BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

ĐỀ TÀI ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC
BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

“NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN NHANH HỘI
CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP (PRRS) TRÊN LỢN” Mã số: 05/2009- ĐTĐL
Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội
Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Thị Lan 8980

Hà Nội- 2011

Hà Nội- 2011
 1
TRƯỜNG ĐH NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

Hà nội, ngày tháng năm 2011 BÁO CÁO THỐNG KÊ
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I. THÔNG TIN CHUNG
1. Tên đề tài:
“Nghiên cứu công nghệ chế tạo Kit chẩn đoán nhanh hội chứng rối
loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) trên lợn”
Mã số đề tài: 05/2009 – ĐTĐL
Thuộc lĩnh vực khoa học và công nghệ: Công nghệ sinh học
2. Chủ nhiệm đề tài
Họ và tên: Nguyễn Thị Lan
Ngày, tháng, năm sinh: 10/05/1974 Nam/Nữ: Nữ
Học hàm, học vị
: Tiến sỹ
Chức danh khoa học: Giảng viên chính
Chức vụ: Phó bộ môn bệnh lý – Khoa Thú y - ĐH Nông nghiệp Hà Nội
Điện thoại:

 3
STT Theo kế hoạch Thực tế đạt được

Thời gian
(Tháng, năm)
Kinh phí
(Tr.đ)
Thời gian
(Tháng, năm)
Kinh phí
(Tr.đ)
Ghi chú
(Số đề
nghị quyết
toán
1 2009 1400 2009 1272 1272
2 2010 1536 2010 1664 1664
3 2011 569 2011 569 569

Tổng 3505

3505 3505
c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi
Đối với đề tài:
Đơn vị tính: triệu đồng
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
Số

 4
Số
TT
Số, thời gian ban
hành văn bản
Tên văn bản Ghi chú
1
Số 1060/QĐ-
BKHCN, Ngày
10/6/2008
Quyết định về việc thành lập Hội
đồng khoa học và công nghệ xét
duyệt thuyết minh đề tài độc lập cấp
nhà nước tuyển chọn bắt đầu thực
hiện trong kế hoạch 2009

2
Số 1412/QĐ-
BKHCN, Ngày
9/7/2008
Quyết định của Bộ trưởng Bộ KH và
CN về việc phê duyệt tổ chức và cá
nhân chủ trì đề tài độc lập cấp nhà
nước năm 2009

3
Số 1989/QĐ-


7
Số 1410/NNH-KH
& QT,05 /12/2009
CÔNG VĂN
V/v Điều chỉnh kinh phí thực hiện
Đề tài năm 2010

8
Số: 1872/BKHCN –
CNN, ngày
02/8/2010
CÔNG VĂN
V/v xin điều chỉnh kinh phí trong
các khoản chi của đề tài độc lập cấp
nhà nước
Mã số 05/2009 - ĐTĐL

 5
9
Số 4314/BGDĐT-
KHCNMT, ngày
22/7 /2010
CÔNG VĂN
V/v Điều chỉnh kinh phí trong các
khoản chi của đề tài độc lập cấp Nhà
nước

10
Số: 720/NNH-

QUYẾT ĐỊNH
V/v phê duyệt Hồ sơ mời thầu gói
thầu: “ KIT và hóa chất phục vụ đề
tài nghiên cứu công nghệ chế tạo
KIT chẩn đoán nhanh PRRS trên
lợn” thuộc Đề tài “Nghiên cứu công
nghệ chế tạo KIT chẩn đoán nhanh
hội chứng rối loạn sinh sản và hô
hấp (PRRS) trên lợn”

14
Số: 511/TTr-NNH
, ngày 20/ 05/ 2010
TỜ TRÌNH
Phê duyệt Kế hoạch đấu thầu và Hồ
sơ mời thầu cho các gói thấu thuộc
Đề tài độc lập cấp nhà nước:

