- 1 -
1/ Đặ t v ấ n đề :
Di truyền học phân phân tử nghiên cứu cấu trúc các gen và sự vận
hành các sản phẩm của chúng trong một tế bào. Lãnh vực này không
ngừng được phát triển là nhờ kỹ thuật liên quan đến sự thao tác ADN,
ARN và protein thay đổi mau lẹ và mạnh mẽ mà các kỹ thuật đó ngày nay
được gọi là công nghệ gen hay công nghệ tái tổ hợp ADN.
Công nghệ tái tổ hợp ADN là những kỹ thuật tách và tái tổ hợp lại
các gen invitro. ADN tái tổ hợp là phân tử ADN lai từ ADN của hai loài
khác nhau. Ví dụ một gen cần nghiên cứu được gắn vào ADN của virus
tạo ADN tái tổ hợp. Quá trình tách gen cần nghiên cứu, sử dụng rồi gắn
vào ADN khác (như ADN virus, ADN plasmid…) tạo ra ADN tái tổ hợp rồi
chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào cần thiết là các kỹ thuật cơ bản củ
công nghệ tái tổ hợp ADN.
Các enzym cắt hạn chế RE và các vector là các công cụ sử dụng
trong công nghệ tái tổ hợp ADN. Đề tài: “ Vai trò của enzyme
restriction và plasmid trong ứng dụng của sinh học phân tử”
giúp người viết hiểu hơn về vai trò của sinh học phân tử trong nhiều lónh
vực khoa học.
2/ Đối tượng và phạm vi nghiên cứu :
Đối tượng nghiên cứu: là vi khuẩn, nấm, thực vật, động vật và các
enzym.
Phạm vi nghiên cứu: chỉ tập trung nghiên cứu vai trò của enzyme
restriction và plasmid thông qua kỹ thuật tái tổ hợp ADN.
3/ Phương pháp nghiên cứu:
Phương pháp nghiên cứu đề tài là phương pháp tổng hợp các tài liệu
được lấy từ các nguồn thông tin như thư viện, báo đài, internet. Dựa vào sự
phân tích, tổng hợp, so sánh, đối chiếu các tài liệu để thực hiện đề tài.
Mặc dù đề tài được chuẩn bò khá công phu, nhưng chắc chắn vẫn còn
sơ suất, rất mong được sự góp ý của q thầy hướng dẫn và các bạn đồng
nghiệp. Tác giả chân thành biết ơn.

I.CÁC ENZYME HẠN CHẾ:
Kỹ thuật tái tổ hợp ADN sử dụng hàng loạt các công cụ phân tử, đó là
các enzym nuclease, ADN-polymerase, ligase, reverse transcriptase,
terminal transferase, trong đó vai trò hàng đầu là các enzyme restriction.
Vào năm 1962, V.Arber lần đầu tiên chứng minh rằng có những
enzyme đặc biệt hoạt động trong tế bào vi khuẩn, chúng có khả năng phân
biệt ADN của mình với ADN lạ của phage. Các enzym này hạn chế khả
năng sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩn bằng cách phân hủy chúng
một cách đặc hiệu do đó gọi theo tiếng Anh là Restriction enzyme. Chữ
restriction có nghóa là hạn chế có nguồn gốc lòch sử từ đó và được dùng
đến nay.
Các enzyme phân cắt ADN được gọi là nuclease gồm 2 loại là
exonuclease và endonuclease. Exonuclease cắt ADN từ 2 đầu mút, còn
endonuclease cắt ADN ở giữa phân tử. Các restriction enzyme cắt phân tử
AND ở giữa một cách đặc hiệu nên được gọi là restriction endonuclease.
Năm 1970, H.Smith và các cộng tác viên đã tách được restriction
endonuclease đầu tiên từ vi khuẩn Haemophilus influenzae Rd được gọi là
HindII. Các enzyme restriction endonuclease nằm trong hệ thống chuyên
biệt hạn chế- biến đổi ( restrictio-modification system) để bảo vệ tế bào
khỏi sự xâm nhập của ADN lạ.
Các restriction enzyme nhận biết ADN mạch kép ở những trình tự
nhất đònh thường được gọi là điểm nhận biết (recognition sites) và cắt
ADN ở ngay điểm này hay kế cận. Các điểm nhận biết này thường có
trình tự 4-8 cặp nucleotide đối xứng đảo ngược nhau, được gọi là các
palyndrom. Sự cắt ADN như vậy có thể tạo đầu tù hay đầu bằng (HpaI)
hoặc đầu dính (BamHI) phụ thuộc vào cơ chế cắt của enzyme. Đầu dính
đặc biệt được sử dụng trong cấu trúc phân tử ADN lai hay khảm.
Ngày nay hơn 500 loại restriction endonuclease đã được phát hiện,
chúng có khả năng cắt ADN tổng cộng với hơn 120 trình tự nhận biết khác
nhau. Hàng trăm loại restriction endonuclease được bán ở thò trường. Mỗi

