i Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dƣới sự hƣớng
dẫn của PGS. TS và PGS. TS . Các số liệu trình
bày trong luận án là trung thực.
Một số kết quả đã đƣợc công bố riêng hoặc đồng tác giả, phần còn lại chƣa
đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận án này!
0 03 năm 2014
Hoàng Phú Hiệp
ii
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. VI KHUẨN E. COLI O157:H7 3
1.1.1. Đặc điểm chung của chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 3
1.1.2. Độc tố Shiga-like toxin: Bản chất và tác hại 7
1.1.3. Nguyên nhân và diễn biến khi ngộ độc 11
1.1.4. Tình hình ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn ở Việt Nam 13
1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN
E. COLI O157:H7 14
1.2.1. Phƣơng pháp PCR dựa trên DNA 14
1.2.2. Kỹ thuật LAMP 18
1.2.3. Sử dụng kháng thể tái tổ hợp trong phát hiện E. coli O157:H7 19
1.3. KHÁNG THỂ 23
1.3.1. Mảnh kháng thể 25
1.3.2. Kháng thể tái tổ hợp 26
1.3.3. Kỹ thuật phage display 27
1.3.4. Tình hình nghiên cứu sử dụng kháng thể ở Việt Nam 32
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35
2.1. Vật liệu nghiên cứu 35
2.1.1. Sinh phẩm 35
iv
2.1.2. Hóa chất 35
2.1.3. Các cặp mồi đƣợc sử dụng 36
2.2. Thiết bị 36
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 37
2.3.1. P ứu DNA 37
2.3.2. Kỹ thuật bộc lộ trên thực khuẩn thể (phage display) 43
2.3.3. ứu protein 45
3.4.4. ạt nano 91
93
94
95
PHỤ LỤC 108
vi
THUẬT NGỮ VIẾT TẮT
STT
Ký hiệu
Tên đầy đủ
1
Amp
Ampicillin
2
bp
Base pair
3
CDC
Centers for Disease Control and Prevention- Trung tâm Kiểm
soát và Phòng chống Dịch bệnh Mỹ
4
CDR
Food and Drug Administration
15
HRP
Horseradish peroxidase
16
HC
Hemorrhagic Colitis- Viêm đại tràng xuất huyết
17
HUS
Hemolytic Uremic Syndrome- Hội chứng dung huyết và suy thận
18
IPTG
Isopropyl-
-D-Thiogalactopyranoside
19
Kana
Kanamycin
20
Kb
Kilo base pair
21
kDa
Kilo Dalton
22
LAMP
Loop-mediated Isothermal Amplification
23
LB
Lauria Bertani
34
TE
Tris – EDTA
35
TEMED
N, N, N’, N’- Tetramethyl ethylenediamine
36
v/p
Vòng/phút
37
V
H
Variable heavy - Vùng biến đổi chuỗi nặng
38
V
L
Variable light - Vùng biến đổi chuỗi nhẹ
iv
vii
Số hiệu
56
3.2
Kết quả so sánh trình tự gen Stx1 với các trình tự gen Stx1 từ
GenBank
61
3.3
Kết quả so sánh trình tự gen Stx2 với các trình tự gen Stx2 từ
GenBank
62
3.4
Kết quả của phản ứng ELISA xác định độ nhạy của kháng thể tái
tổ hợp và kháng thể chuẩn
90
v
viii Số hiệu
hình
Tên hình
Trang
1.1
Hình ảnh vi khuẩn E. coli O157:H7 trên kính hiển vi điện tử
03
1.2
Hình ảnh vi khuẩn E. coli O157:H7 trên môi trƣờng có MUG
04
3.5
Hình ảnh điện di kiểm tra DNA plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI
55
3.6
Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ giữa E. coli O157:H7 với chủng
khác đƣợc xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự gen 16S RNA của chủng
E. coli O157:H7 nghiên cứu (mã số HQ658163) và các chủng khác trên