 6
“Nghiên cứu công nghệ chế tạo KIT
chẩn đoán nhanh hội chứng Rối loạn
sinh sản và Hô hấp (PRRS) trên lợn”
năm 2010
15
Số: 2828/QĐ-
BGDĐT
, ngày 12/ 07/ 2010
QUYẾT ĐỊNH
Về việc phê duyệt Kế hoạch đấu
thầu cho gói thầu thuộc Đề tài độc

nông thôn
- Thu thập trao đổi các
thông tin tài liệu về tình
hình dịch bệnh tai xanh
ở Việt Nam
- Giúp thu thập mẫu và
chẩn đoán các mẫu
dương tính.
- Tư vấn và giúp đỡ
một số kỹ thuật và chẩn
đoán nghiên cứu.
- Phân lập virus PRRS.
- Thử nghiệm sản xuất
Kit
- Chẩn
đoán 10
mẫ
u
PRRSV
bằng kỹ
thuật RT-
PCR.
- Phân lập
10 chủng
virus
PRRS

2 Công ty
TNHH một
Công ty

chủ yếu đạt
được
Ghi
chú
1 TS. Nguyễn Thị Lan
TS. Nguyễn Thị
Lan
Chủ trì đề tài, phân
lập, chẩn đoán hóa
miễn dịch, xác định
đặc tính sinh học phân
tử, sản xuất kháng thể,
chế tạo kit, đánh giá
chung.
-Các chủng
virus PRRS
phân lập
được
- Đặc tính
sinh học
virus PRRS
- Kit chẩn
đoán 2
TS. Nguyễn Hữu
Nam
TS. Nguyễn Hữu
Nam

Thu thập mẫu, xác
định đặc tính sinh học
của virus
- Đặc tính
sinh học của
các chủng
virus PRRS
6
TS. Bùi Trần Anh
Đào
TS. Bùi Trần Anh
Đào
Thư ký, thu thập mẫu,
tham gia chẩn đoán
bệnh bằng các kỹ thuật
bệnh lý.
- Kết quả
chẩn đoán
PRRS
7
GVC. Lê Văn Lãnh
GVC. Lê Văn
Lãnh
Phân lập virus, thử
nghiệm kit
- Kết quả
phân lập
 8
virus PRRS
8


2 Trường đại học Chulalongkorn
(Thái Lan)

3 Trường đại học Putra
(Malaysia)

4 Trường đại học Chonbuk,
Chungbuk, Seoul (Hàn Quốc)

5 Trường đại học Tokyo (Nhật
Bản)

6 Công ty Adotech (Nhật Bản)
- Một đoàn ra Nhật Bản 07
người, tháng 7 năm 2010.
Kinh Phí 240 triệu. 7. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị
Số
TT
Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí,
địa điểm)
Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian, kinh phí,
địa điểm)
Ghi
chú

Thu thập mẫu bệnh phẩm
(Trên các vùng dịch, các
giống lợn, tuổi lợn, cơ
quan lấy mẫu bệnh phẩm)
Tháng
1/2009 đến
tháng
5/2010
Tháng 1/2009
đến tháng
5/2010
Bùi Trần Anh Đào
Huỳnh Thị Mỹ Lệ
Nguyễn Thị Lan
Tô Long Thành
Trần Xuân Hạnh
Cục thú y, Công ty
Navetco
ĐHNN- HN
2
Phân lập virus PRRS trên
môi trường tế bào
4/2009 đến
7/2010
4/2009 đến
7/2010
Nguyễn Thị Lan
Nguyễn Bá Hiên
ĐHNN- HN
3

8/2010
5/2010 đến
8/2010
Lê Huỳnh Thanh
Phương
Nguyễn Thị La
ĐHNN- HN
6
Nghiên cứu quy trình sản
xuất kháng thể đặc hiệu (cả
kháng thể đơn dòng và
5/2010 đến
10/2010
5/2010 đến
10/2010
Tô Long Thành
Nguyễn Thị Lan
Nguyễn Bá Hiên
 10
kháng thể đa dòng) Nguyễn Hữu Nam
ĐHNN- HN
Cục Thú y
7
Chế tạo KIT chẩn đoán
nhanh hội chứng PRRS
11/2010
đến 4/2011
11/2010 đến
4/2011
Nguyễn Hữu Nam

