MỤC LỤC
Trang
Lời mở đầu 1
Chương 1: Tổng quan tài liệu
1.1. Tình hình dịch tễ virút cúm đại dịch A/H1N1-2009 3
1.1.1. Tình hình thế giới 3
1.1.2. Tình hình Việt Nam 6
1.2. Virút cúm đại dịch 7
1.2.1. Virút cúm A 7
1.2.2. Các đại dịch cúm trong quá khứ 9
1.2.3. Virút cúm A đại dịch H1N1/2009 11
1.3. Các phương pháp chẩn đoán cúm 18
1.3.1. Phương pháp huyết thanh học 18
1.3.2. Phương pháp miễn d
ịch 19
1.3.2.1. Phương pháp miễn dịch enzyme 19
1.3.2.2. Phương pháp chẩn đoán nhanh 19
1.3.2.3. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang 20
1.3.3. Phương pháp nuôi cấy virút 21
1.3.4. Phương pháp phân tử 21
1.4. Các phương pháp chẩn đoán cúm A/H1N1-2009 22
1.4.1. Phương pháp chẩn đoán nhanh kháng nguyên 22
1.4.2. Phương pháp phân tử 23
1.5. Tác nhân ảnh hưởng đến kết quả chẩn đoán virút cúm 23
1.5.1. Loại mẫu bệnh phẩm 24
1.5.2. Chất lượng mẫu 24
1.6. Các đặc tính quyết định việc đánh giá chính xác trong chẩn đoán 24
1.6.1. Các đặc tính hiệu suất 25
1.6.1.1. Độ nhạy và độ đặc hiệu 25
1.6.1.2. Giá trị tiên đoán dương và tiên đoán âm 25
1.6.1.3. Độ lặp lại 25

2.3.10.3. Phân tích kết quả biến nạp 41
2.3.10.4. Tách plasmid mục tiêu từ tế bào chọn lọc 41
2.3.10.5. Cắt plasmid mục tiêu bằng enzyme cắt giới hạn 41
2.3.11. Phương pháp sản xuất enzyme 42
2.3.11.1. Điều kiện nuôi cấy và biểu hiện 42
2.3.11.2. Chiết xuất và tinh sạch enzyme 42
2.3.12. Điện di SDS-PAGE 42
2.3.13. Định lượng plasmid DNA 43
2.3.14. Phương pháp giải trình tự 43
2.3.14.1. Tinh sạch sản phẩm DNA cần giải trình tự 44
2.3.14.2. PCR đánh dấu sản phẩm DNA cần giải trình t
ự 44
2.3.14.3. Xử lý mẫu DNA và nạp mẫu vào máy giải trình tự 45
2.3.15. Các phương pháp thống kê 46
2.3.15.1. Độ nhạy 46
2.3.15.2. Độ đặc hiệu 46
2.3.15.3. Giá trị tiên đoán dương 46
2.3.15.4. Giá trị tiên đoán âm 47
2.3.15.5. Ước tính cỡ mẫu cho phân tích độ nhạy và độ đặc hiệu 47
Chương 3: Kết quả và bàn luận
3.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình chế tạo kit xét nghiệm 49

3.1.1. Thiết kế mồi 49
3.1.1.1. So sánh trình tự và thiết kế mồi 49
3.1.1.2. Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi được thiết kế 51
3.1.2. Điều chế enzyme Taq polymerase 52
3.1.2.1. Biểu hiện và tinh sạch Taq polymerase 52
3.1.2.2. Hoạt tính Taq polymerase 54
3.1.3. Khảo sát hỗn hợp enzyme phản ứng RT-PCR 55
3.1.4. Chuẩn hóa các điều kiện phản ứng RT-PCR 59