Ngân hàng Gen Quốc tế
57
3.7
Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Stx1 và Stx2
58
3.8
Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Stx1 với cặp mồi vector pJET
59
3.9
Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Stx2 với cặp mồi vector pJET
60
3.10
Vị trí và trình tự cặp mồi FIP/BIP
64
3.11
Hình ảnh điện di tách chiết DNA tổng số
64
3.12
Hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng LAMP
65
3.13
Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP xác định hàm lƣợng DNA
66
3.21
Hình ảnh điện di sản phẩ
80
3.22
Thiết kế vector pET28a-TRX biểu hiện gen mã hóa kháng thể
81
3.23
-PAGE
82
3.24
-
kháng thể tái tổ hợp
83
3.25
Khảo sát nhiệt độ biểu hiện của kháng thể tái tổ hợp
84
3.26
Hình ảnh điệ - ủa kháng thể tái tổ
hợp
86
3.27
Hình ảnh kết quả điện di SDS-PAGE quá trình tinh sạch protein tái tổ
hợp bằng phƣơng pháp Hybrid
87
3.28
Hình ảnh điện di kết quả phản ứng Western blot của kháng thể tái tổ hợ
-tag
88
3.29
Hình ảnh kết quả phản ứng Dot blot của kháng thể tái tổ hợp với kháng
khoảng 70 nghìn ngƣời mắc bệnh liên quan đến E. coli O157:H7 [106].
Ở Việt Nam, theo thống kê của Cục Vệ sinh An toàn Thực phẩm, năm 2010 có
175 vụ ngộ độc với 5664 ngƣời mắc, trong đó có 3978 ngƣời phải nhập viện và 51
ngƣời tử vong. Năm 2011 có 148 vụ ngộ độc, trong đó có 4700 ngƣời mắc với 3663
ngƣời phải nhập viện và 27 ngƣời tử vong. Năm 2012 có 168 vụ ngộ độc, trong đó có
5541 ngƣời mắc với 4335 ngƣời nhập viện và 34 ngƣời tử vong. Nhƣ vậy, trong ba
năm liên tiếp có 491 vụ ngộ độc với 112 ngƣời tử vong. Trong năm 2013 nƣớc ta xảy
ra nhiều vụ ngộ độc nghiêm trọng nhất là những tháng cuối năm. Số liệu thống kê
trong quý III năm 2013 cho thấy, trong 40 vụ ngộ độc thực phẩm thì 23 vụ do vi sinh
vật gây ra. Chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 đƣợc xác định lần đầu tiên ở Việt Nam
2
vào năm 2005 [63], tiếp đó đã có những nghiên cứu về E. coli O157:H7 [7], [9], [92].
Trong các vụ dịch gây tiêu chảy ở nƣớc ta hiện chƣa tìm thấy sự hiện diện của chủng
E. coli O157:H7, tuy nhiên những vi khuẩn thuộc các nhóm khác gây ngộ độc và các
bệnh liên quan đã đƣợc phát hiện trong nhiều trƣờng hợp [35]. Trong sinh hoạt hàng
ngày, không ngoại trừ trƣờng hợp chúng ta bị nhiễm E. coli O157:H7 thông qua tiếp
xúc hay phơi nhiễm với phân ngƣời, động vật và gia cầm.
Việc xác định nhanh, chính xác sự có mặt của vi khuẩn E. coli O157:H7
trong các mẫu thực phẩm góp phần bảo vệ sức khỏe cho con ngƣời là cần thiết.
Việc sử dụng kháng thể kháng E.coli O157:H7, một trong những yếu tố quan trọng
để phát hiện E. coli O157:H7 vẫn còn chƣa đƣợc nghiên cứu. Chính vì vậy, chúng
tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn
Escherichia coli O157:H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu các kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 và tạo
kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu với E. coli O157:H7.