Công ty Navetco
10
Thử nghiệm đánh giá đại
trà trong sản xuất.
8/2011 đến
10/2011
8/2011 đến
10/2011
Phạm Văn Tự
Nguyễn Bá Hiên
Nguyễn Hữu Nam
Trần Văn Hạnh
ĐHNN- HN
Cục thú y
Công ty Navetco
11
Nghiên cứu các yêu cầu
của sản phẩm để có thể đủ
điều kiện thương mại hóa.
11/2011 11/2011
Nguyễn Thị Lan
Nguyễn Hữu Nam
ĐHNN- HN

 11
III. SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN
1. Sản phẩm KH & CN đã tạo ra:
a) Sản phẩm Dạng I:
STT
Tên sản phẩm và

tin chính xác
và tin cậy
- xây dựng
được đường
biểu diễn sự
nhân lên 10
chủng virus
- Đăng ký 6
đoạn gen trên
ngân hàng gen

2 Quy trình công nghệ
chế tạo kit
Tạo kit có độ
nhạy và độ đặc
hiệu cao có thể
chuyển giao
vào sản xuất
kinh doanh
- Tạo Kit có độ
nhạy và độ đặc
hiệu trên 90%.
- Nghiên cứu
đặc các điều
kiện để thương
mại hóa
Được cấp có
thẩm quyền
đánh giá và
nghiệm thu.

STT Cấp đào tạo, chuyên
ngành đào tạo
Theo kế hoạch Thực tế đạt
được
Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)
1 Bác sỹ thú y, chuyên
ngành thú y
02 04 2009 và 2010
2 Tham gia đào tạo
Thạc sỹ, chuyên
ngành thú y hoặc vi
sinh vật
1 02 2010 và 2011
3 Tham gia đào tạo
Tiến sỹ, chuyên
ngành thú y hoặc vi
sinh vật
1 01 2011
đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với
giống cây trồng:
 13

Kết quả
STT Tên sản phẩm đăng
ký
Theo kế hoạch Thực tế đạt
được
Ghi chú

tốt
4 Quy trình sản xuất
kháng thể đơn dòng
2010 Khoa Thú y, Trường
ĐH Nông nghiệp Hà
Nội
tốt
2. Đánh giá về kết quả do đề tài, dự án mang lại
a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:
(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với
trình độ công nghệ so với khu vực và thế giới…).
Yêu cầu phát triển của ngành chăn nuôi đòi hỏi ngành thú y phải đi trước
một bước để có thể sẵn sàng đáp ứng với tình hình dịch bệnh mới phát sinh hoặc
các b
ệnh nhập ngoại. Việc tạo ra đội ngũ cán bộ có khả năng ứng dụng, triển
khai khoa học công nghệ mới là điều cần thiết. Đề tài đã góp phần bồi dưỡng
một đội ngũ cán bộ và chuyên gia lành nghề.
b) Hiệu quả kinh tế xã hội:
 14
(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so
với các sản phẩm cùng loại trên thị trường…).
Thành công của việc chế tạo Kit chẩn đoán nhanh PRRS có ý nghĩa thực
tiễn vô cùng to lớn trong việc phát hiện sớm tiến tới ngăn ngừa và khống chế
dịch bệnh trong điều kiện diễn biến phức tạp. Phương pháp phát hiện nhanh cho
phép khoanh vùng dịch bệ
nh và có biện pháp xử lý kịp thời hạn chế lây lan và
thiệt hại.
3. Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:
Số
TT

