoạn.

và nớc tinh khiết rất cần thiết để
tiến hành kỹ thuật PCR.
Dung tích cho một phản ứng PCR thông thờng là 50 à hoặc 20 à .
Chu trình thực hiện
Để thực hiện phản ứng, chúng ta không chỉ đơn giản là cho tất cả nguyên liệu
vào ống nghiệm rồi đun nóng. Đây là một chu trình khép kín, gồm ba bớc cơ bản:
(3 bớc điều chỉnh nhiệt độ ) cho một chu kỳ:
1. Bung liên kết của ADN (denuteration):
Mục đích của việc này là làm biến tính ADN, khiến hai sợi ADN tách nhau ra.
Do đó, các đoạn mồi có thể gắn vào phần bổ sung trên ADN ở bớc sau. Cũng trong
bớc này, các phản ứng enzym đều ngừng lại (ví dụ nh sự mở rộng của chu trình tr-
ớc).
6
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Đợc thực hiện ở nhiệt độ khoảng 94
0
trong vài giây đến vài phút. Tại nhiệt độ
này, các phân tử ADN mạch kép sẽ bị tách ra hoàn toàn tạo nên các sợi đơn dùng
để làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào và enzyme polymerase xúc tác tổng hợp.
2. Mồi bám ( hay còn gọi là ủ với mồi) (annealing):
Ngay lập tức nhiệt độ đợc hạ xuống 54
0
C để các đoạn mồi gắn với các trình tự
bổ xung tơng ứng trên các phân tử ADN làm khuôn.
Các đoạn mồi dịch chuyển lộn xộn dới chuyển động Brao (Brown). Liên kết
ion giữa các đoạn mồi đơn và các sợi khuôn đơn liên tục đợc tạo ra rồi lại đứt gãy.
Các liên kết bền vững hơn (do những mồi gắn đúng vào vị trí) kéo dài lâu hơn.
Trên những đoạn ngắn ADN mạch kép bao gồm khuôn và mồi này, ADN
polymerase có thể gắn vào và bắt đầu kéo dài chuỗi. Sau khi đã có một vài bazơ đ-
ợc gắn vào, liên kết hyđro giữa mạch khuôn và mồi trở nên đủ mạnh để nó không

độ đợc hạ xuống 4
0
C để bảo quản sản phẩm.
Hình ảnh minh hoạ các bớc của phản ứng PCR nh sau:
Sản phẩm của phản ứng PCR là đoạn ADN mà ta cần nhân lên. Sản phẩm đợc
kiểm tra bằng cách chạy điện di trên thạch Agarose nồng độ 0,8%-2%, và ADN
8
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
của PCR sẽ đợc nhìn thấy rõ hơn dới tác dụng của tia cực tím (ultra-violet) sau khi
đực nhuộm bằng Ethidium Bromide, một loại hoá chất có khả năng bám và làm
hiển thị ADN. Độ dài của ADN sản phẩm đợc tính bằng cách so sánh với chỉ thị
ADN (ADN marker), sử dụng thông dụng nhất là ADN của thực khuẩn thể Lamda
cắt bằng enzyme giới hạn Hindlll.
V- Phản ứng RT-PCR (PCR ngợc)
* Nguyên lý:
Phản ứng RT-PCR thực chất là phản ứng nhân một đoạn giới hạn của
khuôn ARN theo nguyên lý của phản ứng PCR, bao gồm hai giai đoạn: Giai đoạn
thứ nhất là chuyển đổi một sợi ARN làm khuôn thành ADN hai sợi, sau đó qua
giai đoạn thứ hai, dùng ADN hai sợi này tiếp tục làm khuôn để thực hiện phản ứng
PCR nh đã giới thiệu.
ARN là một sợi bao gồm 4 nucleotide liên kết vơi nhau, trong đó có Adenin,
Guanin, Cystosin và Uracin. Chuỗi nucleotide này phải đợc chuyển đổi thành AND
2 sợi mà thành phần Uracin đợc thay thế bằng Thymin. Phản ứng làm biến đổi
ARN hệ gen thành AND phải nhờ đến vai trò của một loại enzyme gọi là enzyme
sao chép ngợc (Reverse Transcriptase), do vậy giai đoạn này đợc gọi là chuyển ng-
ợc (RT), đợc thực hiện ở nhiệt độ 50-55 độ C trong 30 phút. Khi đã có ADN 2 sợi
làm khuôn chuyển đổi từ ARN ban đầu, phản ứng tiếp theo là PCR nh đã giới thiệu
và đợc thực hiện theo 3 bớc thay đổi nhiệt độ cho phù hợp ở mỗi chu kỳ. Toàn bộ
phản ứng nhân một đoạn ADN từ khuôn ARN qua hai giai đoạn nói trên đợc gọi là
phản ứng RT-PCR hay phản ứng PCR ngợc.