3. Nội dung nghiên cứu
Giới : Bacteria
Ngành(phylum): Proteobacteria
Lớp (class): Gamma Proteobacteria
Bộ (ordo): Enterobacteriales
Họ (familia): Enterobacteriaceae
Chi (genus): Escherichia
Loài (species): E. coli
Chủng: O157: H7
Hình 1.1. Hình ảnh vi khuẩn E. coli
O157:H7 trên kính hiển vi điện tử [104]
E. coli O157:H7 thuộc nhóm vi khuẩn đƣờng ruột Enterobacteriaceae, thuộc
loại trực khuẩn Gram âm, di động bằng tiêm mao quanh tế bào, không tạo bào tử, có
vỏ ngoài (capsule) và có lông bám (pili) (Hình 1.1). E. coli O157:H7 có cấu tạo đơn
4
giản gồm bên ngoài là vách tế bào, tiếp theo là màng sinh chất, hai lớp màng này
liên kết chặt chẽ với nhau để bảo vệ tế bào. Bên trong lớp màng là tế bào chất, nơi
chứa các enzyme, đƣờng, ATP, và các phân tử khác [60], [64].
E. coli O157:H7 là vi sinh vật kị khí không bắt buộc, có khả năng hô hấp và
lên men, không sinh bào tử, tế bào tồn tại dạng đơn lẻ hoặc theo cặp đôi. Khoảng
nhiệt độ tồn tại của vi khuẩn này từ 7-50C, tối thích ở 37C, bị tiêu diệt ở nhiệt độ
trên 70C. E. coli O157:H7 sinh trƣởng đƣợc trên môi trƣờng có pH từ 4,4-9,0 và
có thể tồn tại đƣợc ở điều kiện pH 2,5 ở 37C trong 2-7 giờ, pH tối ƣu cho vi khuẩn
hoạt động là từ 6-7 [16]. Vi khuẩn bị ức chế trong môi trƣờng có nồng độ muối là
8,5%, chậm phát triển ở nồng độ muối trên 2,5%. E. coli O157:H7 sản sinh ra độc
tố gọi là Shiga-like toxin (hoặc Verocytoxin) do có sự giống nhau với độc tố gây
bệnh lị đƣợc tạo ra bởi Shigella dysenteria type 1, vi khuẩn này cũng gây ra hội
coli là kháng nguyên O (Ohne- kháng nguyên soma) và kháng nguyên H (Hauch-
kháng nguyên lông) [33], ngoài ra còn có kháng nguyên K (capsular) và kháng
nguyên F (fimbriae). Kháng nguyên soma O đƣợc xác định bởi phần polysaccharide
của thành thế bào lipopolysaccharide, còn kháng nguyên H đƣợc xác định bởi
6
protein roi. Có 174 kháng nguyên O (đánh số thứ tự từ 1- 181, trong đó không có
các số 31, 47, 67, 72, 93, 94 và 122) và 53 kháng nguyên H.
Bảng 1.1. Các thông số hệ gen của vi khuẩn E. coli O157:H7
Đặc điểm
Hệ gen
pO157
pOSAK1
Kích thƣớc (bp)
5498450
92721
3306
Tỉ lệ G+C (%)
50,5
47,6
43,4
Khung đọc mở (ORF):
5361
83
3
Vùng mã hóa protein (%)
88,1
82,5
gây bệnh C bao gồm những type ít liên quan tới bệnh HUS, không tạo thành dịch
7
nhƣ O91:H21 và O113:H21. Type gây bệnh D gồm một số type liên quan tới bệnh
tiêu chảy và type E gồm nhiều chủng STEC không gây bệnh ở ngƣời.
1.1.2. Độc tố Shiga-like toxin: Bản chất và tác hại
Theo CDC (Centers for Disease Control and Prevention-Trung tâm Kiểm
soát và Phòng chống Dịch bệnh Mỹ), E. coli O157:H7 là một trong bốn chủng vi
khuẩn gây bệnh tiêu chảy sau các chủng Campylobacter sp., Salmonella sp.và
Shigella sp. Bốn chủng này nằm trong nhóm độc tố Shiga toxin đƣợc sản xuất bởi
E. coli (shiga toxin-producing E.coli, STEC). Nhân tố gây bệnh chính của STEC là
prophage mã hóa cho độc tố Shiga. Độc tố này gây bệnh tiêu chảy và cả hội chứng
HC và HUS [86]. STEC sinh ra hai loại độc tố gọi là Shiga toxin 1 và Shiga toxin 2.