2.3. Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý 11
2.4. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch 13
2.5. Phương pháp tách chiết RNA 16
2.6. Phương pháp tiến hành phản ứng RT – PCR 16
2.7. Phương pháp nuôi cấy tế bào 18
2.8. Phươ
ng pháp phân lập virus PRRS trên tế bào tổ chức 19
2.9. Phương pháp xác định TCID
50
20
2.10. Phương pháp xác định hiệu giá virus 21
2.11. Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus 21
2.12. Phương pháp giải trình tự gen 21
2.13. Phương pháp xử lý số liệu 23
2.14. Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus và định lượng protein. 23
2.15. Phương pháp chế tạo kháng thể đa dòng 24
2.16. Phương pháp ELISA 25
2.17. Phương pháp tinh chế kháng thể 26
2.18. Phương pháp chế tạo kháng thể đơ
n dòng 28
2.19. Phương pháp chế tạo KIT 29
2.20. Phương pháp đánh giá chất lượng KIT 35
Phần III. KẾT QUẢ 39
1. Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm 39
2. Phân lập virus PRRS 58

ii
3. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng virus PRRS phân lập được62
3.1. Khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE-Cytopathogenic effect) của virus PRRS 62
3.2. Xác định hiệu giá của các chủng virus phân lập được 66

8.3. Nghiên cứu đánh giá độ đặc hiệu của KIT 121
8.4. Đánh giá giới hạn chẩn đoán của KIT 122
8.5. Nghiên cứu khả năng phát hiện chéo một số virus gây bệnh cho lợn 123
9. Thử nghiệm đánh giá KIT chẩn đoán nhanh PRRS trên diện hẹp 124
9.1. Lựa chọn địa điểm thử nghiệm KIT và thử nghiệm KIT 124
9.2. Kết quả so sánh với các phương pháp chẩn đoán khác 125
10. Thử nghiệm đánh giá KIT chẩn đoán nhanh PRRS đại trà trong sản xuất 127
10.1. Lựa chọn địa điểm thử nghiệm KIT 127
10.2. Kết quả thử nghiệm 128
10.3. Kết quả so sánh với các phương pháp chẩn đoán khác 129
11. Nghiên cứu các yêu cầu của sản phẩm để có thể đủ điều kiện thương mại hoá 130
11.1. Chất lượng của KIT chẩn đoán 131
11.2. Giá thành của KIT 132
11.3. Tiện dụng trong sử
dụng và bảo quản, mẫu mã sản phẩm 134
11.4. Chiến lược Marketing tốt 134
Phần IV. KẾT LUẬN 136
Phần V. TÀI LIỆU THAM KHẢO 138
5.1. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 138
5.2. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 142 iv
DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Mẫu lợn nghi mắc PRRS thu thập được 39
Bảng 3.2. Bệnh tích đại thể của các lợn nghi mắc PRRS 43
Bảng 3.3. Số lượng các mẫu bệnh phẩm, block và slide dùng trong nghiên cứu . 47
Bảng 3.4. Một số biến đổi vi thể của các lợn nghi mắc PRRS 50
Bảng 3.5. Kết quả phản ứng RT-PCR chẩn đoán PRRS 53

Bảng 3.25. Kết quả phản ứng ELISA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng
PRRSV 95
Bảng 3.26. Khả nă
ng phản ứng chéo của các chủng virus PRRS và kháng thể
đa dòng sản xuất ra 96
Bảng 3.27. Kết quả phản ứng ELISA đánh giá hiệu giá hỗn hợp kháng thể đa dòng .96
Bảng 3.28. Bố trí thí nghiệm tiêm chuột 97
Bảng 3.29a. Kết quả lai tế bào Myeloma với tế bào Lympho từ lách chuột
được gây miễn dịch với virus PRRS 227HY 99
Bảng 3.29b. Kết quả lai tế bào Myeloma với tế bào Lympho từ lách chuột
được gây mi
ễn dịch với virus PRRS 182NA 100
Bảng 3.29c. Kết quả lai tế bào Myeloma với tế bào Lympho từ lách chuột
được gây miễn dịch với virus PRRS 374HN 101
Bảng 3.29d. Kết quả lai tế bào Myeloma với tế bào Lympho từ lách chuột
được gây miễn dịch với virus PRRS CL2 102
Bảng 3.29e. Kết quả lai tế bào Myeloma với tế bào Lympho từ lách chuột được
gây miễn dịch với virus PRRS Amervac 103
Bảng 3.29f. Kết quả lai tế bào Myeloma với tế bào Lympho từ lách chuột
được gây mi
ễn dịch với virus PRRS MLV 104
Bảng 3.30. Kết quả tách dòng bằng phương pháp pha loãng kháng thể kháng PRRSV106
Bảng 3.31. Kết quả xác định nồng độ kháng thể đơn dòng sản xuất ra 107
Bảng 3.32. Kết quả phản ứng ELISA kiểm tra khả năng kết hợp kháng thể đơn
dòng với kháng nguyên virus PRRS 109
Bảng 3.33. Nồng độ Sodium Citrate ảnh hưởng đến kích cỡ gold particle 110

