1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngộ độc thực phẩm xảy ra khi chúng ta sử dụng thức ăn, nước
uống không được bảo quản đúng cách dẫn đến sản phẩm bị hư thối
do nhiễm khuẩn hoặc hóa chất độc hại Các nghiên cứu gần đây đã
xác định một trong những nguyên nhân của nhiều trường hợp ngộ
độc thức ăn là do vi khuẩn E. coli .
E. coli thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, có
nhiều trong tự nhiên, trong ruột của người và gia súc. Trong đường
ruột, chúng hiện diện chủ yếu ở đại tràng nên còn được gọi là vi
khuẩn đại tràng. E. coli nhiễm vào đất, nước… từ phân của động vật.
Khi gặp điều kiện thuận lợi cho sự phát triển chúng sẽ gây bệnh. Đa
số các chủng E. coli là những chủng ít độc hại, tuy nhiên cũng có vài
chủng rất độc như chủng E. coli O157:H7 có thể tìm thấy trong ruột
và trong phân của các loài gia súc, đặc biệt là trong phân bò, chất thải
của bò và các sản phẩm như thịt bò, sữa bò chưa khử trùng
Các bệnh có liên quan đến E. coli là tiêu chảy, viêm phổi, viêm
đường dẫn tiểu và một số bệnh khác. Triệu chứng bị nhiễm trùng vi
khuẩn thường khác nhau, nhưng nhìn chung, bệnh nhân hay có các
triệu chứng như: nôn, đau bụng, sốt, xuất huyết dưới da, tăng huyết
áp, tiêu chảy thường có máu Đại đa số bệnh nhân phục hồi sau 5
đến 7 ngày. Vì vi khuẩn E. coli quá phổ biến, nên hàng năm trên
khắp thế giới đều có người mắc bệnh do vi khuẩn này. Các chuyên
gia ước tính rằng ở Mỹ mỗi năm có khoảng 70 nghìn người mắc bệnh
liên quan đến E. coli O157:H7.
Ở Việt Nam, theo thống kê của Cục Vệ sinh An toàn Thực
phẩm, năm 2010 có 175 vụ ngộ độc với 5664 người mắc, trong đó có
3978 người phải nhập viện và 51 người tử vong. Năm 2011 có 148
2
vụ ngộ độc, trong đó có 4700 người mắc với 3663 người phải nhập

(ii) Tạo dòng gen mã hóa cho kháng thể đặc hiệu chủng vi khuẩn
E. coli O157:H7 bằng kỹ thuật phage display;
(iii) Thu nhận kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu vi khuẩn E. coli
O157:H7;
(iv) Xác định độ nhạy, tính đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp.
4. Những điểm mới của đề tài:
(i) Tạo được kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu chủng vi khuẩn E. coli
O157:H7 bằng kỹ thuật phage display.
(ii) Đã sử dụng phức hợp nano-kháng thể trong việc phát hiện vi
khuẩn E. coli O157:H7 bằng phương pháp soi dưới kính hiển vi.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
5.1. Ý nghĩa khoa học
(i) Đánh giá các phương pháp (PCR nhân gen 16S rRNA, gen
độc tố và kỹ thuật LAMP) trong việc phát hiện và phân loại chủng E.
coli O157:H7.
(ii) Cung cấp dẫn liệu khoa học về khả năng ứng dụng kỹ thuật
phage display trong việc tạo protein kháng thể tái tổ hợp.
(iii) Đã nghiên cứu các đặc điểm cấu trúc gen và protein kháng
thể tái tổ hợp đặc hiệu E. coli O157:H7 có nguồn gốc từ thư viện
phage display.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Các kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy có thể sử dụng các
phương pháp khác nhau như PCR nhân gen 16S rRNA, gen độc tố
hoặc kỹ thuật LAMP hướng tới việc thiết kế phát triển kit phát hiện
nhanh vi khuẩn E. coli O157:H7 một cách đơn giản, hiệu quả, giá
thành thấp, phù hợp với điều kiện của Việt Nam.
4
Bên cạnh đó, việc tạo được kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu E. coli
O157:H7 có vai trò quan trọng trong việc phát triển các kit phát hiện
vi khuẩn này trong các mẫu thực phẩm và cũng như trong phác đồ