Các yếu tố gây độc khác bao gồm một protein màng ngoài gọi là intimin (protein
quan trọng giúp vi khuẩn tồn tại trong ruột) và enterhemolysin mã hóa bởi một
plasmid đƣợc gọi là pO157. Enterohemolysin góp phần gây độc bằng cách phân hủy
tế bào hồng cầu giúp tạo ra nguồn cung cấp sắt cho vi khuẩn.
Shiga- like toxin
Tiểu phần B
Hình 1.4. Cấu trúc độc tố Shiga-like toxin [104].
Độc tố Shiga toxin đƣợc xác định lần đầu tiên bởi Kiyoshi Shiga vào năm
1898 do vi khuẩn Shigella dysenteriae tiết ra. Vài năm sau ngƣời ta nhận thấy mối
liên quan giữa độc tố này với các bệnh tiêu chảy, hội chứng HUS và một số bệnh
khác. Độc tố Shiga toxin có hai họ là Shiga toxin I và Shiga toxin II đƣợc mã hóa
bởi 2 gen tƣơng ứng là Stx1 và Stx2. Hai độc tố này có thể phát hiện trong E. coli
O157:H7 và các type huyết thanh STEC độc lập hoặc cùng với nhau [15]. Loại độc
có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của độc tố bởi tất cả các tế bào dễ bị
nhiễm Shiga-like toxin thì đều có Gb3 trên bề mặt tế bào, trong khi đó những tế bào
không có Gb3 trên bề mặt thì có khả năng kháng lại độc tố (Hình 1.5).
Năm 1977, Konowalchuk và cộng sự đã báo cáo rằng chủng gây bệnh E. coli
O26:H11 thuộc nhóm EPEC (Enteropathogenic E. coli- E. coli gây bệnh đƣờng ruột)
sản xuất một chất độc tác động trên tế bào Vero và đặt tên là Vero toxin [46]. O'Brien
và cộng sự (1987) cho rằng, độc tố Vero toxin mà Konowalchuk nghiên cứu rất giống
với độc tố Shiga toxin đƣợc sản xuất bởi Shigella dysenteriae type 1, và nó có thể bị
vô hiệu hóa bằng anti-Shiga toxin, do đó một tên mới đƣợc đƣa ra là Shiga-like toxin
[69]. Độc tố Vero toxin do Konowalchuk và cộng sự mô tả giống với độc tố Shiga
toxin về đặc điểm di truyền và protein. Do vậy, các tên Shiga-like toxin, Shiga toxin
và Vero toxin đƣợc sử dụng thay thế cho nhau, kết quả là tên các chủng VTEC
(verotoxin producing E. coli), SLTEC (Shiga-like toxin producing E. coli) và STEC
đều đƣợc sử dụng. Các bệnh nhƣ HC, HUS thƣờng gây ra bởi nhóm STEC hoặc
EHEC (Enterohemorrhagic Escherichia coli). Tất cả các chủng EHEC đều đƣợc cho
là gây bệnh, tuy nhiên không phải tất cả các chủng STEC đều gây bệnh HC hoặc
HUS. Nhóm vi khuẩn E. coli O157:H7 thuộc nhóm EHEC. Nếu xét về độc tố của nó,
E. coli O157:H7 phải thuộc về nhóm VTEC, SLEC hoặc STEC. Điều này có thể
đƣợc khẳng định khi cơ chế gây bệnh của vi khuẩn đƣợc mô tả đầy đủ.