« Đầu dính » « Đầu dính »
---G-A-A-T-T-C~~~~~~G-G-A-T-C-C---
---C-T-T-A-A-G~~~~~~G-T-T-A-A-G---
- 5 -
Đoạn ADN lạ xen giữa
Tính chất quan trọng này được sử dụng để cắt và ghép các gen.
Các enzyme endonucleaza hạn chế và những đoạn cắt của chúng
Enzyme hạn chế Các đoạn cắt Có nguồn gốc từ vi khuẩn
Bam III G G A T C C
C C T A G G
Bacillus amylolique faciens H
Bgl II A G A T C T
T C T A G A
Bacillus globigi
Hind III A A G C T T
T T C G A A
Haemophilus influenzeae R
d
Eco RII C C T G G
G G A C C
Escherichia coli R245
Hpa I G T T A A C
C A A T T G
Haemophilus parainfluenzea
Hha I G C G C
C G C G
Haemophilus haemolyticus
Taq I T C G A
A G C T
Thermus aquaticus YTI

này được vào quá trình phiên mã ngược nhờ sử dụng enzyme phiên mã
ngược reverse transcriptase. Enzyme gọi đúng nghóa là ADN-polymerase
phụ thuuộc ARN (ARN- dependent ADN-polymerase). Enzym có khả
năng tổng hợp nên ADN một mạch là c-ADN (complementary ADN) từ
khuôn mARN hoặc từ một đoạn polyribonucleotide tổng hợp hóa học. Nhờ
enzyme này có thể tổng hợp hầu như bất cứ gen riêng biệt nào miễn có
mặt mARN của gen đó.
III.CÁC VECTOR CHUYỂN GEN:
Vật chuyển gen là phân tử ADN có khả năng tự tái sinh, tồn tại độc
lập trong tế bào và mang được đoạn gen cần thiết . Các vật chuyển gen
phải thỏa mãn các yêu cấu tối thiểu :
*Có các trình tự xuất phát sao chép (ori) để có thể tồn tại độc lập.
*Có các trình tự nhận biết (ricognition site) mà các restriction
endonuclease nhận biết để cắt.
- 7 -
*Các trình tự điều hòa tạo thuận lợi cho sự phiên mã gen lạ.
*Đảm bảo sự di truyền bền vững của ADN tái tổ hợp ở dạng độc lập
hay gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ.
*Có các gen đánh dấu để dễ phát hiện vector hoặc các gen gắn vào.
1.Các vector chuyển gen plasmid :
a.Vector pBR322.
Các vector thông dụng được sử dụng với E.coli trước tiên phải kể
đến là pBR322 (chữ p là chữ viết tắt của cụm từ plasmid ; BR là tên viết
tắt của hai nhà khoa học ở phòng thí nghiệm đầu tiên tìm ra vector này là :
F.Bolivar và R.Rodrigues ; 322 là danh số của plasmid này để phân biệt
với các plasmid khác trong khi nghiên cứu cũng do phòng thí nghiệm này
tìm ra như pBR325, pBR327...).
Plasmid có kích thước nhỏ hơn 10kb nên dễ loại trừ vấn đề ADN bò
gãy khi làm sạch : pBR322 có 4361 cặp base. Kích thước đó nói lên rằng,
không chỉ vector có thể làm sạch một cách dễ dàng mà còn có thể cả phân

dòng mới hay những vò trí chọn dòng bên ngoài. Ngược lại, vector pATI 53
đã được cấu trúc bởi sự tách ra một đoạn 700 đôi base của pBR322, trong
đó có cả gen amp
R
và tet
R
nhưng làm thay đổi sự tái bản và tiếp tục tạo ra
plasmid. pATI 53 khác với pBR322 ở hai phương diện:
- pARI 53 có số lượng bản sao cao hơn pBR322, thường có mặt
khoảng 30-45 phân tử trên một E.coli. Với số lượng copy này thì dễ dàng
được phát hiện khi nghiên cứu hiệu quả của gen được chọn dòng trong tế
bào chủ.
- pARI 53 là một plasmid không liên tục, không trực tiếp vận
chuyển được tới tế bào E.coli khác do sự phát đi 700 đôi base đã làm phá
hủy khả năng liên tục của pBR322. Điều này quan trọng đối với sự kiềm
chế sinh học để tránh đi khả năng làm tẩu thoát phân tử pATK- 53 tái tổ
hợp từ trong các ống nghiệm.
d.Vector pUC8-sự chọn dòng gen lacZ.
Vector pUC8 đã được dẫn ra từ pBR322, mặc dù trong trường hợp
này sự tái bản và gen amp
R
vẫn còn nguyên vẹn. Một đoạn nucleotide của
gen này đã bò thay đổi. Tất cả những vò trí chọn dòng bây giờ đã được tụ
tập lại trong một đoạn ngắn của gen lacz
1
. Sự chọn dòng bằng gen lacz
1