chủng tế bào E. coli , các enzyme, các kháng thể, được mua của các
hãng nổi tiếng như: Merck, Invitrogen, Sigma, Biolabs, Fermentas,
Promega, của các nước Mỹ, Anh, Đức, Trung Quốc.
2.2. Thiết bị
Các thí nghiệm được tiến hành trên các trang thiết bị thuộc
Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen và phòng Công
Công nghệ Việt Nam. Các thiết bị thường sử dụng như: Máy ly tâm,
bộ điện di đứng, máy Speed Vac, được mua từ nhiều hãng.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
Các phương pháp nghiên cứu sử dụng trong luận án thực hiện
theo Sambrook và cộng sự (2001) có cải tiến phù hợp. Một số
phương pháp tiến hành theo kit và hướng dẫn của nhà sản xuất. Gồ
ứu DNA;Kỹ thuật
bộc lộ trên thực khuẩn thể (phage display); ứu
protein; Phương pháp phân tích và sử lý số liệu.

6
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
:

3.1.

Hình 3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm của luận án.
3.1. XÁC ĐỊNH VI KHUẨN E. COLI O157:H7 BẰNG

o ng &
u n gen
m tra
7
thước tính toán lý thuyết. Các băng đều sáng, đậm, rõ nét và đủ tiêu
chuẩn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Để khẳng định xem đoạn
gen nhân được được có phải là gen mã hóa 16S rRNA hay không, sản
phẩm PCR được tiến hành tách dòng và xác định trình tự.

Marker: Marker 1kb
Mẫu 1: E. coli O157:H7 số 1
Mẫu 2: E. coli O157:H7 số 2
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa 16S rRNA
3.1.1.3. Biến nạp plasmid tái tổ hợp mang gen 16S rRNA vào tế
bào E. coli DH5α
Quá trình tách dòng và xác định trình tự gen mã hoá 16S rRNA
được thực hiện bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm phản ứng PCR vào
vector tách dòng pBT. Sau đó vector tái tổ hợp pBT mang đoạn gen
16S rRNA được tách chiết và kiểm tra bằng phương pháp cắt bởi
enzyme giới hạn BamHI. Tiếp theo, các plasmid tái tổ hợp sẽ được
tách chiết với số lượng lớn và được tinh sạch để sử dụng cho phản
ứng xác định trình tự.
3.1.1.4. Xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA
Sau khi tách chiết và tinh sạch DNA plasmid, gen 16S rRNA sẽ
được xác định trình tự theo nguyên tắc của F. Sanger và cộng sự
(1981), sử dụng trên máy xác định trình tự tự động. Đoạn gen 16S
rRNA đã tách dòng có kích thước 1499 bp. Kết quả so sánh trình tự
với các trình tự đã công bố trên Ngân hàng Gen Quốc tế bằng phần
mềm FASTA ( cho thấy trình tự nucleotide của
8