Shiga-like toxin I
Shiga-like toxin I là một nhân tố độc lực của E. coli O157:H7 gây bệnh ở
ngƣời. Giống nhƣ các độc tố khác của họ Shiga toxin, nó bao gồm một tiểu phần
(A) có chức năng enzyme và năm bản sao của một tiểu đơn vị liên kết (B-
pentamer). Shiga-like toxin 1 đƣợc mã hóa bởi gen Stx1. Các gen Stx1 có cấu trúc
bảo tồn cao giống với độc tố Shiga toxin do dysenteriae loại 1 tạo ra. Trƣớc đây,
gen Stx1 đƣợc biết chỉ có duy nhất một biến thể [53], ngày nay ngƣời ta biết thêm
một số biến thể khác của Stx1 là Stx1c [100] và Stx1d [17]. Biến thể Stx1c không
tìm thấy trong vi khuẩn STEC và không liên quan đến bệnh ở ngƣời.
nguyên khác với Shiga-like toxin I bên cạnh đó Shiga-like toxin II không bị vô hiệu
bởi anti-Shiga-like toxin hoặc kháng thể kháng Shiga-like toxin I. Shiga-like toxin
II có nhiều trình tự và tính kháng nguyên đa dạng hơn Shiga-like toxin I [27], [33].
Shiga-like toxin 2 có liên quan với HUS. Stx1 và Stx2 có độc tính khác nhau
đối với từng loại tế bào. So với Shiga-like toxin 1, Shiga-like toxin 2 độc hơn gấp
1000 lần đối với tế bào nội mô mao mạch thận của ngƣời [11]. Siegler và cộng sự
11
(2003) đã thử nghiệm và so sánh ảnh hƣởng của Shiga-like toxin 1 và Shiga-like
toxin 2 trên mô hình động vật linh trƣởng [85]. Siegler đã tiêm Shiga-like toxin 2
vào tĩnh mạch dẫn tới biểu hiện lâm sàng và bệnh đặc trƣng cho HUS, trong khi tiến
hành tƣơng tự đối với Shiga-like toxin 1 thì không thấy có sự phát triển bệnh. So
sánh cấu trúc tinh thể của Shiga-like toxin 2 và Shiga toxin cho thấy có 4 điểm cấu
trúc khác biệt lớn có thể giải thích cho sự liên quan giữa Shiga-like toxin 2 với
HUS. Sự khác biệt lớn nhất là do vị trí hoạt động của Shiga-like toxin 2, sự tăng
cƣờng khả năng gây độc có thể do tiểu đơn vị A của Shiga-like toxin 2 hình thành
cấu trúc xoắn 2 vòng sau khi đi qua vòng trung tâm cấu trúc pentamer của 5 tiểu
phần B. Một trong ba vị trí liên kết với thụ thể trong cấu trúc pentamer tiểu phần B
của Shiga-like toxin 2 có hình dạng khác so với các cấu trúc pentamer-B của Shiga-
like toxin. Vị trí đầu carboxyl đoạn A1 của Shiga-like toxin 2 liên kết với một vị trí
trong Shiga-like toxin 2 [27].
Shiga-like toxin 2 không chỉ gây độc tế bào đối với tế bào Vero và Hela, mà
còn gây độc trong ruột thỏ, gây chết do tê liệt trên chuột thí nghiệm. Tuy nhiên khi
phân tích các mẫu E. coli O157:H7 phân lập đƣợc từ các đợt dịch và những bệnh
nhân mắc HUS cho thấy rằng các chủng này không sản sinh một độc tố duy nhất mà
cùng sản xuất cả hai loại Shiga-like toxin. Nhƣ vậy có thể có một mối liên hệ giữa
cả hai loại độc tố này trong quá trình gây bệnh của vi khuẩn, tuy nhiên điều này vẫn
chƣa đƣợc làm sáng tỏ [20].