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

aa : Amino acid (axít amin)
ATCC : The American Type Culture Collection
(Ngân hàng giống tế bào tại Hoa Kỳ)
BHI : Brain-Heart Infusion (Môi trường nước thịt dạng lỏng)
BHIA : Brain-Heart Infusion Agar
(Môi trường nước thịt dạng thạch)
bp : Base pair (Cặp base)
BSA : Bovine serum albumin (Albumin huyết thanh bò)
CDC : Center of Disease Prevention and Control
(Trung tâm ngăn ngừa và kiểm soát dịch bệnh Hoa kỳ)
CPE : Cytopathic effect (Hiện tượng hủy hoại tế bào)
cDNA : Complementary DNA (DNA bổ sung)
ddH
2
O : Deionized distilled water (Nước cất khử ion)
ddNTP : Dideoxy nucleoside triphosphates
DDT : Dichlorodiphenyltrichloroethane
DEPC : Diethyl pyrocarbonate
dNTP : Deoxynucleotide Triphosphate
DNA : Deoxyribonucleic acid
DNase : Deoxyribonuclease
dsDNA : Double-stranded DNA (DNA mạch đôi)
E.coli : Vi khuẩn Escherichia coli
EDTA : Ethylene-Di-amine-Tetra-acetic acid
EIA : Enzyme immuno assay

Quốc gia về thông tin công nghệ sinh học của Hoa kỳ)
NEP : Nuclear export protein (Protein xuất nhân)
ng : Nanogram
nm : Nanometer
NLS : Nuclear located signal (Tín hiệu hướng nhân)
NP : Nucleoprotein
NPV : Negative predictive value (Giá trị tiên đoán âm)
NT : Nghiệm thức
OD : Optical density (Mật độ quang)
OIE : World organisation for animal health
(Tổ chức Thú y Thế giới)
PCR : Polymerase chain reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi)
PFU : Plaque forming unit (Đơn vị hình thành vệt tan)
PPV : Positive predictive value (Giá trị tiên đoán dương)
RBC : Red blood cell (Tế bào hồng cầu)
Real-time PCR : Real – time polymerase chain reaction
rRT-PCR : Real – time reverse – transcription polymerase chain
Reaction
RIDT : Rapid influenza diagnostic test
RIG-I : Rectinoic acid inducible gene - I
RNA : Ribonucleic acid
RNP : Ribonucleoprotein
rpm : Round per minute (Vòng/phút)
RT-PCR : Reverse transcription - polymerase chain reaction
(Phản ứng khuếch đại chuỗi kết hợp phiên mã ngược)
SDS : Sodium dodecyl sulfate
S.O.C : Super optinal broth with catabolic repressor
(Môi trường giàu dinh dưỡng)
ssDNA : Single-stranded DNA (DNA mạch đơ
n)

Bảng 3.3. Tiêu chuẩn cơ sở cho qui trình sản xuất kit xét nghiệm virút cúm đại dịch
A/H1N1-2009 bằng RT-PCR 87

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Bản đồ phân bố số ca mắc và tử vong do cúm đại dịch 2009 4
Hình 1.2. Bản đồ hoạt động của các type (subtype) virút cúm đầu năm 2010 5
Hình 1.3. Biểu đồ số ca tử vong tại các tỉnh phía Nam (Viện Pasteur TP.HCM) 6
Hình 1.4. Cấu trúc hạt virút cúm A 7
Hình 1.5. Chu trình sinh trưởng của virút cúm A trong tế bào chủ 8
Hình 1.6. Mối liên hệ của các chủng virút gây đại dịch từ 1918-2009 10
Hình 1.7. Hình dạng virút cúm A/H1N1 11
Hình 1.8. Nguồn gốc tái t
ổ hợp của virút cúm A đại dịch H1N1/2009 13
Hình 2.1. Loại mẫu xét nghiệm virút cúm A/H1N1-2009 33
Hình 2.2. Minh họa phương pháp HA 36
Hình 2.3. Sơ đồ biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli 40
Hình 2.4. Nguyên tắc máy giải trình tự DNA tự động 45
Hình 3.1. Kết quả so sánh độ tương đồng các gen H, N và M trên NCBI 49
Hình 3.2. Trình tự gen M và gen H1 bảo tồn 50
Hình 3.3: Các mồi được thiết kế để phát hiện virút cúm A/H1N1-2009 51
Hình 3.4. Ki
ểm tra độ đặc hiệu của mồi 52
Hình 3.5. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pTTQ18 vào E. Coli. 53
Hình 3.6. Kết quả phân tích SDS-PAGE Taq polymerase. 54