9
Kết quả điện di trên hình 3.7 cho thấy ở giếng số 1 và giếng số 2
không xuất hiện băng chứng tỏ E. coli DH5α không mang gen độc.
Giếng số 3 xuất hiện một băng có kích thước khoảng 180 bp, tương
ứng với kích thước của gen Stx1 theo tính toán lý thuyết. Ở giếng số
4 có một băng vạch sáng đậm có kích thước khoảng 200 bp phù hợp
với kích thước của gen Stx2 như tính toán theo lý thuyết. Các băng
đều sáng, đậm, rõ nét và đủ tiêu chuẩn để tiến hành các thí nghiệm
tiếp theo. Tiếp theo, sản phẩm PCR thu được được tiến hành tách
dòng và xác định trình tự.
3.1.2.2. Chọn dòng gen Stx1 và Stx2 trong vector pJET1.2/blunt
Sản phẩm PCR nhân hai gen Stx1 và Stx2 được tách dòng bằng
cách gắn trực tiếp vào vector pJET1.2/blunt, sau đó vector tái tổ hợp
pJET1.2 mang gen Stx1 và Stx2 được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.
coli DH5α. Kiểm tra các dòng bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi của
vector pJET1.2.
Để khẳng định kết quả tách dòng đối với 2 gen Stx1 và Stx2, tiếp
theo plasmid của dòng số 1 mang gen Stx1 và dòng số 5 mang gen
Stx2 được tinh sạch và giải trình tự.
3.1.2.3. Xác định trình tự đoạn gen Stx1 và Stx2
Sau khi tách chiết và tinh sạch DNA plasmid, đoạn gen Stx1 và
Stx2 được xác định trình tự. Kết quả xác định trình tự cho thấy đoạn
gen Stx1 có kích thước là 150bp, đoạn gen Stx2 có kích thước là
205bp. Đoạn gen Stx1 và Stx2 đều nằm ở tiểu phần A, tiểu phần có
vai trò như một enzyme N-glycosidase. Trình tự gen Stx Stx2
được được so sánh với các trình tự đã công bố trên Ngân hàng Gen
Quốc tế bằng phần mềm phân tích độ tương đồng BLAST
(). Kết quả nhận được cho thấy trình tự
nucleotide thu được có độ tương đồng 99% với các trình tự của đoạn
10

cho kết quả dương tính với vi khuẩn E. coli O157:H7 (giếng 1) và âm
tính với vi khuẩn E. coli ATCC (giếng 2). Ở đường chạy số 1 xuất
hiện 1 dải băng dài với kích thước nhỏ nhất dưới 250 bp. Kết quả này
phù hợp với tính toán lý thuyết. Khi nhân PCR với cặp mồi ngoài,
đoạn DNA thu được sẽ có kích thước là 139 bp. Bên cạnh đó, ở
đường chạy số 2 không thấy xuất hiện dải băng, chứng tỏ phản ứng
LAMP không xảy ra đối với vi khuẩn E. coli ATCC, điều này là phù
hợp do trong DNA vi khuẩn E. coli ATCC không có chứa gen Stx2
mã hóa độc tố Shiga-like toxin 2. Như vậy, có thể nhận định, phản
ứng LAMP vẫn có thể xảy ra trong trường hợp chỉ sử dụng 1 cặp mồi
FIP/BIP.
Tiếp theo độ nhạy của phản ứng LAMP xác định. Sau khi thí
nghiệm và tính toán, hàm lượng DNA tối thiểu để phản ứng dương
tính trong thời gian 25 phút là: 93,5pg/µl (tương đương khoảng 166
tế bào) đối với điều kiện phòng thí nghiệm của chúng tôi.
Cùng với hàm lượng DNA tối thiểu cần thiết cho phản ứng
LAMP, thời gian tối thiểu để phản ứng diễn ra cũng được thực hiện.
Tiến hành phản ứng LAMP trên máy PCR thông thường, sau đó mẫu
được lấy ở các thời điểm sau 15 phút, 25 phút, 30 phút, 40 phút và 60
phút và được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose.
Kết quả là sau 25 phút có thể quan sát được phản ứng LAMP khi kết
quả cho dương tính.
3.1.1.3. Phát hiện sản phẩm LAMP
Một cách phát hiện sản phẩm LAMP khác bằng mắt thường là
sử dụng SYBR Green I. Những mẫu nào dương tính sẽ cho màu
12
xanh, còn mẫu nào âm tính sẽ cho màu vàng chanh (hình 3.14A). Có
thể quan sát mẫu dương tính được nhuộm SYBR Green I dưới tia
UV. Khi quan sát dưới tia UV, mẫu dương tính sẽ phát quang, mẫu
âm tính sẽ không có mầu ( hình 3.14B).