Trớc khi sản phẩm PCR đợc đem sử dụng, ngời ta cần phải kiểm tra:
1. Sản phẩm có đợc hình thành hay không:
Cho dù hoá sinh có là ngành khoa học chính xác đến đâu đi nữa, ngời ta cũng
không thể chắc chắn rằng mọi phản ứng PCR đều thành công. Chất lợng của ADN
có thể quá tồi, do đó một trong các đoạn mồi có thể không phù hợp, hoặc cũng có
thể có quá nhiều điểm bắt đầu.
2. Kích thớc của sản phẩm có đúng không:
Có khả năng sản phẩm chỉ dài 500 bazơ, mà trên thực tế gen cần khuếch đại
lại dài 1800 bazơ. Khi đó, một trong hai mồi có thể đã gắn (phù hợp) với phần nào
đó trên gen mà gần với mồi còn lại hơn. Cũng có thể cả hai mồi đã gắn vào một
gen hoàn toàn khác.
Kết quả của PCR đợc kiểm tra thông qua băng điện di. Ngời ta thờng sử dụng
phơng pháp điện di trên gel agarose. Nếu không có sản phẩm nào đợc tạo ra, trên
băng điện di sẽ không có vạch nào. Nếu có các sản phẩm khuếch đại không mong
muốn, chúng ta sẽ thu đợc băng điện di có nhiều vạch.
10
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Xem trên băng điện di:
Cột ở bên trái là hỗn hợp các đoạn đã biết kích thớc để so sánh. Chú ý rằng
khoảng cách giữa các đoạn trên cột là cấp số mũ.
Cột 1: đoạn PCR dài khoảng 1850 bazơ.
Cột 2 và 4: các đoạn dài khoảng 800 bazơ.
Cột 3: không có sản phẩm nào đợc tạo thành, cho thấy PCR đã thất bại.
Cột 5: nhiều vạch đợc tạo ra do một trong những đoạn mồi đã gắn sai chỗ.
Kết quả cuối cùng có thể đợc kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrolamide,
các đoạn gen có độ dài khác nhau hiện rõ có thể đọc đợc bằng mắt thờng nhờ
so sánh với thang chuẩn.
11
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
VII. Các chỉ tiêu ảnh hởng đến phản ứng PCR

Taq ADN polymerase không đặc hiệu cho bất kỳ một loại phân tử ADN
riêng biệt nào, chính vì vậy tất cả các phản ứng PCR sử dụng mồi và khuôn khác
nhau đều sử dụng Taq ADN polymerase. Mặt khác một số điểm quan trọng của
Taq- ADN polymerase là có khả năng gắn thêm vào đầu 3 một base là Adenine
(A). Đây là một điểm quan trọng để trong quá trình đồng hóa ngời ta lợi dụng đặc
tính này để gắn sản phẩm của PCR vào plasmide trong quá trình đồng hoá.
Một nhợc điểm của Taq- ADN polymerase là: loại enzyme này chỉ có khả
năng tổng hợp các loại ADN có độ dài dới 3kb (dới 3000 nucleotide), do vậy muốn
nhân bản ADN có độ dài hơn 3-20 kb phải cần những đoạn enzyme khác.
Một nhợc điểm khác của Taq- ADN polymerase là không có khả năng sửa
chữa những sai sót xảy ra trong quá trình sao chép ( trong quá trình sao chép các
base nitơ ở trên mạch đơn đợc tổng hợp, có thể xảy ra sự thay đổi một vài base
nitơ, Taq- ADN polymerase không có khả năng sửa chữa sự nhầm lẫn trong trờng
hợp này).
Ngày nay nhiều polymerase chịu nhiệt khác đã đực đa ra thị trờng với nhiều
chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn. Tth polymerase, một enzyme tách chiết
từ vi khuẩn Thermus thermophilus có khả năng hoạt động nh một enzyme phiên
mã ngợc khi có mặt ARN khuôn và ion Mg
++
; nhng với sự hiện diện của ADN
13
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
khuôn và ion Mg
++
, Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch đại ADN. Enyme này cho
phép khuếch đại bản mẫu là ARN thông qua sự hình thành cADN.
3. Mồi và nhiệt độ lai
3.1. Chiều dài mồi
Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt đợc một sự nhân bản đặc trng và hiệu quả
cao nhằm thu nhận sản phẩm PCR chất lợng cao trên khuôn ADN biết trớc.