vi
Bảng 3.34. Giá trị OD tương ứng với độ pH 111
Bảng 3.35. Xác định nồng độ protein phù hợp cho việc chế tạo conjugate .112

CPE
Cytophathogenic Effect
DAB 3,3-diaminobenzidine
DMEM
Dulbecco's Modified Eagle's Medium
DNA Deoxyribonucleic acid
ĐTB Đại thực bào
EDTA
Ethylenediaminetetraacetic acid
ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
FBS
Fetal Bovine Serum
HE Haematoxilin – Eosin
IHC
Immuno Histochemistry
KN-KT Kháng nguyên - Kháng thể
KTĐD Kháng thể đa dòng
LV Lelystad Virus
MLV Modifier Life Vacine
MOI
Multiplicity Of Infection
NC
Nitrocellulose Membrane
OD Optical Density
ORF Open Reading Frame
PBS Photphat Buffer Saline
PCR Polymerase Chain Reaction
PRRS
Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome
PRRSs Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Strain

đây, bệnh lây lan khắp các nước trên toàn thế giới.
Ở Trung Quốc, trong vòng hơn 3 tháng của năm 2006, chủng virus gây
hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấ
p ở lợn có độc lực cao đã gây ra đại dịch
ở 10 tỉnh phía Nam, làm cho hơn hai triệu lợn ốm, trong đó chết khoảng
400.000 con. Tháng 7 năm 2007, dịch tiếp tục lan rộng ở các đàn lợn thuộc 25
tỉnh, thành phố với trên 180.000 lợn ốm; chết trên 45.000 con [51].
Tại Việt Nam, năm 1997, kiểm tra huyết thanh học cho biết 10/51 lợn
giống nhập từ Mỹ có huyết thanh dương tính với virus gây Hội chứng r
ối loạn
sinh sản và hô hấp (PRRSV) [3]. Tuy nhiên, sự bùng phát thành dịch và gây
tổn thất đáng báo động cho ngành chăn nuôi lợn bắt đầu vào tháng 3 năm
2007 [6]. Sau đó dịch lây lan nhanh và rộng khắp các tỉnh miền Bắc. Ngày
nay hội chứng PRRS đã lan ra khắp thế giới gây thiệt hại kinh tế cho ngành
công nghiệp chăn nuôi lợn [62].

2
Mục tiêu:
- Nghiên cứu được công nghệ chế tạo KIT chẩn đoán nhanh PRRS ở lợn.
- Tạo được sản phẩm có đủ điều kiện để thương mại hóa.
Đối tượng:
Lợn nghi mắc PRRS nuôi ở Việt Nam.
Các chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở Việt Nam.
Tính cấp thiết:
Genome của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRSV)
là một sợ
i đơn RNA và virus là thành viên của họ Arteriviridae thuộc lớp
Nidovirales [50]. Dựa trên phân tích về phát sinh loài virus phân lập khác
nhau trên thế giới [63] PRRSV có thể được phân biệt thành hai kiểu gen: loại
I, European genotype gồm virus thuộc dòng Châu Âu, đại diện là chủng