huyết, tiểu cầu vón cục và suy thận, hội chứng này xuất hiện chủ yếu xuất hiện ở trẻ
dƣới 10 tuổi và ngƣời cao tuổi. Các triệu chứng đầu tiên của HUS là: ngƣời bệnh
xanh xao, thiếu máu, bí tiểu, phù và suy thận cấp, các triệu chứng này bắt đầu từ
khoảng một tuần sau khi nhiễm vi khuẩn. Một nửa bệnh nhân HUS phải lọc thận và tỉ
lệ tử vong của số bệnh nhân này là 3-5%. Một số biến chứng khác của HUS có thể
gồm tai biến, hôn mê, đột quỵ, tăng huyết áp, khoảng 15% trƣờng hợp bệnh nhân gặp
các biến chứng nhƣ trên sẽ bị suy thận mãn tính [16], [20]; (iii) Tử vong: các trƣờng
13
hợp tử vong do E. coli O157:H7 thƣờng xảy ra với ngƣời cao tuổi với nguyên nhân
chủ yếu do tiêu chảy, HUS, xuất huyết, phát ban, sốt cao [20].
1.1.4. Tình hình ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn ở Việt Nam
Theo thống kê của của Bộ Y tế, từ năm 2004-2009 đã có 1.058 vụ ngộ độc
thực phẩm, trung bình 176,3 vụ/năm, số ngƣời bị ngộ độc thực phẩm là 5.302
ngƣời/năm, số ngƣời chết là 298 ngƣời (49,7 ngƣời/năm), tính trung bình tỷ lệ
ngƣời bị ngộ độc thực phẩm cấp tính là 7,1 ngƣời/100 nghìn dân/năm. Năm 2009 có
152 vụ ngộ độc thực phẩm với 5.212 ngƣời mắc và 31 ngƣời tử vong. So sánh với
năm 2008, số vụ ngộ độc/năm 2009 giảm 53 vụ (25,9%); số ngƣời mắc giảm 2.616
ngƣời (33,4%); số ngƣời đi viện giảm 1.888 ngƣời (31,3%); và số ngƣời bị tử vong
giảm 26 trƣờng hợp ( 42,6%). Về nguyên nhân ngộ độc thực phẩm, 29,6% số vụ do
thực phẩm bị ô nhiễm vi sinh vật, 5,2% số vụ do hóa chất, 24,7% do thực phẩm có
sẵn độc tố tự nhiên, 40,5% số vụ không xác định đƣợc nguyên nhân [102].
Trong năm 2013, ở nƣớc ta đã xảy ra nhiều vụ ngộ độc nghiêm trọng, trong
đó nguyên nhân chủ yếu là do vi khuẩn E. coli gây ra (thống kê trong quý III năm
2013 trong 40 vụ ngộ độc thực phẩm thì 23 vụ do vi sinh vật gây ra). Trong 5 ngày
(từ 23-28/5/2013) có 163 ngƣời ở Bến Tre nhập việ
. Kết quả kiểm nghiệm của Viện
Pasteur TP HCM cho thấ ủa tiệm bánh mì
COLI O157:H7
1.2.1. Phƣơng pháp PCR dựa trên DNA
Hiện nay, phƣơng pháp truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái, huyết
thanh vẫn đang là công cụ quan trọng trong phân loại vi khuẩn. Các phƣơng pháp
về hình thái học, huyết thanh học thƣờng đƣợc kết hợp với các phƣơng pháp nhuộm
(ví dụ nhƣ nhuộm Gram) thƣờng đƣợc sử dụng trong nhận dạng. Tuy nhiên, các
phƣơng pháp truyền thống này chƣa đủ để phân loại những loài gần nhau. Trong
một số trƣờng hợp, phân loại truyền thống gặp trở ngại do một số đặc tính dùng cho
nhóm vi sinh vật này nhƣng lại không có ý nghĩa với nhóm vi sinh vật khác. Điều
này dẫn đến nhiều trƣờng hợp phải xác định lại tên phân loại của một số vi sinh vật.
Mặt khác, đối với những loài có độ tƣơng đồng cao về mặt hình thái thì phân loại
truyền thống sẽ khó có thể đạt đƣợc hiệu quả. Nhƣợc điểm này của phân loại truyền
thống hoàn toàn có thể bổ sung nhờ phân loại học phân tử.