oligonucleotide dài hơn 17 bazơ với trình tự đích của nó là một quá trình thực sự
đặc hiệu, đặc hiệu hơn cả sự đặc hiệu của kháng thể với kháng nguyên. Vì vậy một
đoạn mồi dài 17 bazơ hay hơn thờng đợc dùng để khuếch đại từ ADN thuộc hệ gen
của thực vật và động vật. Mồi quá dài có thể đồng nghĩa với việc ngay cả nhiệt độ
gắn mồi cao cũng không ngăn ngừa đợc sự bắt cặp sai và gắn mồi không đặc hiệu.
3.2. Một số nguyên tắc thiết kế trình tự mồi (theo Innis và GelfDNA, 1991).
i. Mồi nên dài 17 - 28 bazơ.
ii. Thành phần của các bazơ nên có 50 - 60% (G+C).
iii. Mồi nên có đầu 3 ở G hay C hay CG hay GC; điều này ngăn ngừa việc thở
(breathing) của các đầu và tăng hiệu suất gắn mồi.
iv. Nhiệt độ Tm tốt nhất là nằm trong khoảng 55 - 80
o
C.
v .Việc sử dụng mồi có nhiều hơn 3 G hay C ở đầu 3 có thể làm tăng khả năng
bắt cặp sai ở những trình tự giàu G hay C (do sự ổn định của việc gắn mồi), nên
tránh điều này.
vi . Các đầu 3 của các mồi không nên bổ sung cho nhau (cụ thể hơn là không
nên bắt cặp bazơ với nhau), nếu không thì các dimer mồi sẽ đợc tổng hợp nhiều
hơn là các sản phẩm khác.
vii. Nên tránh dùng các mồi có thể tự bổ sung cho nhau (nghĩa là khả năng hình
thành cấu trúc 2
o
nh cái thòng lọng).
6.5 Dung dịch đệm cho phản ứng.
Dung dịch đệm thờng chứa:
+ Tris-HCl pH 8,3 10-50mM.
+ KCl không quá 50 mM; MgCl
2
1,5 mM hay cao hơn.
+ Mồi 0.2 - 1àM đối với mỗi mồi.

++
là thành phần không thể thiếu đợc của phản ứng PCR. Tuy
nhiên không có một qui luật chung cho vấn đề này. Nồng độ tối u phải đợc xác
định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm.
Một số enzyme không cần protein bổ sung, trong khi số khác lại phụ thuộc
vào chúng. Một vài enzyme hoạt động tốt hơn rõ rệt khi có mặt chất tẩy
(detergent), có thể bởi vì chất tẩy ngăn cản xu hớng tự nhiên là co cụm lại của
enzyme.
Nồng độ mồi không nên vợt quá 1àM trừ phi mức độ thoái hoá cao; 0,2àM là
đủ đối với các mồi tơng đồng.
Nồng độ nucleotide không cần nhiều hơn 50àM đối với mỗi loại; tuy nhiên
các sản phẩm dài có thể cần nồng độ cao hơn.
5. Thành phần dNDP
Bốn loại nucleotide trong phản ứng PCR thờng đợc sử dụng ở dạng
deoxynucleotide (dNTPs bao gồm dATP; dGTP; dCTP và dTTP). Thờng đợc sử
dụng ở nồng độ 20-200 àM / mỗi loại nucleotide. Nồng độ cao hơn hay thấp hơn
dễ dẫn đến sự tạo nên sản phẩm PCR giả. Sự mất cân bằng trong thành phần các
nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của enzyme ADN polymerase.
16
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
6. Thời gian
6.1. Thời gian và nhiệt độ biến tính:
Hai trình tự bổ sung liên kết với nhau bởi liên kết hydro giữa các bazơ bổ
sung của chúng (G với C và A với T hay U), hình thành phân tử mạch kép ổn định.
Phản ứng PCR cần các sợi ADN mạch đơn làm khuôn, do đó nếu ADN khuôn ban
đầu không phải là dạng sợi đơn, nh hầu hết các virus ARN, thì cần phải làm nóng
17
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
nó đến trên nhiệt độ nóng chảy (melting temperature) của dạng sợi kép hoặc
nhiệt độ nóng chảy của một phần dạng sợi kép. Rồi sau đó làm lạnh nhanh nó.

tính, vừa giảm thời gian biến tính: Innis và GelfDNA (1990) đã đề xuất thời gian là
15 giây khi nhiệt độ là 96
o
C.
6.2 Thời gian gắn mồi và việc thiết kế mồi.

Chiều dài và trình tự mồi là một tham số có ý nghĩa vô cùng quan trọng đảm
bảo sự thành công của quá trình khuếch đại. Nhiệt độ nóng chảy của một acide
nucleic mạch kép tăng lên theo chiều dài của nó cũng nh là số lợng (G+C). Công
thức đơn giản để tính nhiệt độ nóng chảy (temperature melting-Tm) của một đoạn
DNA kép là:
Tm (
o
C) = 4(G + C) + 2(A + T)
18