Hình 3.31. Xác định số bản sao gen H1 bằng phương pháp rRT-PCR 78
Hình 3.32. Giới hạn phát hiện của phương pháp multiplex RT-PCR 79
Hình 3.33. Kết quả 28 trong số 63 mẫu dương tính cúm A/H1N1-2009
xét nghiệm bằng multiplex RT-PCR 80
Hình 3.34. Kết quả nuôi cấy mẫu bệnh phẩm virút cúm A/H1N1-2009 81
Hình 3.35. Kết quả độ lặp lại của phản ứng mRT-PCR 82
Hình 3.36. Kết quả bảo quản RNA virút 83
Hình 3.37. Khảo sát nhiệt độ và thời gian bảo quản hỗn hợp multiplex 85
Hình 3.38. Bộ kit pFLU thành phẩm 88
Hình 3.39. Kết quả kiểm định cơ sở tại Viện Pasteur TP.HCM 89
Hình 3.40. Giấy chứng nhận củ
a Viện Kiểm định Quốc gia 91
Hình 3.41. Triển khai kit pFLU tại TTYTDP An Giang 93
Hình 3.42. Triển khai kit pFLU tại TTYTDP Bạc Liêu 94
Hình 3.43. Triển khai kit pFLU tại TTYTDP Bến Tre 95
Hình 3.44. Triển khai kit pFLU tại TTYTDP Đà Lạt 96
Hình 3.45. Triển khai kit pFLU tại TTYTDP Đồng Nai 97
Hình 3.46. Triển khai kit pFLU tại TTYTDP Đồng Tháp 98
~ 1 ~

LỜI MỞ ĐẦU
Lịch sử đã ghi nhận ba đại dịch cúm vào các năm 1918 (cúm Tây Ban
Nha), 1957 (cúm Châu Á) và 1968 (cúm Hồng Kông). So với các vụ dịch cúm
mùa hàng năm thường xảy ra vào các tháng mùa đông, đại dịch cúm thường
xuất hiện sau vài thập kỷ. Đại dịch cúm Tây Ban Nha 1918 được cho là đã
cướp đi trên 40 triệu người trên thế giới trong vòng chưa đầy một năm.
Cuối tháng ba và đầu tháng 4 năm 2009, vụ dịch cúm A H1N1 đã được
phát hiện đầu tiên ở Mexico và sau
đó lan ra một số nước lân cận. Bệnh cảnh
lâm sàng nhiều trường hợp nhiễm cúm H1N1-2009 khác biệt rõ rệt so với các

hơn một số phương pháp truyền thồng. Nhưng đây là phương pháp đòi hỏi sử
dụng máy móc chuyên dụng đắt tiền, bộ mồi/mẫu dò phải được thay đổi phù
hợp tình hình dịch tễ và kỹ thuật viên có kinh nghiệm. Do đó phương pháp
này khó có thể sử dụng rộng rãi ở tất cả các phòng xét nghiệm, đặc biệt là
phòng xét nghiệm ở vùng sâu vùng xa.
Chính vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài này nhằ
m tạo ra bộ kít chẩn
đoán đồng thời virút cúm A nói chung và virút cúm H1N1 đại dịch 2009, sử
dụng phương pháp phân tử khá đơn giản và yêu cầu thiết bị tương đối rẻ tiền
mà các phòng xét nghiệm có thể trang bị được. Việc tạo ra bộ kít này có thể
giúp các phòng xét nghiệm trong cả nước, kể cả các phòng xét nghiệm vùng
sâu xa phát hiện sớm bệnh nhằm kịp thời định hướng điều trị cũng như
giúp
ngăn ngừa ổ dịch có thể xảy ra trong khu vực.
Mục tiêu đề tài:
1. Nghiên cứu xây dựng qui trình tạo kít chẩn đoán virút cúm đại dịch
A/H1N1-2009 bằng kỹ thuật RT-PCR.
2. Sản xuất bộ kít chẩn đoán dựa trên qui trình vừa được tạo ra ở trên.
~ 3 ~

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình dịch tễ virút cúm đại dịch A/H1N1-2009
1.1.1. Tình hình thế giới
Đại dịch cúm do virút cúm A/H1N1 2009 là đại dịch đầu tiên của thế
kỷ 21 khởi nguồn từ các nước ở khu vực Bắc Mỹ, đầu tiên có thể từ Mexico
[7].