ATCC 25922 làm kháng nguyên). Đánh giá khả năng gắn kết của
hỗn hợp phage với tế bào đích sau mỗi vòng sàng lọc được đánh giá
bằng kỹ thuật ELISA . Kết quả sau 5 vòng sàng lọc, hỗn hợp phage
thu được chứa chủ yếu các dòng phage mà kháng thể bộc lộ trên đó
gắn đặc hiệu với vi khuẩn E. coli O157:H7.
Để tạo dòng, hỗn hợp phage sau vòng sàng lọc 5 được xâm
nhiễm vào E. coli chủng TG1, sau đó 37 khuẩn lạc chứa phagemid đã
chọn được nhân lên và thu phage. Phage thu được từ các khuẩn lạc
riêng rẽ này dưới dạng từng dòng riêng biệt và được sử dụng cho thí
nghiệm xác định khả năng gắn kết với E. coli O157:H7 bằng phương
pháp ELISA.
3.2.2. Chọn dòng kháng thể phage đặc hiệu với vi khuẩn E. coli
O157: H7
37 dòng khuẩn lạc sau chọn lọc được tiến hành tách phage để
thực hiện phản ứng ELISA đánh giá độ gắn kết. Kết quả nhận được
cho thấy tất cả 37 dòng phage được chọn đều thể hiện khả năng gắn
với E. coli O157:H7 qua phản ứng ELISA. Ngoại trừ dòng phage 20
có tín hiệu ELISA cao vượt trội, các dòng phage còn lại có kết quả
trung bình và gắn khá đồng đều với E. coli O157:H7 (Hình 3.17).
14
Điều này chứng tỏ sau 5 vòng sàng lọc, hỗn hợp phage thu được chứa
chủ yếu các dòng phage có khả năng gắn với E. coli O157:H7.
Từ kết quả trên, một số dòng phage có tín hiệu ELISA trung
bình và cao (bao gồm cả dòng phage 20) từ lần phản ứng ELISA
trước được tiến hành chọn lọc bằng ELISA tiếp theo để phân tích khả
năng gắn kết của từng dòng phage trên đích E. coli O157:H7 so với
các đối chứng âm (giếng chứa PBS) và đối chứng dương (giếng chứa
vi khuẩn E. coli ATCC 25922). Kết quả xác nhận khả năng nhận biết
và liên kết đặc hiệu với tế bào E. coli O157:H7 (các dòng phage cao
và trung bình) bằng kỹ thuật ELISA được thể hiện trong hình 3.18.

cặp mồi LABF/LABR.

M: Marker DNA
1: Sản phẩm PCR
So sánh với các băng vạch đã biết trước kích thước trên thang DNA
chuẩn cho thấy sản phẩm PCR có kích thước khoảng 600bp tương ứng
với kích thước gen mã hóa kháng thể theo tính toán lý thuyết. Tiếp theo,
gen mã hóa kháng thể này được tiến hành giải trình tự.
3.2.4. Giải trình tự gen mã hoá kháng thể
Trình tự gen mã hóa kháng thể được xác định theo phương pháp
của F. Sanger và cộng sự, sử dụng trên máy xác định trình tự tự động.
Đoạn kháng thể thu nhận được có trình tự amino acid suy diễn như sau:
MNTYCLRQPLDCYYSRPSRPWPRCSCRSTSSGGGGSGGGG
SGGSALQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTSGYYP
NWFQQKPGQAPRALIYSTSNKHSWTPARFSGSLLGGKAAL
TLSGVQPEDEAEYYCLLYYGGAMVFGGGTKLTVLGAAA
16
Đoạn gen mã hóa cho kháng thể có độ dài 623bp (với tỉ lệ C+G
là 54.98%) mã hóa cho một protein kháng thể gồm159 amino acid.
Đoạn kháng thể thu được không phải là đoạn scFv đầy đủ mà chỉ
gồm toàn bộ chuỗi nhẹ (V
L
) nối với một phần chuỗi nặng (V
H
). Vùng
linker nối giữa hai đoạn chuỗi nặng và chuỗi nhẹ có trình tự amino
acid là SSGGGGSGGGGSGGS.
Tính đặc hiệu của kháng thể nằm trong 6 vùng quyết định tính
bổ trợ (complementarity determining region, CDR), vùng tạo hình
dạng của vị trí gắn kết với kháng nguyên (mỗi chuỗi nặng hoặc chuỗi