15
Ngày nay, do những tiến bộ khoa học kĩ thuật trong sinh học phân tử, di
truyền học phân tử, phƣơng pháp phân loại vi khuẩn đã đƣợc bổ sung nguồn đặc
điểm phân loại theo genotype. Các kết quả nghiên cứu so sánh sinh hóa đã chứng
minh đƣợc rằng thành phần và trình tự nucleotide của DNA và rRNA, các loại gen
điều khiển trao đổi chất, thành phần và cấu tạo các bào quan là những bằng chứng
đáng tin cậy để xác định loài. Kết hợp với phƣơng pháp phân loại theo đặc điểm
hình thái (phenotype) thì phƣơng pháp phân loại dựa vào những phân tích, so sánh
trình tự gen đang đƣợc coi là công cụ để xác định vi khuẩn ở nhiều bậc định loại
loài. Đặc biệt phân tích trình tự của rRNA còn là phƣơng tiện để điều tra và định
danh những loài vi khuẩn không thể nuôi cấy trong môi trƣờng nhân tạo [3]. Hiện
nay, đại đa số các nhà khoa học đồng ý với quan niệm 2 chủng đƣợc coi là 2 loài
riêng biệt nếu chúng giống nhau dƣới 70% khi tiến hành lai DNA. Keswani và cộng
sự (2001) đã chứng minh rằng nếu sự tƣơng đồng giữa hai trình tự gen 16S rRNA
V9) có thể đƣợc sử dụng hiệu quả để phân biệt giữa các đơn vị phân loại. Chính vì
thế nên gen 16S rRNA có thể đƣợc coi là một marker cho nghiên cứu phân loại
[54]. Thêm vào đó, trên gen 16S rRNA có chứa các vùng biến đổi (variable) và
vùng bán bảo tồn (semi-conserved) cho phép xác định tính đặc trƣng ở mức độ
chủng, loài [19]. Do vậy, gen 16S rRNA đã đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu kỹ
lƣỡng và đã thiết kế đƣợc rất nhiều cặp mồi để nhân đoạn gen này bằng kỹ thuật
PCR. Đây là một thuận lợi cho các nghiên cứu phân loại dựa trên các gen mã hóa
16S rRNA. Ngoài ra, ngƣời ta còn sử dụng vùng đệm giữa gen 16S rRNA và 23S
rRNA để nghiên cứu về tính đa dạng của prokaryotes [30]. Có nhiều kết quả nghiên
cứu sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện hoặc phân loại các loài vi khuẩn. Ví dụ gần
đây nhất, Mizrahi-Man (2013) cũng sử dụng trình tự ngắn gen 16S rRNA để phân
loại [54]. Theo Hoo và cộng sự, trong 7 năm (2001- 2007) sử dụng trình tự 16S
rRNA đã phát hiện đƣợc 215 loài mới trong đó có 29 loài mới. Tác giả cũng khẳng
định nên sử dụng các phƣơng pháp khác để bổ sung cho phƣơng pháp sử dụng gen
16S rRNA [99].
Bên cạnh các gen rRNA, các gen độc tố cũng đƣợc sử dụng trong phân loại
học phân tử. Các gen này thƣờng là những gen gây độc nằm trong các vi khuẩn gây
bệnh ở các loài. Ví dụ, đối với E. coli O157:H7 các gen độc tố thƣờng đƣợc sử dụng
nhƣ gen Stx1, Stx2, eae, ehxA, saa Hầu hết các kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc sử
dụng để phát hiện và phân loại vi khuẩn đều là những phƣơng pháp hiện đại nhƣ
PCR, Real-time PCR, kỹ thuật LAMP Mỗi phƣơng pháp có ƣu điểm và nhƣợc
điểm riêng phù hợp với từng đối tƣợng và các gen nghiên cứu. Việc sử dụng các
gen độc tố để phát hiện các vi khuẩn độc trong các mẫu nghiên cứu hoặc mẫu thực
Copyright: Tài liệu đại học ©