Hình 1.1. Bản đồ phân bố số ca mắc và tử vong do cúm đại dịch 2009
~ 5 ~

Đến ngày 11/6/2009, sau hai tháng kể từ khi phát hiện chủng virút cúm
“mới”, WHO tuyên bố đại dịch cúm đã thực sự nổ ra trên toàn cầu với tốc độ
lây lan từ người sang người, từ quốc gia này sang quốc gia khác và từ vùng
này sang vùng khác một cách nhanh chóng. Tại thời điểm đó gần 30.000
trường hợp dương tính đã được phát hiện ở 74 quốc gia và vùng lãnh thổ,
trong đó có 114 trường hợp tử vong.

đó Việt Nam đã thực sự bước vào cuộc chiến chống đại dịch với chính sách
thắt chặt việc rà soát thân nhiệt, cách ly kiểm tra đối với những người có biểu
hiện thân nhiệt bất th
ường tại các cửa khẩu, sân bay. Ngoài ra những người
từng tiếp xúc với trường hợp dương tính cúm A/H1N1-2009 hay từ các vùng
dịch tễ về cũng được cách ly giám sát.
Hiện tại tình hình lây lan cũng như mối nguy hiểm do virút cúm đại
dịch A/H1N1-2009 gây ra tại Việt Nam có vẻ lắng xuống. Điều này có thể
được lý giải: thứ nhất là do chiến dịch giám sát virút cúm đại dịch A/H1N1-
2009 đã được thay đổi kể từ cuối n
ăm 2009 từ chỗ xét nghiệm đại trà trong
cộng đồng đến việc chỉ giám sát các vùng nguy cơ, phát hiện, kiểm soát và
ngăn chặn tại chỗ (không cần phải xét nghiệm từng cá nhân); thứ hai virút
cúm thường gây dịch theo mùa nhất định, ở vùng ôn đới virút thường gây
dịch vào mùa thu – đông, còn ở các nước nhiệt đới virút thường hoạt động
mạnh vào mùa mưa (WHO), do đó nhiều khả năng virút cúm đại dịch H1N1-
2009 cũng hoạ
t động theo chu kỳ tương tự. 0
1
2
3

Hình 1.3. Biểu đồ số ca tử vong tại các tỉnh phía Nam 3/2010(Viện Pasteur TP.HCM)
~ 7 ~

Theo báo cáo của Bộ Y tế ngày 20/3/2010, Việt Nam đã xác định
11.202 trường hợp dương tính với virút cúm đại dịch H1N1-2009 tại 60/64
tỉnh, thành phố. 15 địa phương ghi nhận có trường hợp tử vong, nâng tổng số
ca tử vong lên 58 người, trong đó phụ nữ mang thai chiếm 23%, trẻ em dưới
10 tuổi chiếm 14,3%.
1.2. Virút cúm đại dịch
1.2.1. Virút cúm A
Virút cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, và được chia thành các thứ
type (subtype) khác nhau dựa trên hai kháng nguyên bề mặt Haemagglutinin
(HA) và Neuraminidase (NA). Hiện tại, có 16 kháng nguyên HA (H1 – H16)
và 9 kháng nguyên NA (N1 – N9)
đã được xác định. Virút cúm A có bộ gene
gồm 8 sợi RNA đơn, mạch âm (-), mỗi loại mã hóa cho một hoặc hai protein
(hình 1.4) [26].

Protein HA có chức năng gắn kết với các thụ thể, và dung hợp virút với
màng tế bào chủ. Sau khi xâm nhập vào tế bào theo cách thực ẩm bào
(endocytose), các hạt virút được bao bởi thể nhân (endosome). Nhờ độ pH


Hình 1.5. Chu trình sinh trưởng của virút cúm A trong tế bào chủ.
~ 9 ~

1.2.2. Các đại dịch cúm trong quá khứ
Virút cúm A đã gây ra nhiều trận dịch trong quá khứ, một vài trận trong
số đó phát triển thành đại dịch. Đại dịch cúm xuất hiện thường là do sự phát
triển của chủng virút mới, xa lạ với hệ miễn dịch ở người. Có hai nguyên
nhân chính: quá trình tái sắp xếp vật liệu di truyền (reassortment) và sự lây
truyền qua nhiều loài khác nhau (interspecies transmission) dẫn đến việc hình
thành chủng virút với các protein bề mặt HA, NA ho
ặc protein bên trong mới,
rồi lưu hành trong cộng đồng người [34].
Đại dịch cúm Tây Ban Nha (Spanish influenza - H1N1). Đại dịch xảy ra
vào năm 1918 – 1919 được xem như một ví dụ điển hình về tính khốc liệt của
virút cúm trong lịch sử, làm thiệt mạng khoảng hơn 50 triệu người trên toàn
thế giới. Đầu tiên, đợt dịch nhẹ vào mùa xuân 1918 được thay thế bởi đợt dịch
thứ hai từ tháng 9 đến tháng 11, tỉ lệ
tử vong của đợt dịch này lớn hơn 2,5%
so với tỉ lệ tử vong thông thường của dịch cúm là nhỏ hơn 0,1%. Đợt dịch thứ
ba với tỉ lệ tử vong tương tự (2,5%) đã lan nhanh trên toàn thế giới năm 1919.
Tuy virút “cúm Tây Ban Nha” đã không được phân lập trong suốt hai
năm gây đại dịch 1918-1919, nhưng trình tự bộ gene của virút này đã được
giải mã và các nhà khoa học cũng phát hiện virút H1N1 này sở hữu mộ
t số
axít amin trên nhiều protein giống với virút cúm người. Virút cúm Tây Ban
Nha không có nhiều axít amin mang tính bazơ tại vị trí phân cắt trên protein
HA (multibasic HA cleavage site) – một trong số các tiêu chuẩn cho tính độc
lực cao của cúm gia cầm [34].
Bằng kỹ thuật di truyền ngược các nhà khoa học đã tái tạo ra “virút cúm Hình 1.6. Mối liên hệ của các chủng virút gây đại dịch từ 1918-2009
Các mũi tên màu vàng chỉ cho một hay nhiều gene được thừa hưởng từ virút cúm của loài
thủy cầm. Mũi tên gạch nối màu nâu cho biết chủng virút không lưu hành trong một thời
gian. Mũi tên màu nâu cho thấy các con đường tiến hóa của virút cúm người; mũi tên màu
xanh chỉ cho các chủng cúm heo (swine); và mũi tên màu từ xanh sang nâu chỉ cho virút
cúm người có nguồn gốc từ heo. Các gene của chủng cúm người 1918, cúm heo H1N1 và
cúm H1N1 1979 đều có nguồn gốc từ virút cúm gia cầm, một số gene khác “được tặng” cho
ch
ủng cúm đại dịch H1N1 2009.
[32]
~ 11 ~

Đại dịch cúm Châu Á (Asian Influenza – H2N2). Virút cúm Châu Á ban
đầu xuất hiện ở phía nam Trung Quốc vào khoảng tháng 2 năm 1957, sau đó
lan đến Singapore (tháng 3/1957), Hong Kong (tháng 4/1957), Nhật Bản
(tháng 5/1957), Hoa Kỳ và Vương Quốc Anh (tháng 10/1957). Chỉ tính riêng
ở Hoa Kỳ, đợt dịch này làm thiệt mạng khoảng 70.000 người. Virút gây đại
dịch “cúm Châu Á” là kết quả của quá trình tái sắp xếp vật liệu di truyền giữa
virút cúm người (human) và gia cầm (avian) dẫn đến việc hình thành chủng
H2N2 tái tổ hợp sở hữu ba gene H2, N2, PB1 của virút gia c
ầm và năm gene
còn lại của chủng virút cúm người [23].
Đại dịch cúm Hong Kong (Hong Kong Influenza – H3N2). Năm 1968,
chủng virút tái tổ hợp H3N2 xuất hiện và gây đại dịch, virút H3N2 này sở hữu
gene H3 và PB1 từ virút cúm gia cầm. Virút H3N2 lần đầu tiên được phân lập
năm 1968 và gây đại dịch vào mùa đông của những năm 1968 – 1970. Tại